フィターセ高生産植物を家畜用飼料に添加する場合の効果と数値目標 2. 序論太陽エネルギー有効利用による物質生産フィターセ高生産植物 ( 作物収穫後に廃棄される部分 ) リン鉱石リン資源の節減環境富栄養化の抑制 * フィターゼ 1U : 37 p5.5 において 1 分間にフィチン酸から 1μ

(1)

－植物機能改変技術実用化開発－

タンパク質組織特異的高生産植物の研究開発

－三井化学株式会社－

平成１６年１０月２８日

第１回「植物機能改変技術実用化開発」第１回「植物機能改変技術実用化開発」第１回「植物機能改変技術実用化開発」第１回「植物機能改変技術実用化開発」（中間評価）分科会（中間評価）分科会（中間評価）分科会（中間評価）分科会資料資料資料資料6666----6666

公開

Mitsui Chemicals, Inc., 1 Mitsui Chemicals, Inc., 1Mitsui Chemicals, Inc., 1 Mitsui Chemicals, Inc., 1

目的

H H H H H H O H H O H O H O H H H H O H H H O H フィチン酸　　　　　　　　　イノシトールﾌｨﾀｰｾﾞﾌｨﾀｰｾﾞﾌｨﾀｰｾﾞﾌｨﾀｰｾﾞ：フィチン酸を加水分解し、リン酸を遊離させる酵素６リン酸 H₂PO₃O OPO₃H₂ OPO₃H₂ OPO₃H₂ OPO₃H₂ OPO₃H₂ 6 H₃PO₄

フィチン酸分解酵素

：

フィターゼ

単胃家畜単胃家畜用単胃家畜単胃家畜用用用飼料添加剤飼料添加剤飼料添加剤飼料添加剤として利用として利用として利用として利用

目的

省ｴﾈﾙｷﾞｰ・低環境負荷型の物質生産形態である分子農業（植物工場）

_{に基づき、これまで有効利用されずに廃棄される植物組織に工業用酵素}

（

（（

（

ﾌｨﾀｰｾﾞ

）を安定的に蓄積する技術を確立する。

Mitsui Chemicals, Inc., 2 Mitsui Chemicals, Inc., 2 Mitsui Chemicals, Inc., 2 Mitsui Chemicals, Inc., 2

1. 1. 1. 1.目的目的目的目的

(2)

ﾌｨﾀｰｾﾞ高生産植物を家畜用飼料に添加する場合の効果と数値目標

リン排出減少リン排出減少 P P P P P PP P phytin phytin phytin phytin----PPPP ﾌｨﾀｰｾﾞﾌｨﾀｰｾﾞﾌｨﾀｰｾﾞﾌｨﾀｰｾﾞ＊＊＊＊_{フィターゼ}_{フィターゼ 1}_{フィターゼ}_{フィターゼ}₁₁_1U_U_U_{U ：}_：：_：　　　　　　　　373737℃、37℃、℃、℃、pH5.5pH5.5においてpH5.5pH5.5においてにおいてにおいて1111分間に分間に分間に分間にﾌｨﾁﾝ酸からﾌｨﾁﾝ酸からﾌｨﾁﾝ酸から

ﾌｨﾁﾝ酸から1111μμμmolμmolmolmolのﾘﾝ酸を生成する力のﾘﾝ酸を生成する力のﾘﾝ酸を生成する力のﾘﾝ酸を生成する力

リン資源の節減

環境富栄養化の抑制

リン鉱石リン鉱石リン鉱石リン鉱石

フィチン酸の分解による

リンやミネラルの吸収促進

ﾌｨﾀｰｾﾞ

高生産植物

（作物収穫後に廃棄される部分）（作物収穫後に廃棄される部分）（作物収穫後に廃棄される部分）（作物収穫後に廃棄される部分）

太陽エネルギー有効利用

による物質生産

5 5 5 5 U / U / U / U / ﾌｨﾀｰｾﾞﾌｨﾀｰｾﾞﾌｨﾀｰｾﾞﾌｨﾀｰｾﾞ生産植物生産植物生産植物生産植物ｇｇｇｇﾌｨﾀｰｾﾞﾌｨﾀｰｾﾞﾌｨﾀｰｾﾞﾌｨﾀｰｾﾞ添加の効果が期待される活性値は 500 U* _{/ 飼料（多量のﾌｨﾁﾝ酸含有） 1kg} 現行飼料９００gあたり１００ｇの添加を想定して目標値を次のように設定

2. 2. 2. 2.序論序論序論序論

フィターゼ遺伝子

_{フィターゼ遺伝子}

組織特異的高発現技術

_{組織特異的高発現技術}

安定蓄積技術

_{安定蓄積技術}

実証試験

_実証試験

（北大･院・農）（奈良先大）（山形大･農）

ｻﾂﾏｲﾓ形質転換系

_{ｻﾂﾏｲﾓ形質転換系}

（石川県農短大）

研究開発のアプローチ

･組織特異的ﾌﾟﾛﾓｰﾀｰの利用　(Cabﾌﾟﾛﾓｰﾀｰ：三井化学　特2086045）･高発現ﾂｰﾙの利用･蓄積部位の選定･遺伝子の選定酵母由来ﾌｨﾀｰｾﾞ(三井化学　特開平8-289782）植物由来酸性ﾌｫｽﾌｧﾀｰｾﾞ(三井化学　特開平13-029085), ﾌｨﾀｰｾﾞ･形質転換体の作成ﾍﾞﾆｱｽﾞﾏ高系14号･飼料添加による効果確認･ｻｲﾚｰｼﾞ化試験の実施飼料添加剤飼料添加剤飼料添加剤飼料添加剤ﾌｨﾀｰｾﾞ高生産植物の開発（目標：ﾌｨﾀｰｾﾞ高生産植物の開発（目標：ﾌｨﾀｰｾﾞ高生産植物の開発（目標： ﾌｨﾀｰｾﾞ高生産植物の開発（目標：5U/g-FW)

<植物材料

植物材料

植物材料>

①ｼﾛｲﾇﾅｽﾞﾅ

②イネ

③サツマイモ

2. 2. 2. 2.序論序論序論序論

(3)

120 100 80 60 40 kDa 120 100 80 60 40 kDa

Leaves Roots Seeds 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Ｍ遺伝子の種類、初期のﾍﾞｸﾀｰ導入後の活性変化遺伝子の種類、初期のﾍﾞｸﾀｰ導入後の活性変化遺伝子の種類、初期のﾍﾞｸﾀｰ導入後の活性変化遺伝子の種類、初期のﾍﾞｸﾀｰ導入後の活性変化（下図）と（下図）と（下図）と

（下図）とLASAP2LASAP2LASAP2LASAP2の組織特異的な発現（右図）の組織特異的な発現（右図）の組織特異的な発現（右図）の組織特異的な発現（右図）

0 100 200 300 400 500 600

Leaves Roots Seeds

Phy ta se a c ti vi ty (m U / m g o f p ro tein) Ｃａｂﾌﾟﾛﾓｰﾀｰの利用により、緑葉部特異的Ｃａｂﾌﾟﾛﾓｰﾀｰの利用により、緑葉部特異的Ｃａｂﾌﾟﾛﾓｰﾀｰの利用により、緑葉部特異的Ｃａｂﾌﾟﾛﾓｰﾀｰの利用により、緑葉部特異的に目的ﾀﾝﾊﾟｸ質を生産させることが可能に目的ﾀﾝﾊﾟｸ質を生産させることが可能に目的ﾀﾝﾊﾟｸ質を生産させることが可能に目的ﾀﾝﾊﾟｸ質を生産させることが可能

<ｳｪｽﾀﾝ解析

ｳｪｽﾀﾝ解析

ｳｪｽﾀﾝ解析>

緑葉

根

玄米

<ﾌｨﾀｰｾﾞ活性

ﾌｨﾀｰｾﾞ活性

ﾌｨﾀｰｾﾞ活性>

ﾌｨﾀｰｾﾞ活性

非形質転換イネ P P P

P----UbiUbiUbiUbi -LASAP2 P

P P

P----CabCabCabCab-LASAP2

T-nos

P PP

P----ubiubiubiubi ((((maize, maize, ubiqutinmaize, maize, ubiqutinubiqutinubiqutin) LASAP2 (1.5kb)LASAP2 (1.5kb)LASAP2 (1.5kb)LASAP2 (1.5kb) 酵母酵母酵母酵母フィターゼフィターゼフィターゼフィターゼ (1.4(1.4(1.4(1.4kb)kb)kb)kb) P PP

P----Cab (rice)Cab (rice)Cab (rice)Cab (rice)

ﾌﾟﾛﾓｰﾀｰ cDNA イネへ導入・LASAP2導入時、活性上昇確認ただし、＜0.5U/ｇ-FW（生重量）で目標の1/10未満・酵母ﾌｨﾀｰｾﾞは上記ﾍﾞｸﾀｰでは活性上昇なしﾌｨﾁﾝ酸分解活性を有する２つの酵素に着目　（特許は当社出願）

3 33 3----1.1.1.1.成果成果成果成果・ﾙｰﾋﾟﾝ（ﾏﾒ科）由来酸性フォスファターゼ (LASAP2) ・酵母(Schwanniomyces occidentalis)由来フィターゼ成果：事業原簿　69頁～72頁酵母フィターゼ酵母フィターゼ酵母フィターゼ酵母フィターゼ基質特異性が高い基質特異性が高い基質特異性が高い基質特異性が高い温度安定性温度安定性温度安定性温度安定性：：：： ≦≦≦≦70707070℃℃℃℃ 酸性ﾌｫｽﾌｧﾀｰｾﾞ酸性ﾌｫｽﾌｧﾀｰｾﾞ酸性ﾌｫｽﾌｧﾀｰｾﾞ

酸性ﾌｫｽﾌｧﾀｰｾﾞ ((((LASAP2)LASAP2)LASAP2)LASAP2)

基質特異性が低い基質特異性が低い基質特異性が低い基質特異性が低い　温度安定性　温度安定性　温度安定性　温度安定性：：：： ≦≦≦50≦505050℃℃℃℃ 組換えイネで活性を検出組換えイネで活性を検出組換えイネで活性を検出組換えイネで活性を検出（ただし、目標の（ただし、目標の（ただし、目標の（ただし、目標の1/101/101/10未満）1/10未満）未満）未満）活性を確認できず活性を確認できず活性を確認できず活性を確認できず

目標値

目標値(5

(5

(5 U/

(5

U/

U/gggg-

--

-FW

FW

FW))))を達成するためには？

FW

を達成するためには？

酵母フィターゼの発現条件の検討酵母フィターゼの発現条件の検討酵母フィターゼの発現条件の検討酵母フィターゼの発現条件の検討・コドンの改変・コドンの改変・コドンの改変・コドンの改変・・・・細胞間隙への移行シグナルの付加細胞間隙への移行シグナルの付加細胞間隙への移行シグナルの付加細胞間隙への移行シグナルの付加 LASAP2 LASAP2 LASAP2 LASAP2の細胞内蓄積部位の選定の細胞内蓄積部位の選定の細胞内蓄積部位の選定の細胞内蓄積部位の選定・各種移行シグナル配列の付加・各種移行シグナル配列の付加・各種移行シグナル配列の付加・各種移行シグナル配列の付加

フィターゼ高生産植物の作出

3 33 3----2.2.2.2.成果成果成果成果

(4)

T-nos

P P P P----ubiubiubiubi P P P P----35S35S35S35S P P P P----cabcabcabcab P

PP

P----cab +5cab +5cab +5cab +5’UTR UTR UTR UTR

Cht3 Cht3 Cht3 Cht3----SSSSSSSS 酵母酵母酵母

酵母phyphyphyphy(f,s)(f,s)(f,s)(f,s) 改変

改変改変

改変phyphyphyphy(f,s)(f,s)(f,s)(f,s)

酵母フィターゼ

高発現用コンストラクト

高発現用コンストラクトの構築

の構築

Cht3 Cht3 Cht3 Cht3----SSSSSSSSと酵母フィターゼの連結方法と酵母フィターゼの連結方法と酵母フィターゼの連結方法と酵母フィターゼの連結方法 MRALALAVVAMAVVAVRG MRALALAVVAMAVVAVRGMRALALAVVAMAVVAVRG

MRALALAVVAMAVVAVRG+ M + + M + VSISKLINNGLLLAGQSVYQ+ M + + M + VSISKLINNGLLLAGQSVYQVSISKLINNGLLLAGQSVYQDLAVSISKLINNGLLLAGQSVYQDLADLADLA………

MRALALAVVAMAVVAVRG MRALALAVVAMAVVAVRGMRALALAVVAMAVVAVRG

MRALALAVVAMAVVAVRG+ M + QSVYQDLA+ M + QSVYQDLA……+ M + QSVYQDLA+ M + QSVYQDLA………

Cht3 Cht3 Cht3

Cht3----酵母（改変）酵母（改変）酵母（改変）酵母（改変）phyphyphyphy((((sssshort)hort)hort)hort)

Cht3 Cht3 Cht3

Cht3----酵母（改変）酵母（改変）酵母（改変）酵母（改変）phyphyphyphy((((ffffull)ull)ull)ull)

局在性予測プログラム局在性予測プログラム局在性予測プログラム局在性予測プログラムPSORTPSORTPSORTPSORT を用いた予測データを考慮を用いた予測データを考慮を用いた予測データを考慮を用いた予測データを考慮 15 15 15 15アミノ酸除去アミノ酸除去アミノ酸除去アミノ酸除去 0 20 40 60 80 100 120 0 20 40 60 80 100 120 ｲﾈｲﾈｲﾈｲﾈの全CDSによるコドン使用頻度 (%) 酵母酵母酵母酵母ﾌｨﾀｰｾのコドン使用頻度 (%) ATG-Met_TGG-Trp TTA 0 20 40 60 80 100 120 0 20 40 60 80 100 120 ｲﾈｲﾈｲﾈｲﾈの全CDSによるコドン使用頻度 (%) 酵母酵母酵母酵母ﾌｨﾀｰｾのコドン使用頻度 (% ) ATG-Met TGG-Trp TTA コドン改変の主な目的コドン改変の主な目的コドン改変の主な目的コドン改変の主な目的 ①遺伝子発現効率（特に翻訳効率）の上昇 ①遺伝子発現効率（特に翻訳効率）の上昇①遺伝子発現効率（特に翻訳効率）の上昇 ①遺伝子発現効率（特に翻訳効率）の上昇 ② ②②

②poly(A)poly(A)poly(A)poly(A)付加ｼｸﾞﾅﾙとして誤認識される配列の除去付加ｼｸﾞﾅﾙとして誤認識される配列の除去付加ｼｸﾞﾅﾙとして誤認識される配列の除去付加ｼｸﾞﾅﾙとして誤認識される配列の除去

改変

改変改変

改変phyphyphyphy

コドン改変後コドン改変後コドン改変後コドン改変後酵母酵母酵母

酵母phyphyphyphy

コドン改変前コドン改変前コドン改変前コドン改変前

3 33 3----2.2.2.2.成果成果成果成果 ( (( (ｲﾈｷﾁﾅｰｾﾞｲﾈｷﾁﾅｰｾﾞｲﾈｷﾁﾅｰｾﾞｲﾈｷﾁﾅｰｾﾞ3333由来細胞外分泌ｼｸﾞﾅﾙ）由来細胞外分泌ｼｸﾞﾅﾙ）由来細胞外分泌ｼｸﾞﾅﾙ）由来細胞外分泌ｼｸﾞﾅﾙ） 2* 酵母: 酵母ﾌｨﾀｰｾﾞ(ｵﾘｼﾞﾅﾙ) 改変改変改変改変: : : : ｺﾄﾞﾝ改変酵母ﾌｨﾀｰｾﾞｺﾄﾞﾝ改変酵母ﾌｨﾀｰｾﾞｺﾄﾞﾝ改変酵母ﾌｨﾀｰｾﾞｺﾄﾞﾝ改変酵母ﾌｨﾀｰｾﾞ f: 全長ORF, s: N末15aa除去 m: N末34aa残基除去 Anphy: A.niger由来ﾌｨﾀｰｾﾞ 1* cht cht cht cht: : : : ｲﾈ、ｷﾁﾅｰｾﾞ由来ｲﾈ、ｷﾁﾅｰｾﾞ由来ｲﾈ、ｷﾁﾅｰｾﾞ由来ｲﾈ、ｷﾁﾅｰｾﾞ由来 rbc: ｲﾈ rbcS由来 α:ｵｵﾑｷﾞ, α-ｱﾐﾗｰｾﾞ由来 0 00 0 0 .1 0 .10 .1 0 .1 0 .2 0 .20 .2 0 .2 0 .3 0 .30 .3 0 .3 0 .4 0 .40 .4 0 .4 0 .5 0 .50 .5 0 .5 0 .6 0 .60 .6 0 .6 0 .7 0 .70 .7 0 .7 活性 (U / g F W ) 活性 (U / g F W ) 活性 (U / g F W ) 活性 (U / g F W ) 0 00 0 0 .1 0 .10 .1 0 .1 0 .2 0 .20 .2 0 .2 0 .3 0 .30 .3 0 .3 0 .4 0 .40 .4 0 .4 0 .5 0 .50 .5 0 .5 0 .6 0 .60 .6 0 .6 0 .7 0 .70 .7 0 .7 活性 (U / g F W ) 活性 (U / g F W ) 活性 (U / g F W ) 活性 (U / g F W )

フィターゼ高発現

フィターゼ高発現シロイヌナズナのスクリーニング

シロイヌナズナのスクリーニング

WT WT WT

WT pBIpBIpBI-pBI---H1H1H1H1 35S353535SSS系系系系

cht cht cht cht----酵母酵母酵母酵母ffff 酵母酵母酵母酵母ffff cht cht cht cht----酵母酵母酵母酵母ssss 酵母酵母酵母酵母ssss cht cht cht cht----改変改変改変改変ffff 改変改変改変改変ffff cht cht cht cht----改変改変改変改変ssss 改変改変改変改変ssss LASAP2 LASAP2 LASAP2 LASAP2 rbc rbc rbc

rbc----LASAPLASAPLASAPLASAP2m2m2m2m α

α α

α ----LASAP2mLASAP2mLASAP2mLASAP2m cht

cht cht

cht----LASAPLASAPLASAPLASAP2m2m2m2m LASAP2m LASAP2m LASAP2m LASAP2m LASAP3 LASAP3 LASAP3 LASAP3 Anphy Anphy Anphy Anphy 35 35 35 35SSSS----chtcht改変chtcht改変改変改変ssss 35 3535 35SSSS----chtchtchtcht改変改変改変改変ffff 赤線赤線赤線

赤線：：：： WT (WT (WT (WT (非形質転換イネ非形質転換イネ) & 非形質転換イネ非形質転換イネ) & ) & pBI) & pBIpBIpBI----H1 (vectorH1 (vector部分のみ導入ｲﾈH1 (vectorH1 (vector部分のみ導入ｲﾈ部分のみ導入ｲﾈ部分のみ導入ｲﾈ) ) ) の平均（) の平均（の平均（0.093 の平均（0.093 U/0.093 0.093 U/U/U/gFWgFWgFWgFW））））

Cab Cab Cab

Cab系系系系 CabCabCabCab----UTRUTRUTRUTR系系系系

Cab Cab Cab Cab----chtcht改変chtcht改変改変改変ffff CabUTR CabUTRCabUTR CabUTR----chtchtchtcht改変改変改変改変ffff CabUTR CabUTRCabUTR CabUTR - ---chtchtchtcht改変改変改変改変ssss ｼｸﾞﾅﾙ配列*1 _{遺伝子(cDNA)}*2 ｲﾈｷﾁﾅｰｾﾞの細胞外分泌ｼｸﾞﾅﾙとｺﾄﾞﾝ改変型酵母ﾌｨﾀｰｾﾞの組合せが高発現化に有効ｲﾈｷﾁﾅｰｾﾞの細胞外分泌ｼｸﾞﾅﾙとｺﾄﾞﾝ改変型酵母ﾌｨﾀｰｾﾞの組合せが高発現化に有効ｲﾈｷﾁﾅｰｾﾞの細胞外分泌ｼｸﾞﾅﾙとｺﾄﾞﾝ改変型酵母ﾌｨﾀｰｾﾞの組合せが高発現化に有効

ｲﾈｷﾁﾅｰｾﾞの細胞外分泌ｼｸﾞﾅﾙとｺﾄﾞﾝ改変型酵母ﾌｨﾀｰｾﾞの組合せが高発現化に有効 _{Mitsui Chemicals, Inc., 8}_{Mitsui Chemicals, Inc., 8}_{Mitsui Chemicals, Inc., 8}_{Mitsui Chemicals, Inc., 8} 3 33 3----2.2.2.2.成果成果成果成果

(5)

酵母フィターゼ導入イネのフィターゼ活性（

酵母フィターゼ導入イネのフィターゼ活性（LASAP2

LASAP2

LASAP2導入ｲﾈとの比較）

導入ｲﾈとの比較）

0.0 0.00.0 0.0 2.0 2.02.0 2.0 4.0 4.04.0 4.0 6.0 6.06.0 6.0 8.0 8.08.0 8.0 10.0 10.010.0 10.0 12.0 12.012.0 12.0 phytase acti vi ty ( U / phytase acti vi ty ( U / phytase acti vi ty ( U / phytase acti vi ty ( U / gggg----FWFWFWFW )))) 0.461 0.461 0.461 0.461 U/U/U/gggg-U/ ---FWFWFWFW 10.6 10.6 10.6 10.6 U/U/U/U/gggg----FW FW FW FW

LASAP2

LASAP2導入イネ

導入イネ

酵母フィターゼ導入イネ

目標値：目標値：目標値：目標値：5 5 5 5 U/U/U/U/gggg----FWFWFWFW 非形質非形質非形質非形質転換転換転換転換イネイネイネイネ Ubi UbiUbi Ubi LASAP2 LASAP2 LASAP2 LASAP2 Cab Cab Cab Cab LASAP2 LASAP2LASAP2 LASAP2 改変前改変前改変前改変前改変後改変後改変後改変後改変前改変前改変前改変前改変後改変後改変後改変後

ffffullullullull sssshorthorthorthort

非形質非形質非形質非形質転換転換転換転換イネイネイネイネ＜＜＜

＜PPP-P---Cab :: cht3Cab :: cht3Cab :: cht3Cab :: cht3----SS :: SS :: SS :: SS :: 改変改変Phy改変改変PhyPhyPhy＞＞＞＞ののののイネへの導入により、目標値を上回るフィターゼ活性を達成イネへの導入により、目標値を上回るフィターゼ活性を達成イネへの導入により、目標値を上回るフィターゼ活性を達成イネへの導入により、目標値を上回るフィターゼ活性を達成 T-nos

cht3 cht3 cht3

cht3----SSSSSSSS 酵母酵母phy酵母酵母phyphyphy(f,s)(f,s)(f,s)(f,s) 改変

改変改変

改変phyphyphyphy(f,s)(f,s)(f,s)(f,s)

P P P

P----Cab (rice)Cab (rice)Cab (rice)Cab (rice)

3 33 3----3.3.3.3.成果成果成果成果

ｲﾈで発現させた酵母ﾌｨﾀｰｾﾞの生化学的特徴

0 00 0 20 20 20 20 40 40 40 40 60 60 60 60 80 80 80 80 100 100 100 100 120 120 120 120 20 20 20 20 40404040 60606060 80808080 100100100100 温度（℃）温度（℃）温度（℃）温度（℃）相対活性（％）相対活性（％）相対活性（％）相対活性（％）ｲﾈ発現型酵母ﾌｨﾀｰｾﾞの至適温度、至ｲﾈ発現型酵母ﾌｨﾀｰｾﾞの至適温度、至ｲﾈ発現型酵母ﾌｨﾀｰｾﾞの至適温度、至ｲﾈ発現型酵母ﾌｨﾀｰｾﾞの至適温度、至適ｐ適ｐ適ｐ適ｐHHHは標品と同じHは標品と同じは標品と同じ(70は標品と同じ(70℃、(70(70℃、℃、℃、pH4.5pH4.5pH4.5pH4.5）））） 0 00 0 20 20 20 20 40 40 40 40 60 60 60 60 80 80 80 80 100 100100 100 120 120120 120 2.0 2.0 2.0 2.0 3.03.03.03.0 4.04.04.04.0 5.05.05.05.0 6.06.06.06.0 7.07.07.07.0 8.08.08.08.0 pH pHpH pH 相対活性（％）相対活性（％）相対活性（％）相対活性（％）至適至適至適至適pHpHpHpH 至適温度至適温度至適温度至適温度ｲﾈ発現型標品＜ウェスタン解析＞＜ウェスタン解析＞＜ウェスタン解析＞＜ウェスタン解析＞ _{（抗体：酵母ﾌｨﾀｰｾﾞ）} ｲﾈ発現型酵母ﾌｨﾀｰｾﾞは酵母標品よりもｲﾈ発現型酵母ﾌｨﾀｰｾﾞは酵母標品よりもｲﾈ発現型酵母ﾌｨﾀｰｾﾞは酵母標品よりもｲﾈ発現型酵母ﾌｨﾀｰｾﾞは酵母標品よりも糖鎖修飾ﾚﾍﾞﾙが低い糖鎖修飾ﾚﾍﾞﾙが低い糖鎖修飾ﾚﾍﾞﾙが低い糖鎖修飾ﾚﾍﾞﾙが低い 50 40 60 70 100 80 kDa 52kDa*3 3*：酵母ﾌｨﾀｰｾﾞのAA配列から推定されるｻｲｽﾞ酵母標品酵母標品酵母標品酵母標品イネ発現型イネ発現型イネ発現型イネ発現型非形質転換ｲﾈ－＋＋＋＋－－＋＋＋＋－－－－－－－＋＋＋＋＋＋＋＋－－－－－－ N-Glycosidase F *1 TFMS*2 2*：N-結合型、O-結合型の糖鎖を化学的に切断 1*：N-結合型糖鎖を酵素的に切断＜脱糖鎖処理＞＜脱糖鎖処理＞＜脱糖鎖処理＞＜脱糖鎖処理＞脱糖鎖解析脱糖鎖解析脱糖鎖解析脱糖鎖解析

3 33 3----3.3.3.3.成果成果成果成果

(6)

短期温度安定性

◆ｲﾈ粗抽出液中のﾌｨﾀｰｾﾞ活性ｲﾈ粗抽出液中のﾌｨﾀｰｾﾞ活性ｲﾈ粗抽出液中のﾌｨﾀｰｾﾞ活性ｲﾈ粗抽出液中のﾌｨﾀｰｾﾞ活性 ◆ｲﾈ粗抽出液中の可溶性ﾀﾝﾊﾟｸ質の安定性ｲﾈ粗抽出液中の可溶性ﾀﾝﾊﾟｸ質の安定性ｲﾈ粗抽出液中の可溶性ﾀﾝﾊﾟｸ質の安定性ｲﾈ粗抽出液中の可溶性ﾀﾝﾊﾟｸ質の安定性ｲﾈ粗抽出液中においても非常に安定ｲﾈ粗抽出液中においても非常に安定ｲﾈ粗抽出液中においても非常に安定ｲﾈ粗抽出液中においても非常に安定 0 00 0 20 20 20 20 40 40 40 40 60 60 60 60 80 80 80 80 100 100 100 100 120 120 120 120 0 00 0 1111 2222 3333 4444 5555 静置時間（週間）静置時間（週間）静置時間（週間）静置時間（週間）相対量（％）相対量（％）相対量（％）相対量（％）

ｲﾈで発現させた酵母ﾌｨﾀｰｾﾞの安定性評価

0 00 0 20 20 20 20 40 40 40 40 60 60 60 60 80 80 80 80 100 100100 100 120 120120 120 0 00 0 1111 2222 3333 4444 5555 静置時間（週間）静置時間（週間）静置時間（週間）静置時間（週間）相対活性（％）相対活性（％）相対活性（％）相対活性（％） 4℃ 37℃ 50℃ 0 1 2 4 0 1 2 4 0 1 2 4 M M 4 44 4℃℃℃℃ 静置静置静置静置 25 2525 25℃℃℃℃ 静置静置静置静置 37 3737 37℃℃℃℃ 静置静置静置静置 50 5050 50℃℃℃℃ 静置静置静置静置

◆各温度にて各温度にて各温度にて15各温度にて151515minmin処理→minmin処理→処理→ 37処理→3737℃にて活性測定37℃にて活性測定℃にて活性測定℃にて活性測定

0 00 0 20 2020 20 40 4040 40 60 6060 60 80 8080 80 100 100100 100 120 120120 120 20 2020 20 40404040 60606060 80808080 100100100100 温度温度温度温度 ((((℃℃℃))))℃ 相対活性（％）相対活性（％）相対活性（％）相対活性（％） 20 40 60 80 100 60 65 70 75 80 イネ発現型酵母フィターゼは標品に比べるとイネ発現型酵母フィターゼは標品に比べるとイネ発現型酵母フィターゼは標品に比べるとイネ発現型酵母フィターゼは標品に比べると 70 70 70 70℃付近でわずかに安定性が高い℃付近でわずかに安定性が高い℃付近でわずかに安定性が高い℃付近でわずかに安定性が高い長期保存安定性長期保存安定性長期保存安定性長期保存安定性ｲﾈ発現型標品

3 33 3----3.3.3.3.成果成果成果成果 0.0 0.0 0.0 0.0 0.2 0.2 0.2 0.2 0.4 0.4 0.4 0.4 0.6 0.6 0.6 0.6 0.8 0.8 0.8 0.8 1.0 1.0 1.0 1.0 1.2 1.2 1.2 1.2 1.4 1.4 1.4 1.4 1.6 1.6 1.6 1.6 1.8 1.8 1.8 1.8 2.0 2.0 2.0 2.0 0 00 0 30303030 60606060 90909090 120120120120 150150150150 180180180180 210210210210 240240240240 時間（min）時間（min）時間（min）時間（min）遊離リン量 (μ mo l) 遊離リン量 (μ mo l) 遊離リン量 (μ mo l) 遊離リン量 (μ mo l) 　組成　　　重量比 (ﾌｨﾁﾝP/全P) ﾄｳﾓﾛｺｼ種子75%　　　（66％）大豆粕 24%　　　（47％）　米糠 1%　　　（74％）

形質転換イネ緑葉を飼料に

形質転換イネ緑葉を飼料に10

10

10 10％混合した時の飼料中フィチンの分解効果

％混合した時の飼料中フィチンの分解効果

実験手順

遊離リン酸定量遊離リン酸定量遊離リン酸定量遊離リン酸定量非形質転換ｲﾈ非形質転換ｲﾈ非形質転換ｲﾈ非形質転換ｲﾈ飼料飼料飼料飼料0.18ｇｲﾝｷｭﾍﾞｰｼｮﾝｲﾝｷｭﾍﾞｰｼｮﾝｲﾝｷｭﾍﾞｰｼｮﾝｲﾝｷｭﾍﾞｰｼｮﾝ（37℃）標品添加標品添加標品添加標品添加形質転換ｲﾈ形質転換ｲﾈ形質転換ｲﾈ形質転換ｲﾈ緑葉緑葉緑葉緑葉0.02ｇ反応液反応液反応液反応液１ｍｌ（ｐH5.5) 標品標品標品標品500500500500UUUU****_/kg_/kg_/kg_/kg飼料_飼料_飼料_飼料 * ** *フィチン酸ナトリウムを基質とした場合のﾌｨﾀｰｾﾞ活性フィチン酸ナトリウムを基質とした場合のﾌｨﾀｰｾﾞ活性フィチン酸ナトリウムを基質とした場合のﾌｨﾀｰｾﾞ活性フィチン酸ナトリウムを基質とした場合のﾌｨﾀｰｾﾞ活性

3 33 3----3.3.3.3.成果成果成果成果ｲﾈ発現型酵母ﾌｨﾀｰｾﾞは、飼料に含まれるﾌｨﾁﾝを分解する能力ありｲﾈ発現型酵母ﾌｨﾀｰｾﾞは、飼料に含まれるﾌｨﾁﾝを分解する能力ありｲﾈ発現型酵母ﾌｨﾀｰｾﾞは、飼料に含まれるﾌｨﾁﾝを分解する能力ありｲﾈ発現型酵母ﾌｨﾀｰｾﾞは、飼料に含まれるﾌｨﾁﾝを分解する能力あり標品標品標品標品1000100010001000UUUU****_/kg_/kg_/kg_/kg飼料_飼料_飼料_飼料形質転換ｲﾈ形質転換ｲﾈ形質転換ｲﾈ形質転換ｲﾈ 512512512U512UUU＊＊＊＊_相当/_相当_相当_相当_//_/kg_kg_kg_kg飼料_飼料_飼料_飼料標品0U*_/kg飼料全ﾌｨﾁﾝPの41％遊離

(7)

サイレージ化

サイレージ化；青刈りした作物を発酵させ飼料化

・生成した乳酸などにより腐敗菌やタンパク質分解菌の活動が抑えられ、飼料の長期貯蔵が可能飼料の長期貯蔵が可能飼料の長期貯蔵が可能飼料の長期貯蔵が可能・発酵で生じた有機酸が、家畜の重要な栄養源になり、またその香りから食欲を増進

サイレージ化の実験手順

出穂前のイネの茎葉部 2mm以下に切断埋蔵（遮光した試験管に密封） 20℃、貯蔵開封し、ﾌｨﾀｰｾﾞ活性測定

形質転換イネのサイレージ化に伴うフィターゼの安定性

イネ発現型酵母フィターゼはサイレージ処理においても非常に安定

0 00 0 20 20 20 20 40 40 40 40 60 60 60 60 80 80 80 80 100 100100 100 120 120120 120 140 140140 140 0 00 0 2222 4444 6666 8888 10101010 12121212 埋蔵期間（週間）埋蔵期間（週間）埋蔵期間（週間）埋蔵期間（週間）ﾌｨﾀｰｾﾞ相対活性ﾌｨﾀｰｾﾞ相対活性ﾌｨﾀｰｾﾞ相対活性ﾌｨﾀｰｾﾞ相対活性（処理前の活性＝1 00 ）（処理前の活性＝1 00 ）（処理前の活性＝1 00 ）（処理前の活性＝1 00 ）

3 33 3----3.3.3.3.成果成果成果成果 ◆イネ由来 ◆イネ由来 ◆イネ由来

◆イネ由来CabCabCabCabプロモーターの使用により、茎葉部特異的な発現に成功したプロモーターの使用により、茎葉部特異的な発現に成功したプロモーターの使用により、茎葉部特異的な発現に成功したプロモーターの使用により、茎葉部特異的な発現に成功した

◆イネにおいてﾌｨﾀｰｾﾞの高生産化に成功（最高 ◆イネにおいてﾌｨﾀｰｾﾞの高生産化に成功（最高 ◆イネにおいてﾌｨﾀｰｾﾞの高生産化に成功（最高 ◆イネにおいてﾌｨﾀｰｾﾞの高生産化に成功（最高10.610.610.6U/10.6U/U/U/gggg----FWFWFWFW、、対照比、、対照比対照比273対照比273273273倍）倍）倍）倍）・酵母標品に比べて糖鎖修飾ﾚﾍﾞﾙは低いが至適温度、至適ｐＨは同じ・ﾌｨﾀｰｾﾞ発現ｲﾈを飼料に10％混合時、飼料中のﾌｨﾁﾝ酸分解において　in vitro活性値以上の効果有り・緑葉抽出液中、及びサイレージの過程でも極めて安定 ◆細胞外分泌シグナル配列とコドン改変型酵母ﾌｨﾀｰｾﾞの組合せがフィターゼの高発現化に　 ◆細胞外分泌シグナル配列とコドン改変型酵母ﾌｨﾀｰｾﾞの組合せがフィターゼの高発現化に　 ◆細胞外分泌シグナル配列とコドン改変型酵母ﾌｨﾀｰｾﾞの組合せがフィターゼの高発現化に　 ◆細胞外分泌シグナル配列とコドン改変型酵母ﾌｨﾀｰｾﾞの組合せがフィターゼの高発現化に　有効であることを確認した有効であることを確認した有効であることを確認した有効であることを確認した・70℃付近の短時間の熱処理において標品以上の安定性有りイネで生産させたフィターゼはイネで生産させたフィターゼはイネで生産させたフィターゼはイネで生産させたフィターゼは＜＜＜＜数値目標達成＞数値目標達成＞数値目標達成＞数値目標達成＞ ◆茎葉切片を材料としたサツマイモの高効率の形質転換系を確立した ◆茎葉切片を材料としたサツマイモの高効率の形質転換系を確立した ◆茎葉切片を材料としたサツマイモの高効率の形質転換系を確立した ◆茎葉切片を材料としたサツマイモの高効率の形質転換系を確立した

成果のまとめ

高い実用性高い実用性高い実用性高い実用性

3 33 3----4.4.4.まとめ4.まとめまとめまとめ

達成度

達成度100

100 100％

100 ％

％

世界ﾄｯﾌﾟﾚﾍﾞﾙ世界ﾄｯﾌﾟﾚﾍﾞﾙ世界ﾄｯﾌﾟﾚﾍﾞﾙ世界ﾄｯﾌﾟﾚﾍﾞﾙ

(8)

事業化・実用化の見通し

植物によるﾌｨﾀｰｾﾞ生産法の実用化の可能性はあり

植物によるﾌｨﾀｰｾﾞ生産法の長所

　①工場建設費などの初期投資が不要（コスト削減に寄与）　②化石資源由来のｴﾈﾙｷﾞｰに依存しない物質生産（省エネ・環境負荷低減に寄与）　③食用にされない不用部位での生産であれば、食用部とﾌｨﾀｰｾﾞ生産部位を分けて収穫可能　　（製造工程簡略化・コスト削減に寄与）　④ﾌｨﾀｰｾﾞ生産植物をそのまま、又はサイレージ化して長期保存後、飼料へ添加可能であり、　　微生物法での生産、抽出、精製などの複雑な工程が不要（製造工程簡略化・コスト削減に寄与）

4. 4. 4. 4.見通し見通し見通し見通し事業化の見通し：事業原簿　73頁

今後の課題・展開

ｻﾂﾏｲﾓを含む適用可能植物の拡大・普遍化

（ﾌｨﾀｰｾﾞ遺伝子、宿主植物、ツールの最適化）

ﾌｨﾀｰｾﾞ生産植物の単胃家畜への給餌試験

によるﾌｨﾀｰｾﾞの効果確認

組換え飼料としての安全性評価

5. 5. 5. 5.課題・展開課題・展開課題・展開課題・展開