原 著 f東 女 医 大 誌 第55巻 第6号l L頁 501-~507 昭和60年6月J
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マウス腸管内で好気化した
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の
嫌気性菌への復帰と
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の作用
東京女子医科大学 徴生物学教室(主任:吉岡守正教授〉 北 里 研 究 所 細 菌 室 ハラ ヂチ ヨシ コ原 口 恰 子
(受付 昭和60年3月7日〉The Effect of Progesterone on the Reversion of a Facultative Anaerobic Type Bifidobαcterium to an Anaerobic type
in Gnotobiotic Mouse Intestines Yoshiko HARAGUCHI Department of Microbiology (Director: Prof.Morimasa YOSHIOKA) Tokyo Women's Medical College， and Department of Microbiology， The Kitasato Institute The strictly anaerobic Bifidobacterium has been successfully transformed to facu1tative anaerobes under a certain condition. The mutants showed a coccoid form
，
and their biochemical as well as serological characteristics have been also changed. The facu1tative anaerobic mutants were partially reverted to the original type in intestines of female ICR mice that were pre-mono-contaminated with the mutants，
injected with progesterone，
and made pseudopregnant. Mice thus treated were confirmed to have corpus luteum either in heterogenous multiple generations or in a homogenous single generation in ovary.I
t
is known that the secretion of呂ctiveprogesterone from single generation cells is delayed ascompared to that from mu1tiple generation cells. The peak of reversion to the strictly anaerobic type was seen 5 days after the progesterone treatment in mice possessing multiple-generation cells， while that was day 7 in mice having single-generation cells. The appearance of the revertants was paralleled with the secretion of the active progesterone， and decreased when prostaglandin F 2a， an inhibitor of the secretion
of progesterone， was injected after mating.
I
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was concluded from the data that progesterone would play a role for the reversion of the facu1tative anaerobic mutant to the strictly anerobic forms， which retained coccoid or coccobacillary morphologies of the facultative anaerobes and not regained rod shape of the wild typeB.bifidum cells. 緒 言 偏 性 嫌 気 性 梓 菌Bが
dobacteriumは こ れ ま で Bergey's manual分類上Lactobacillus属 (5th，6 th edition)に属したり Actinomyces属やBacillus 属であるという説もあった.しかし8theditionで はFamilyActinomycetacae， Genus Bijidobacte -rzumとして独立した.このことは菌に多様性が あり種々の属と共通性状を持っているためであ 501 り，また形態の変化も考慮しなければならない. 過去にも形態変化に関する論争はあったが，偏性 嫌気性菌の培養方法と分離方法の確立と共に減少 した われわれは先にBifidobacteriumからphageを 得るためにadaptationにより徐々に好気化しよ うと試み，その結果得られた株1)が通性嫌気性菌 であり生物学的性状・血清学的性状は連鎖球菌と近似していることを報告した.本研究はこの大き く変異した菌を偏性嫌気性揮菌へ復帰させること を目的とした.また著者は先の実験において，好 気化株を
monocontaminate
させた雌マウスにお いて黄体が形成され，p
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の分泌があっ た後の腸管から偏性嫌気性球菌が分離できること を確認したz)叫 .p
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はp
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の作用によって黄体 から分泌されるもの酬と胎盤性のものとがある. 本実験は，偽妊娠5-7
日後のp
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分泌期 に行なった.また黄体には初回e
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で生 成される，あるいは人為的な連続発情後に誘起さ れる単一世代と，回帰しているe
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を持 つ複数世代の2種の世代がある.偽妊婦させて得 た単一，又は複数の 2種の世代の黄体は，機能p
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を分泌する時期が異っている.本研 究は，好気化した通性嫌気性株の偏性嫌気性株へ の復帰を起す時期の違いと 2種の世代の黄体のp
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産生の関係，更にp
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産 生阻害が偏性嫌気性菌へのr
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に及ぼす影 響等について検討し，p
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と菌の変異， 更 に はnormalf
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形成の関係を解明すること を目的としている. 材 料 使 用 菌 株 :FM
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はB併d
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より分与〉をBL
寒天培地 上で4
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時間嫌気培養後，単集落をr
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無添 加t
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培地にうえ増殖後10-3mg/
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培地，0
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へと順次継代した時L
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継代中に非 常に良く生育した株である. 投与菌:FM91
をBL
寒天培地(牛肉エキス3
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上で、37'C48時間嫌気培養，単集落をL
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~こ接種，好気条件下で 37'C 一一夜培養して 得 た 培 養 菌 を 洗 浄 後1-9
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3/ml
L.broth~.こ再 浮遊，通性嫌気性であることを確認した後使用し た 使用動物:日本クレア由来ICR
無 菌 マ ウ ス を 常法通り飼育した.光制御は行なっていない. 方 法 マウスへの菌投与:成熟マウスの場合 6週齢 の雌マウスに投与菌0
.
2
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をゾンデで胃内接種， 週2回嫌気性菌の有無を検便し，検出されないこ とを確認して実験に供した.若年マウスの場合， 生後3-5
日以内に経口投与，週2回雄仔マウス の腸管及び内容物を培養し嫌気性菌のないことを 確認3
週齢からは雌マウスの検便も行ない，2
8
日齢に達したのち下記の実験に供した. ホ ル モ ン 処 置 実 験 :g
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投 与 の 場 合p
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CPMSG)
(三共臓器)2
国際単位CIU)/mouse
を雌マウスに 腹 腔 注 射 ，4
8
時 間 後 にhuman chorionic
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(HCG)
(三共臓器)2IU/mouse
を 同様に腹腔注射し， これを1
シリーズとした.成 熟マウスの場合はこれら2
種のg
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シ リーズを1
日の間隔をおいて2
回くり返した.若 年未成熟マウスの場合はPMSG
投与の時点で未 開口の腫口がHCG
注射で閉口し，初回e
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で次の実験に入るようにした.実験1
と2
ではg
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投与後，下記の方法で偽妊娠 処置を行い， 4 -8日後に腸管培養に供した.こ の時腔脂膏像がd
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期にあることを確認し た.実験3
はこの方法に準じて行なった. P実験1:
HCG
最終注射の翌午前7
時に成熟マ ウス，若年マウス共1.8mg/mouse
のp
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(帝国臓器〉をl回のみ皮下注射した. 実 験2:
HCG
注 射 の 翌7-8
時 に 成 熟 マ ウ ス，若年マウス共0.4mg/mouse
のp
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を毎朝，腸管培養日まで皮下注射した. 実験3 :
HCG
最終注射の翌日午前から成熟マ ウス，若年マウス共にg
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(オルガノン社〉0.3mg/mouse
を毎日経口投与した.prostaglandin F2ll'注射実験:無処置の雌雄マ ウスを同居交配させ，交配した翌朝から別ケージ に 移 し ， 雌 マ ウ ス にO.lmg/ mouse/ dayのpros -taglandin
F
2ll'(PGF
2ll') (科研製薬〉を連日5
日 皮下注射した. 腸管培養:偽妊娠処置5日後と7日後のマウス 腸管培養は必ず対で行ない 1日に使用するマウ ス数は各群3
匹以内とした.その理由は投与菌は 単集落を培養したものであるが集落差を防ぐた め，多くの集落で実験する必要があるためである. 1回の実験で使用するマウスは6匹前後とした. 嫌気性菌の分離:マウスの消化管を胃・小腸上 部・中部・下部・回言部・車腸部に分けホモジナ イズし，これをBL
寒天平板培地と brain heart infusion(BHI)(Difco)血液寒天培地に2枚ず、つ 塗布し，一方を好気，他方は嫌気培養した.replica platingし嫌気培養のみで発育する株を5代以上 継代培養して，その性状を維持しているものを偏 性嫌気性菌とした. 結 果 以下，部分的なrevertantで通性嫌気性から偏 性嫌気性へ戻ったものを嫌気化株と呼ぶ. 実験1
の結果をTable1
に示す.投与日を第1
日目とし， progesteroneを第1
日目に1
回だけ大 量に接種した.成熟マウスでは第5日目，若年マ No.iof mice1
0
ウスでは第7日自に嫌気化株が最も高頻度で得ら れた.実験2における progesterone投与回数と嫌 気化株出現の関係をTable2に示す.成熟マウス では投与5回目に，若年マウスでは7回目接種の 場合に最も多く嫌気化株が出現した.成熟マウス の場合は実験1
において progesterone投与第5
Table 1 Facultative anaerobic revertants obtained after the injection of1.8mg/mouse progesterone Adult mice Young mice Days after Number of pDr1oa吋gyeesscttae1f0rto日enr e Number of pr1ongJ esterone mice harbored mice harbored ection anaerobes anaerobes 4 1/2 5 2/12 5 7/10 6 1/3 6。
/3 7 6/11 7 1/10 8 2/3 Table 2 Facultative anaerobic revertants obtained after the injection of O.4mg/mouse progesterone Adult mice Young mice Number of Number of Number of Number of priongjeesctteioron ne miacne haerarobboersed priongjeesctteioron ne miacnea heraorbbeorsed 4 times。
/2 4times。
/2 5 times 5/10 5times。
/10 6 times。
/6 6times 2/3 7 times 2/10 7times 7/11 Schedule of injectionAdult mice (5days after progesterone
5
5 7 days
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~--"'--I
_ _ injection)
Young mice
(
7
days after progesteroneinjection)
ム 企 !
Symbols 箆 畑 山 mouse harbored anaerobes
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Young mouse harbored anaerobesE
コ
Totai number of mice'" PMSG injection -'---'-1 day
企 HCG injection
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Sacrifice!
Proges terone i njecti on Fig. 1 Facultative anaerobic revertants obtained after the injection of 1. 8mg/mouse progesterone
-503-Schedule of inj巴ctions
NoJ of mice
1
0
Adult mice (progesterone injection 5 times)瓦 企 ム 企
AA
111-5 Young mic巴 (progesterone injection
7
times)ム 企
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A-Symbols
竪
/-¥d山 mouse harbored anaerob巴SD.PMSG 巾 ction -'-ー1day lllIIJYoung mouse harbored anaerobes4.HCG injectionE
コ
Total number of mic巴 圃Sacrific巴 AProgesterone injectionFig. 2 Facultative anaerobic revertants obtained after the injection of 0.4mg/ mouse/day progesterone 日後と第7日後の嫌気化株出現頻度の差は統計学 的 にFischerの直接確率計算法により有意 (p<
0
.
0
1)であり，若年マウスの場合は実験2
におい て投与5回目と 7回目の嫌気化株の出現率に有意 差 (p<O.01)が認められた. Fig.1は 実 験 1の， Fig.2は 実 験2のプロト コール及び結果を，特にprogesterone投与開始5
日後と 7日後の成績を要約したものである.いず れの実験成績でも成熟マウスは5
日後(5
回目〉 に，若年マウスは7日後c7田目〉に嫌気化株の 出現率が高く2
種の実験結果は類似のパターン を示している.実験3ではgestanonを使用した. gestanonは胎盤に作用して progesteroneを分泌 させるといわれるが，この実験では1
0
例中いずれ からも嫌気化株は得られなかった，PGF
2α投与実 験では交配させた雌マウスに連日5
日投与したと ころ，腸管培養により嫌気化株が得られたのは1
0
例 中l
例であった.一方PGF
2α未処置対照群で は1
0
例中7
例に検出された(Table3
)
， Table4
は 原 株B
.
bifidum，好気化株FM91とその嫌気化株J
461，J
471の生物学的性状を示したものである. F M 91とJ
461は連鎖球菌であるが， BHI血液寒 天培地上好気培養で生育できるのはFM91のみ である ，B
.
bijidumの発酵生成物は乳酸と酢酸で あるが，J
461，J
471， FM 91の生成物は乳酸のみ Table3 Facultative anaerobic revertants obtained in mated mice and mice treat巴dwith PGF2αafter mating Mice Mated Mated and injected withPGF2a である. N umber of mice harbored anaerobes 7/10 1/10 考 察 Bijidobacteriumは1899年Tisser7)が 分 離 し た 当初から本来の菌と異った菌が生ずるという報 告別があった， Weiss9 )ら はLactobacillus bijidus は鎖形成の傾向があると指摘し， Norris10)らも短 鎖の存在を認めた， Eggerthll)i主培養中に頼粒状 になり不規則球菌と鎖形成を観察している， Nor-risはしばしば柵状の coccobacillaryformを 示 したと記載している.しかしNorrismedium10)， その他の培地の改良と嫌気培養法の確立と共に， こ の よ う な 報 告 は 減 少 し た . と こ ろ が1975年 Bauer12)らはB. bijidumよ り 通 性 嫌 気 性 の mutantを採取し，走査型電顕写真によって agar 上で柵状の集落をなし，個々の菌はcoccobacilli formであることを示した.一方液体培地での発 育のものにcoccoidformも認めている.本実験 -504Table 4 Biological properties of variant strains
B.bz5〉f6d7uF?za) J 471b) J 461<) FM 91d )
Gram stain
+
+
十+
Shape rod coccobacilli COCC1 COCC1 Aerobic culture α.hemolytic on blood agar Gas production Catalase gLeiqlauteifnaction of ¥ Nitrate reduction Aldolase activity
+
+
+十 Spore formation Mpraojdour ctfes rmentatlon L.A L L L a) B. bifidumニoriginalstrain b)J 471=anaerobic revertant from mice which pre.dicontaminated W1出FM91 and E. coli c)J 461=anaerobic revertant from mice which pre.monocontaminated with FM 91 d) FM 91=converted facultative anaerobic type Symbols: L=lactic acid A二aceticacid で使用したcoccoidcellsも好気条件下，液体培養 で得たもので似た形態を示している.B
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~.こは成人に定着する種，乳幼児 に定着する種， どちらにも定着する種がある.偏 性嫌気性菌である本菌が新生児に感染する経路と しては母親からの垂直感染が自然であるが，乳幼 児に定着する種は成人に定着しない.しかし出産 前後に，母体内の自oraが内分泌環境の変化の影 響を受け，変異する可能性があると考え，そこで 我々はprogesteroneの影響を検討する目的で今 回の研究を行った. 先にわれわれは嫌気化株が確率よく採れる腸管 培養日が成熟マウスと若年マウスの聞に差がある ことを報告した捌.そこで腸管培養日が自然交配 マウスでは4日目に最も多く嫌気化株が得られた ことと同，村上川らの「連続発情ラットに誘起した 偽妊娠期における progesteroneの血中濃度の推 移」からピークが5-7
日にあることに注目して， 今回の偽妊娠実験を行なった. 村上ら∞が実験生殖生理学的立場から光制御に より連続発情させて交尾刺激を加えなかったマウ スに，大量のprogesteroneを1
回投与すると偽妊 娠を誘起できることを見出しているので同手法を 使用して偽妊娠を起きせ，嫌気化菌の出現を検べ たのが実験1
であり，林ら16)17)，館ら18)が妊娠初期 の匹の着床の場である子宮内膜の形態変化を観察 するために使った実験形態学的手法を部分的に使 用し，着床周辺期の嫌気化株の出現を検べたのが 実験2
である.高橋ら19)則は偽妊娠黄体に関する 実験で，連続発情を示したラットに交尾刺激を加 え偽妊娠を誘起して得た単一世代黄体をもった偽 妊娠ラット，複数世代黄体をもった通常偽妊娠 ラ ッ ト の 黄 体 細 胞 を 使 っ て 黄 体 刺 激 ホ ル モ ン (LTH)に対する反応性をしらベ，黄体形成一週間 後の黄体は完全なprogesterone合成系が備って いるが，形成初期には旧黄体又は非黄体卵巣細胞 か ら あ る 穫 の 物 賀 が 供 給 さ れ な い 限 り ， 機 能 progesteroneの産生は行なえないと結論してい る.ラットの偽挺娠期は約12日とされており，彼 らは初期相を第4日に，中期相を第8日目，後期 相を第12日目に採って実験し，初期相の黄体は progesteroneを 分 泌 し て い る がLTHに対する 反応性は単一世代にはなく，複数世代は高いとし ている.第8臼自の中期相になると単一世代は十 分な反応性を示すことをi
nv
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で証明した.マ ウスの偽妊娠期は12-14
日で，その生理作用は505-ラットと類似するといわれている.著者の使用し た成熟マウスはgonadotropin処置を2度行ない 回帰している黄体の複数世代黄体を持ち，若年マ ウ ス はgonadotropin処 置 を 1度 行 な い 初 回 estrous cy
c
1
eで偽妊娠させ単一世代黄体を持っ ていると考えられる.その実験結果は成熟マウス は第5
日目，若年マウスは第7
日目に多くの嫌気 化株が得られ，高橋らの黄体機能の実験とほぼ一 致する. 実験3で使用したgestanon21 )は胎盤に作用し てprogesteroneを分泌させるといわれており，着 床後に効果がある.しかし排卵後投与しても，胎 盤形成のないところではその分泌はなく，した がってgestanonによる嫌気化株の出現がなかっ たのはprogesterone分泌がおこらなかったと考 えれば，理解できる.PGF
2αは黄体機能調節因子を消退させる作用 をもち，質的変化を起させるといわれている22)23) 即ちprogesterone生成阻止作用がある.交配し progesteroneの分泌がある状態にしても，PGF
2α を投与すれば機能性のある progesteroneの分泌 は減るはずであり，したがってもし嫌気化株の出 現にprogesteroneが大きくかかわっているなら ば，出現しないはずである.対照の交配後無処置5
日のマウスからは1
0
例中7
例の嫌気化株が得ら れた.一方PGF2a処置のマウスからは腸管培養 初代では偏性嫌気性であった株も存在したが 5 代の確認培養の聞にほとんど通性嫌気性に戻りこ の仮定を肯定する結果となった. 以上の如く通性嫌気性球菌を偏性嫌気性菌に変 える因子としてprogesteroneは大きな働きをし て い る と 思 わ れ ， 先 の 大 腸 菌 を 追 加 投 与 し て dicontaminationしたマウスを交配して得た偏性 嫌気性球梓菌24)のことも考え合せると，妊娠によ り腸管floraに変化の起こりうることを示唆して いると思われる. 尚，B
.
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は形態学的に梓菌， dicontami. nationで 得 た 嫌 気 化 株J
471は球梓菌， monocontaminationで 得 た 嫌 気 化 株J
461は球 菌，好気化株FM91
は球菌で原株の梓菌には戻っ ていないが，嫌気化2
株は偏性嫌気化され部分的 なreverseを示した.これらの形態学的性状，生物 学的性状，血清学的性状の比較については本誌(
5
3
巻，頁9
5
5
-
1
0
0
1
，昭5
8
)
に記した. 総 括 偏性嫌気性梓菌B
折d
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はある条件下 で培養すると，通性嫌気性球菌に変化する.この 菌を再びもとの菌に戻すベく実験を行ない，偏性 嫌気性球菌とL、う生物学的性状では原株の偏性嫌 気性に戻り，形態学的にはmutantの球菌のまま であるという部分的なrevertantを得た.これは 通性嫌気性株をmonocontaminationさせた雌マ ウスにprogesteroneを注射後偽妊娠させて腸管 内に出現させたものであるが，形成された黄体は 回帰している複数世代黄体か，黄体がない状態か ら形成された単一世代黄体カ這いずれかである. こ の2
世代聞には機能時期に差があり，単一世代黄 体の方が遅れて作用する.偏性嫌気性株は複数世 代黄体を持つマウスではprogesteroneを注射し た5
日後に，単一世代黄体を持つマウスでは7
臼 後に多く分離された.即ち黄体細胞の機能時期と 一致して偏性嫌気性菌が分離された. 又， progesteroneの分泌により嫌気化できると すれば， progesteroneの生成を阻止すると嫌気化 も 阻 止 さ れ る は ず で あ る . 交 配 し た マ ウ ス にPGF
2αを投与した結果，嫌気化株を分離し得た例 は少なかった.以上の結果からも progesteroneは 偏性嫌気性菌の発現に，大きな関与をしていると 考えられる. 謝辞:この稿を終るにあたり，ご指導下さいました 微生物学教室吉岡守正教授，須子田キヨ教授，北里大 学衛生学部合田朗教授に深謝します. 文 献 1)Tateishi， M.， Haraguchi， Y.， Nakase， Y. and Ghoda，
A.: Changes of biological and ser. ological characters accompanied with mor. phological changes inBifidobacterium.Kitasato Arch Exp Med 56 9-16 (1983) 2)Haraguchi，
Y. and Ghoda，
A.: Restoration of Anaerobic Character in Germfree Mice of the Facultativ巴 Anaerobe Mutant of Bifidobacterium(1).Kitasato Arch Exp Med 57 23-28 (1984)3) Haraguchi
，
Y.: Restoration of Anaerobic Character of the Facultative Anaerobe lvlutant of Bifidobacteri・Umin Germfree Mice which have a Single Generation of Corpus Luteum. Kitasato Arch Exp Med 5735~37 (1984) 4)原 口 恰 子 : 無 菌 マ ウ ス 腸 管 内 で の 好 気 化 し たBifidobacteriumの嫌気性菌への復帰
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