岡山 医学会 雑誌 第118巻 January2007,PP.215-220
平成17年度岡山医学会賞(結 城賞)受 賞論文
内 臓 脂 肪 組 織 に 由来 す る セ リ ンプ ロ テ ア ー ゼ 阻 害 剤:Vaspinの
同 定
肥 満 状 態 で イ ンス リ ン感 受 性 を高 め る新 規 ア デ ィポ サ イ トカ イ ン
肥 田 和 之a*,和 田 淳a,江 口 潤a,ZhangHongb,馬 場 雅 子a,清 田 綾a,
橋 本 泉a,岡 田 達 夫a,安 原 章 浩a,中 司 敦 子a,赤 木 滋a,四 方 賢 一a,
宝 来 真 志c,二 見 淳 一 郎d,渡 辺 英 二 郎e,松 木 泰e,平 松 隆 司e,愼 野 博 史a, Yashpal S.Kanwarf a岡山大 学大 学 院医 歯薬 学総合 研 究科 腎 ・免 疫 ・内分 泌代謝 内科 学 ,b北 京大学第一医院腎臓研究所, c住友化 学工 業(株)生物 環境 科 学研 究所,d岡 山大 学 工学 部 生物機 能工 学科 蛋 白質機 能工 学研 究室, e大 日本 住友 製薬(株)大阪研 究所 宝 塚分 室ゲ ノ ム研 究所 ,fノ ースウェス タン大学病理学教室 キ ー ワ ー ド:VaSDin.ア デ ィ ポ サ イ ト カ イ ン.内 臓 脂 肪.イ ン ス リ ン 抵 抗 性.メ タ ボ リ ッ ク シ ン ド ロ ー ム は じ め に 肥 満 に よ り著 明 に 増 大 す る脂 肪 組 織 は 近 年 の 医 学 生 命 科 学 の 進 歩 に よ り,単 な る エ ネ ル ギ ー の 貯 蔵 庫 と し て の 役 割 の み な らず,高 血 圧,糖 尿 病 な ど生 活 習 慣 病 に 影 響 を 及 ぼ す 様 一々 な 生 理 活 性 物 質 を分 泌 し,多 彩 な 生 理 機 能 を 果 た し て い る こ と が 明 ら か に さ れ て い る. 肥 満 症 は 世 界 的 に 急 速 な 増 加 傾 向 に あ る が,糖 尿 病 と の 関 連 に お い て い ま だ不 明 瞭 な 点 が 多 い.今 回,肥 満 状 態 に お い て 皮 下 脂 肪 組 織 で は な く,主 と し て 蓄 積 さ れ た 内 臓 脂 肪 組 織 よ り分 泌 さ れ る新 規 ア デ ィ ポ サ イ ト カ イ ン の 同 定 に 成 功 し,a1-antitrypsinと ホ モ ロ ジ ー を有 し,セ リ ン プ ロ テ ア ー ゼ 阻 害 剤 フ ァ ミ リ ー に 属 す
る こ と か ら,Vaspin(Visceral adipose tissue-derived
serine protease inhibitor)と 命 名 し た.内 臓 脂 肪 蓄 積
を 上 流 と す る メ タ ボ リ ッ ク 症 候 群 の 病 態 が 心 血 管 イ ベ ン ト を 引 き 起 こ す リ ス ク フ ァ ク タ ー と し て 注 目 さ れ て い る が1-6),蓄 積 さ れ た 内 臓 脂 肪 か ら 分 泌 さ れ るVaspin が 糖 代 謝 に い か な る 影 響 を 及 ぼ す の か 検 討 し た. Vaspinの 単 離 と ク ロ ー ニ ン グ 30週 齢 の 内 臓 脂 肪 蓄 積 を 伴 う2型 糖 尿 病 動 物 モ デ ル
ラ ッ ト:OLETF(Otsuka Long-Evans Tokushima
Fatty)ラ ッ ト7)と8週 齢 の 耐 糖 能 異 常 を 示 さ な い コ ン
ト ロ ー ル ラ ッ ト:LETO(Long-Evans Tokushima
Fatty)ラ ッ トの 内 臓 脂 肪 組 織 か ら そ れ ぞ れmRNAを
抽 出 し,PCRを 用 い た 遺 伝 子 サ ブ ト ラ ク シ ョ ン 法
(representational difference analysis of cDNA)を 用
い て135塩 基 対 のVaspinのDNA断 片 を 単 離 し,最 終 的 に 全 長 のcDNAを ク ロ ー ニ ン グ し た8,9). 平 成18年10月 受 理 *〒701 -1192岡 山 市 田 益1711-1 国立 病 院機 構 岡山 医療 セ ン ター 糖 尿 病 ・代 謝 内 科 電 話:086-294-9911FAX:086.294-9255 E-mail:[email protected] ◆ プ ロ フ ィ ー ル ◆ 肥 田 和 之 平 成6年 長 崎大 学 医 学 部 卒,平 成6年 岡 山 大学 医 学 部 第 三 内科(現 腎 ・免疫 ・内 分 泌 代謝 内科 学)入 局.全 人 ゲ ノム プ ロ ジ ェク トが進 行 す る中,平 成9年 よ り和 田 淳 先生 御 指 導 の下,今 日メ タボ リ ック シ ン ドロ ーム の病 態 と して注 目 さ れて い る 内臓 脂 肪 に着 目 して研 究 を行 う.肥 満 状 態 で主 と して内臓 脂肪 か ら発 現 す る2つ のnovel geneの 同 定 に 成 功 し,J.LipidResに 論 文 発 表 を行 う.そ の うち1つ は接 着 因 子 に 関 わ る 膜 蛋 白 で あ り, Biochem J(共 著)に 発 表.も う1つ が分 泌 蛋 白 で あ り,イ ン ス リ ン抵 抗 性 を改善 させ るア デ ィポ カ イ ンで あ る こ と を立 証 してProcNatlAcadSciUSAに 発 表 し,平 成17年 岡 山医 学 会結 城 賞 受 賞.現 在,ト ラ ン ス ジ ェニ ッ クマ ウ ス,ノ ック ア ウ トマ ウ スの 作 製,RIA測 定 系 の 開発 な ど共 同研 究 で行 い,詳 細 な分 子 メカ ニ ズ ム を探 索 中 で あ る.平 成15年 か ら国立 病 院機 構 岡山 医療 セ ン ター に所 属 し,臨 床 の 立場 か らア デ ィポ カイ ンの研 究 に 勤 しん で い る.
VaspinはN末 端 に 疎 水 性 の シ グ ナ ル ペ プ チ ド を 有
し,Blastpサ ー チ を 用 い て 解 析 し た 結
果a1-antitrypsinと40.5%の ホ モ ロ ジ ー を 有 し て い た.
SWISS-MODEL(http://swiss-model.expasy.org)に
よ る 蛋 白 の 立 体 構 造 解 析 か ら3個 の β シ ー ト,9個 の
aフ ェ リ ッ ク ス とSerpin(serine protease inhibitor)
遺 伝 子 フ ァ ミ リ ー に 特 異 的 な 構 造 で あ るreactive site looPを 有 し て い る こ と が 予 想 さ れ た10)(図1A). Vaspinは ノ ー ザ ン プ ロ ッ ト解 析 に お い て30週 齢 の 肥 満OLETFラ ッ ト の 内 臓 脂 肪 組 織 で 発 現 を 認 め た が, 6週 齢 で 非 肥 満 状 態 のLETOラ ッ ト の 内 臓 脂 肪 組 織 に お い て は 発 現 を 認 め な か っ た.ま たOLETFラ ッ ト の 皮 下 脂 肪 組 織,褐 色 脂 肪 組 織,そ の 他 の 臓 器 に お い て も 発 現 を 認 め な か っ た(図1B). A B
図1 Structural analyses,and gene expresion of vaspin in
various tissues.
A:Automated
protein structure
homology modeling by
SWISS-MODEL predicted the presence of 3 fl-sheets,9
a-helices and a reactive site loop.B:Northern
blot analyses of
vaspin in various organs of obese 30 wks-old OLETF and
visceral adipose tissue of lean 6 wks-old LETO rats.A single
transcript is observed in visceral(VIS)fat of OLETF rats.BAT,
brown;SUB,subdermal
adipose tissue.
4週 齢 のOLETFラ ッ ト をOLETFコ ン トロ ー ル 群(OLETF),回 転 ゲ ー ジ で 自 発 運 動 さ せ た 運 動 群 (EXE),イ ン ス リ ン抵 抗 性 改 善 剤 で あ る ピ オ グ リ タ ゾ ン を 投 与 した 群(PIO),イ ンス リ ン で 血 糖 コ ン トロ ー ル を 行 っ た イ ン ス リ ン群(INS)にLETOコ ン トロ ー ル 群(LETO)を 加 え た5群 に お い て50週 齢 に 至 る ま で 様 々 な 条 件 で 飼 育 し,各 白 色 脂 肪 組 織 で のVaspin 遺 伝 子 発 現 の 調 節 を検 討 し た.6週 齢,30週 齢,50週 齢 に お い て 各 群 を堵 殺 し た.堵 殺 当 日 空 腹 に て 体 重 測 定,血 液 採 取 し,各 群 の 体 重 変 化(図2A),血 糖 コ ン ト ロ ー ル 変 化(図2B),空 腹 時 イ ン ス リ ン値 の 変 化 (図2C)を 評 価 し,ま た 白 色 脂 肪 を そ れ ぞ れ,副 睾 丸 周 囲 脂 肪(EPI),腸 間 膜 脂 肪(MES),後 腹 膜 脂 肪 (RET),皮 下 脂 肪(SUB)に 分 け て,脂 肪 重 量 変 化 (図2D)を 評 価 す る と と も にVaspinの 遺 伝 子 発 現 を ノ ー ザ ン プ ロ ッ ト解 析 に て 検 討 し た(図2E). Vaspinは6週 齢 のOLETFラ ッ トの 内 臓 脂 肪 組 織 に お い て ほ と ん ど検 出 で きず,体 重,脂 肪 重 量 そ し て イ ン ス リ ン血 中 濃 度 が ピ ー ク に 達 す る30週 齢 のMESと RETで 強 く発 現 し,EPIで や や 弱 い シ グ ナ ル の 発 現 を 認 め た が,50週 齢 な る と糖 尿 病 の 悪 化 と そ れ に 伴 う体 重 減 少 に よ りVaspinの 遺 伝 子 発 現 は低 下 し た.50週 の 期 間 を通 じ てVaspinは 皮 下 脂 肪 組 織 に お い て ほ と ん ど発 現 を 認 め な か っ た.EXE群 に お い てVaspinの 発 現 は 耐 糖 能 異 常 を示 さ な いLETOラ ッ ト と 同 等 レ 図2
A: Body weight of OLETF,LETO,and OLETF rats with voluntary exercise(EXE),and OLETF rats administered with pioglitazone(TZD)and insulin(INS).A decline in the body weight of OLETF rats is observed at 50 wks of age after peaking at 30 wks.B:Hemoglobin Alc levels progressively rise in OLTEF rats up to 50 wks.C:Fasting immuno-reactive insulin(IRI)levels peak at 30 wks and then decline at 50 wks in OLTEF rats.D:Fat pad weight peaked at 30 wks in OLETF rats,while with the TZD and insulin treatment they progressively rose up to 50 wks.Data included in A-D are mean•}sem(n=5).E:Northern blot analyses of vaspin mRNA in white adipose fatty tissues(WATs).At 30 wks,the expression is high in visceral retroperitoneal(RET)and
mesenteric(MES)WATS in OLTEF rats.The expression is high at 30 and 50 wks in subdermal(SUB)WATs from OLTEF rats treated with TZD,while vaspin's expression visceral WATs was decreased.Insulin had a partial effect on vaspin's mRNA expression.EPI,epidydimal WATs.
Vaspinと イ ン ス リ ン 抵 抗 性:肥 田 和 之,他18名
A
B C
D
E
図2 Effect of pioglitazone and insulin on various physiological
parameters in OLETF and related strains of rats and
expression of vaspins.
A
i.p.glucose tolerance test
B
i.p.glucose tolerance test
C
i.p.glucose tolerance test
図4 Profiles of glucose tolelance andinsulin sensitizanion tests after administration of vaspin and insulin.
A:Glucose tolerance test.The rhVaspin or PBS was
intraperitoneally injected into ICR mice fed with standard
starch chow(STD)or high fat and high sucrose(HFHS)chow
prior to glucose administration.Glucose levels were
significantly reduced with the administration of vaspin
[asterisk(*),p<0.01].B:Insulin levels during the glucose
tolerance test were unaltered,and HFHS mice remained
hyperinsulinemic.C:Insulin sensitization test.The rhVaspin
or PBS was intraperitoneally injected into mice prior to insulin
administration.The blood glucose levels were lowered in
HFHS group receiving insulin+vaspin Lasterisks(*) P<
投 与 し たPIO群,INS群 に お い て30週 齢 で の 皮 下 脂 肪 組 織 に お け るVaspinの 発 現 は 著 し く亢 進 し,50週 ま で そ の レベ ル を維 持 した.そ の 一 方 で,内 臓 脂 肪 組 織 で 発 現 の 低 下 を 認 め た. A B C
図3 Expression of vaspin in 293T cells,adipocytes,and
stromal vascular cells.
A:Western blot analysis of mouse vaspin using supernatants of 293T cultured cells transfected with AxCAmOL 64 and polyclonal anti-vaspin antibody.A prominent band of•`45 kDa is observed.B:Western blot analyses of vaspin using sera of OLETF and LETO rats,and OLETF rats with voluntary exercise(EXE),OLETF rats administered with pioglitazone (TZD)and insulin(INS).A major•`45kDa and a minor 50 kDa bands are seen at 30 wks.The band intensity is notably less at 50 wks in OLTEF rats but it seems to be normalized with insulin and TZD treatments.C:Expression of vaspin in mature adipocytes and stromal vascular cells isolated from epidydimal(EPI),retroperitoneal(RET),mesenteric(MES),
and subdermal(SUB)WATs as analyzed by Northern and Western blot analyses.Expression is confined to adipocytes of visceral WATs and not to stromal endothelial or vascular cells. D,E:Expression in the adipocytes was confirmed by Immuno-fluorescence microscopy in 30 wk-old OLETF rats.(Bar= 100mm in D, Bar=25mm in E).
現 レベ ル
全 長 の マ ウ スVaspincDNAを 組 み 込 ん だ ア デ ノ ウ イ ル ス ベ ク タ ー を作 製 し,HEK293細 胞 に 導 入 し た. そ の 培 養 上 清 を用 い た ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ ト解 析 に お い て,約45kDaの バ ン ドが 認 め られ た(図3A).Vaspin 蛋 白 の 血 清 レ ベ ル は,イ ンス リ ン抵 抗 性 が ピ ー ク と な る30週 齢 で はLETOラ ッ ト に 比 較 し てOLETFラ ッ トで 上 昇 し,糖 尿 病 の 悪 化,体 重 減 少 に 伴 い,50週 齢 のOLETFラ ッ トに お い て は 著 明 に 発 現 が 低 下 し た (図3B).INS群 やPIO群 に お い て は50週 齢 に お い て もVaspinの 血 清 レ ベ ル の 発 現 はOLETF群 に 比 較 し保 持 さ れ,EXE群 と 同 程 度 で あ っ た.血 液 中 の Vaspinが 脂 肪 細 胞 か ら産 生 さ れ る こ と を確 認 す る た め,OLETFラ ッ トの 白色 脂 肪 組 織 を 成 熟 脂 肪 細 胞 と 問 葉 系 細 胞 に 分 離 し,ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ ト解 析 お よ び ノ ー ザ ン プ ロ ッ ト解 析 を 施 行 した11).そ の 結 果Vaspin のmRNAと 蛋 白 質 発 現 は,成 熟 脂 肪 細 胞 に お い て 主 と して 認 め ら れ た(図3C).ま た 腸 間 膜 脂 肪 組 織 を 用 い た 免 疫 組 織 染 色12)に よ っ てVaspinの 発 現 は 脂 肪 細 胞 の 細 胞 質 に 限 局 し て 発 現 し,間 葉 系 細 胞 に は 認 め な か っ た(図3D,E).Vaspinは 高 脂 肪 高 庶 糖飼 料 で 誘 発 した 肥 満)CRマ
ウ
ス に お い てイ ンス リン感 受 性 を高 め る
Vaspinの 機 能 解 析 を行 う た め10週 齢 のICRマ ウ ス に お い て,ブ ドウ 糖 負 荷 試 験 と イ ン ス リ ン静 注 負 荷 試 験 を施 行 し た.ブ ドウ糖 負 荷 試 験 は 当 日午 前7時 と午 後7時 の 計2回,10匹 ず つ2群 に 分 け てrh Vaspin(1 mg/kgweight)あ る い は 溶 媒 を そ れ ぞ れ 腹 腔 内 投 与 し た.2回 目 の 注 射 の2時 間 後 に ブ ド ウ 糖(2g/kg weight)を 腹 腔 内 に 投 与 し,120分 後 ま で 定 期 的 に 血 糖 とイ ン ス リ ン を 測 定 した.イ ン ス リ ン静 注 負 荷 試 験 に 関 して は,当 日午 前7時 と 午 後7時 に 各 群10匹 ず つ rhVaspinま た は 溶 媒 を 腹 腔 内 投 与 し,2回 目 の 注 射 の 2時 間 前 か ら絶 食 状 態 と した.4時 間 の 絶 食 後,イ ン ス リ ン を(0.5unit/kg weight)投 与 し血 糖 を 経 時 的 に 測 定 した.上 記 の 実 験 は 更 に,18週 齢 に 至 る ま で 餌 と し て 総 カ ロ リ ー 中,脂 肪 成 分 が11%含 ま れ て い る 飼 料 〔標 準 飼 料:standard(STD)〕 が 与 え ら れ る 群 と総 カ ロ リ ー 中,58%の 脂 肪 を 含 ん だ 飼 料 〔高 脂 肪 高 蔗 糖 飼 料:high fat high sucrose(HFHS)〕 が 与 え ら れ る 群Vaspinと イ ンス リ ン抵 抗 性:肥 田和 之,他18名 に分 け て 飼 育 し,10週 齢 と 同 様 の 負 荷 試 験 を施 行 し た. HFHS飼 育 下ICRマ ウ ス は,18週 齢 で 高 血 糖,高 イ ン ス リ ン血 症 と肥 満 を呈 し て い る が,rhVaspinを 投 与 す る こ と に よ り,ブ ドウ 糖 負 荷 試 験 に お い て120分 後 の 血 糖 値 を有 意 に 低 下 させ た(図4A).し か し,イ ン ス リ ン値 は変 化 せ ず,相 対 的 に 高 イ ンス リ ン血 症 の ま ま で あ っ た(図4B).イ ン ス リ ン 静 注 負 荷 試 験 に お い て STD飼 育 下 に お い てrhVaspinを 投 与 に よ り有 意 差 は 認 め な か っ た が,HFHS飼 育 下,18週 齢 で 肥 満 を 来 た して い るICRマ ウ ス 群 に お い てrhVaspinを 投 与 す る と溶 媒 を投 与 し た 群 に 比 較 し て 血 糖 値 は イ ン ス リ ン 腹 腔 内 注 入30分 後 か ら90分 後 の 間,有 意 に低 下 し た(図 4C).
Vaspinは
食 餌 誘 発 肥 満 マ ウ ス の 白色 脂 肪 組 織 の 遺 伝
子 発 現 プ ロ フ ァイ ル を 非 肥 満状 態 の遺 伝 子 発 現 に近 づ
け る効 果 を 有 す る
18週 齢 の3群
〔STD群,HFHS群,2週
間(16週 か
ら18週 に か け て週2回:計4回)rhVaspinを
腹 腔 内投
与 したHFHS群
〕の マ ウ ス の腸 間膜 脂 肪 組 織 と皮 下 脂
肪 組 織 か らそ れ ぞ れRNAを
分 離 してDNAチ
ップ解
析 を用 い た解 析 か ら,rhVaspinを 投 与 す る こ とに よ り
腸 間 膜 脂 肪 組 織 と皮 下 脂 肪 組 織 に お い てHFHSで
変
化 した遺 伝 子 発 現 の そ れぞ れ49.9%と52.8%で
非 肥 満
状 態 の 遺 伝 子 発 現 状 態 に 復 す る 効 果 が 示 さ れ た13).レ プ チ ン,レ ジ ス チ ン,TNF-α,GLUT4,ア デ ィ ポ ネ ク チ ン等 の イ ンス リ ン抵 抗 性 に 関 連 す る 遺 伝 子 発 現 も リ ア ル タ イ ムPCRを 用 い て 解 析 し た 結 果,rhVaspin を投 与 す る こ と に よ り同 様 な 結 果 が 得 られ た(図5A, B).ま た 体 系 的 な ク ラ ス タ ー 解 析 を し た 結 果14), HFHS群 とSTD群 の2群 は 樹 状 図 で 別 々 の 分 岐 に位 置 した が,rhVaspinを2週 間 投 与 し たHFHS群 の 腸 問 膜 脂 肪 組 織 と皮 下 脂 肪 組 織 は と も に,STD群 と同 じ 分 岐 上 に 位 置 し た(図5C). お わ り に Vaspinは 内 臓 脂 肪 組 織 か ら派 生 し,プ ロ テ ア ー ゼ 阻 害 活 性 を有 す る 因 子 で あ り,特 に 白 色 脂 肪 組 織 に働 き か け て,イ ン ス リ ン機 能 を高 め る こ と に よ っ て糖 尿 病 や 肥 満 症 と い っ た メ タ ボ リ ッ ク シ ン ドロ ー ム で み ら れ る特 有 の 異 常 を 改 善 さ せ る.本 研 究 の 知 見 が メ タ ボ リ ッ ク シ ン ドロ ー ム に お い て イ ン ス リ ン感 受 性 の 改 善 を 促 進 で き る プ ロ テ ア ー ゼ 阻 害 剤 抑 制 薬 の 治 療 へ の 原 動 力 と な り発 展 に つ な が る こ と を期 待 す る.文
献
1) Kunitomi M, Wada J, Takahashi K, Tsuchiyama Y, Mimura
Y, Hida K, Miyatake N, Fujii M, Kira S, Shikata K and
Makino H: Relationship between reduced serum IGF-I
A B
C
図5 Effect of vaspin on leptin, resistin, TNFa, GLUT4, and adiponectin in obese ICR mice fed with HFHS chow. Vaspin
administration reverses gene expression profile of WATs.
