[総説]遺伝子組換え技術を用いたバイオ産業の可能性: 沖縄地域学リポジトリ

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Title

[総説]遺伝子組換え技術を用いたバイオ産業の可能性

Author(s)

長嶺, 勝; 新川, 武; 橋本, 尚子; 新垣, 榮; 浦崎, 直也

Citation

南方資源利用技術研究会誌 = Journal of the society tropical

_{resources technologists, 21(1): 9-15}

Issue Date

2005-10-01

URL

http://hdl.handle.net/20.500.12001/14209

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遺伝子組換え技術を用いたバイオ産業の可能性

長嶺勝

1

､新川武

1

､橋本尚子

2

､新垣

柴 2

､浦崎直也

3

*琉球大学遺伝子実験センター '.㈱先端医学生物科学研究所2, 沖縄県農業試験場3

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Masaru NAGAMINEl,TakeshiARAKAWAl,Naoko HASIMOTO 2 SakaeARAKAXI2,Naoya URASAKI3

JCenterofMolecularBiosciencesUniuersilyoftheRyuhyus,

ZAduancedMedicalBiologicalScienceInstituteCo.,Ltd. 30hinawaPrefecturalExperimentStation

Keywords:植物ワクチン (plant-based vaccines),食べるワクチン (ediblevaccines),コレラ毒素B鎖

(choleratoxinB chain), トタンスジェニックサトウキビ (transgenicsugarcane),組み換え植物 (recombinantplant),DNAワクチン (DNA vaccines),プラスミドDNA (plasmid DNA)

はじめに

遺伝子組換え技術により他種生物由来の蛋白質を大量生産することが可能となった｡第二世代遺伝子転換作物の開発は､生理･免疫活性作用を持つ蛋白質の機能そのものに着目しており､生活習慣病予防効果､感染症予防効果が期待できる､一般消費者が求めるような機能を持つ作物の開発が第一の目的である｡私たちは以前､コレラ毒素B鎖 (CTB)遺伝子を発現させたトランスジェニック植物による食べるワクチンの可能性を示したが､現在は､腸管免疫組織への運搬体としてのCTBの果たす役割に注目している｡つまり､トランスジェニック植物で発現するCTBと病原体由来蛋白質の融合体はCTB の性質を利用して腸管粘膜リンパ組織に効率良く到達し､動物個体に病原体蛋白質に対する高い免疫応答を誘導することが期待される｡ ●沖縄県西原町千原1番地もうひとつの第二世代遺伝子転換作物として開発しているのは､サトウキビである｡トランスジェニックサトウキビが持つ優位性として､栄養体つまり茎を植え付けて栽培するので､花粉の飛散による自然生態系に影響を与えるというバイオハザードの危険性を回避することができる点で安全対策上優れている｡私たちはこの点に着目し､サトウキビへの有用遺伝子を導入する技術を開発し､トランスジェニック植物として遺伝子組み換えサトウキビを作出した｡さらに私たちは､遺伝子組換え技術を用いたバイオ産業として､遺伝子治療やDNAワクチンなど､医薬品として使用される高純度なプラスミドDNA を大量に作成する製造法を開発し､生産するシステムを構築している｡この方法による医薬品としてのプラスミドDNAを生産できる施設を先端医学生物科学研究所において､環境及び装置､運用手法を含めて整備を行っている｡このような新産業としてのバイオ産業は､高付加価値の製品を生産でき､輸送

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にコストがかかるハンディキャップがないので､沖縄県の離島としての不利な条件をクリアでき､容易に他のアジア諸国にも奪われることがない産業として期待できる｡

遺伝子組換え生物とその利用

近年の遺伝子組換え技術の発達により様々な生物からクローニングした遺伝子を大腸菌や酵母菌などの微生物や昆虫由来の細胞に組み込み､生物種の壁を超えて他種生物由来の蛋白質を大量生産することが可能となった｡それにより､本来の遺伝子を有する生物からの蛋白質精製に頼らざるを得ない状況から脱し､低コストで不純物の少ない組換え蛋白質を作り出し､その分子構造や機能解析を通じて工業や医学分野で応用できる生産技術を確立した｡例えば､今日の分子生物学の研究で用いられている酵素類のほとんどは､このような組換え生物を用いて生産されたものであり､組換え技術が今日までのバイオテクノロジーの基礎を築き上げてきたともいえるであろう｡しかし最近では､単細胞生物のみならず高等多細胞生物も組換え蛋白質のバイオリアクターとして有用であることが示され始めている｡例えば､牛､豚､山羊等の家畜動物に外来遺伝子を導入することによりトランスジェニック動物を作り出し､その血液や母乳､尿などに組換え蛋白質が分泌されるよう工夫した｢molecularfarming｣の手法は､様々な組換え蛋白質の発現､精製を可能にした｡このような動物バイオリアクターの出現は､植物を用いても同様なことが可能であることを暗示している｡現に､タバコやイネ､ジャガイモなどの作物に様々な遺伝子を導入し､機能性蛋白質や機能性物質の生産を目指すplantmolecularfarming(植物工場) の研究は､世界中の多くの研究者によって進められている｡

第一世代および第二世代遺伝子転換作物

米国を中心にして急速に開発から商品化まで進められてきた組換え作物は｢第一世代遺伝子転換作物｣とよばれ,機能性蛋白質そのものの有用性に着目した｢第二世代｣とは､その目的が異なるといえるであろう｡第一世代の作物の場合､機能性蛋白質の有用性よりも､むしろ､導入遺伝子によって作物の獲得する新しい性質に着目している｡例えば､商品名南方資源利用技術研究会誌｢フレーバ-セーバー｣で知られる日持ちのよいトマトは､実が熟するのを遅らせるために､ポリガラクチュロナ-ゼ遺伝子のアンチセンス鎖が導入されている｡その他にも､殺虫性蛋白質遺伝子の導入による害虫に強いジャガイモや､グリホサート耐性遺伝子導入による除草剤に強いダイズの開発などがある｡このような第-世代に属する作物の開発は｢増産｣を目的としており､農薬や害虫､ウイルスに対する抵抗性を高める性質を導入遺伝子により付加し､低農薬で高生産性を期待することが可能となる｡これに対し､第二世代に属する作物は､生理･免疫活性作用を持つ蛋白質の機能そのものに着目しており､先進国においては生活習慣病予防効果, さらに発展途上国における感染症予防効果が期待できる｡さらに､このような機能性蛋白質を産生する作物は､人間に対してだけでなく家畜動物に対しても同様な効果が期待でき､畜産や医学分野への貢献が期待されている｡第二世代遺伝子転換作物は､第一世代のそれと比較して､一般消費者が求めるような機能を持つ作物の開発が第-の目的である｡

コレラ毒素

B

鎖を利用した｢

食べるワクチ

ン｣開発

私たちは､そのひとつがワクチン開発であると考えているO農作物によって産生されるワクチンは､｢植物ワクチン (plant-basedvaccines)｣とよばれ､植物の可食部位にワクチンを発現させ､それを直接食べることによって免疫効果を期待するものは､｢食べるワクチン (ediblevaccines)｣とよばれる｡私たちは以前､組み換え植物によるコレラ毒素B鎖 (CTB)遺伝子の発現系を開発し､トランスジェニック植物による食べるワクチンの可能性を示したが､現在は､抗コレラ毒素ワクチンとしてのCTBというよりもむしろ､腸管免疫組織への運搬体としての CTBの果たす役割に注目して研究を進めている｡ CTB蛋白そのものは経口摂取しても毒性はなく､粘膜細胞表面のレセプター (GM1-ganglioside)に高い親和性を有するため､粘膜免疫組織と親和性の低い蛋白質抗原をCTBとの融合蛋白として植物に発現させれば､ワクチン抗原の免疫原性を高めることが可能となる｡つまり､トランスジェニック植物で発現するCTBと病原体由来蛋白質の融合体は CTBの性質を利用して腸管粘膜リンパ組織に効率

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0-良く到達し､動物個体に病原体蛋白質に対する高い免疫応答を誘導することが期待される｡

トランスジェニックサトウキビの開発

もうひとつの第二世代遺伝子転換作物として開発しているのは､医薬品などの有用蛋白質を､組換え植物で生産するというものである｡治療用抗体やアルブミンなど血液や動物の組織などを利用して製造されている蛋白質性の医薬品は､エイズウイルスや

BS

E

などの感染の危険性が問題になっている｡これらを､植物で生産することにより､安全で低コストによる安定な原料供給が可能となることが期待される｡沖縄県において優位性がある植物としてサトウキビに着目し､トランスジェニックサトウキビを作製し､蛋白生産の可能性を検討している｡サトウキビは栄養体つまり茎を植え付けて栽培するので､花粉の飛散による自然生態系に影響を与えるというバイオハザードの危険性を回避することができる点で安全対策上優れていると考えられる｡さらに､サトウキビを利用する上での利点として､成長が早く一年を通して栽培ができ､生産性が高いことと､沖縄県でサトウキビに関して育種､栽培､収穫技術のシステム化が確立していることがあげられる｡現在､蛋白質を生産するという目的に適応した品種の選抜について沖縄県農業試験場を中心に共同研究を行っている｡サトウキビに有用遺伝子を導入する技術は､その遺伝子を組み込んだアグロバクテリアという微生物を利用する方法を用いている｡つまりサトウキビ植物体の生長点 (図-

1 ,

a

｣二) から誘導したカルス細胞 (図- 1,a.下) へ有用遺伝子をトランスフェクション法により導入する｡つぎに､遺伝子導入されたカルス細胞を増殖させ､有用遺伝子が発現している細胞を､抗生物質耐性能を活用して選択 ( 図-1,b.) していく｡これらのカルス細胞株を､増殖再分化させて植物体へと再生させる (図-1,C,d,). このようにして有用遺伝子が発現しているトランスジェニック植物としての遺伝子組み換えサトウキビを作出する (図-1,e,∫,)｡ここまでの操作は､物理的封じ込め施設の中で植物を取り扱う｡具体的には安全キャビネット中で操作し､シャーレやプラスチック容器の中でカルス細胞を増殖させ､分化誘導後はファイトトロンという人工気象室環境下で無菌的に栽培する｡現在､この段階までの開発が､琉球大学遺伝子実験センター､沖縄県農業試験場バイテク室､先端医学生物科学研究所の産学官共同研究 (平成

1

6

年度

､1

7

年度)で進められている｡

遺伝子組換え植物の安全性試験と開発にお

ける課題

このように作出された遺伝子組み換え植物は､すぐには一般の畑で栽培することはできない｡遺伝子組み換え植物の､バイオハザードに関する安全性試験を行い､認可承認を受けた後に栽培することが可能となる｡安全性試験はそれぞれ組み換えた植物種や組み換えた遺伝子によって個別に実施されるが, 共通した試験項目は以下のようなプロセスで行われる｡まず､遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律 (平成十五年法律代九十七号)および､遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律第三条の規定に基づく基本的事項 (財務省､文部科学省､厚生労働省､農林水産省､経済産業省､環境省､告示第一号) に基づいて､実験室と閉鎖系温室下で栽培された組み換え植物の特性や非組み換え植物との性質の比較など､表現形の特徴や､植物生理学的性質などを調査し､それらが自然生態系に与える影響について評価する｡次に遺伝子組替え生物等の第 -種使用等による生物多様性影響評価実施要領 (財務省､文部科学省､厚生労働省､農林水産省､経済産業省､環境省､告示第二号)及び第

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種使用規程承認組替え作物栽培実験指針 (農林水産省指針) に基づき､隔離圃場での栽培において､他の生物への影響や雑草性､近縁種との交雑性など環境安全性の評価を行う｡一般の露地栽培に近い環境だが植物体が圃場外に搬出されるようなことがなく､大雨などで流出されないような囲いなどの対策を施した､管理できる条件下で植物体を栽培し､このような環境下でさらにバイオハザード上の安全性の試験を行う｡ここまでの安全性試験は国が管理する試験場など､法律的に決められた条件を備えた整備された施設で行われることになる｡また､遺伝子組み換え体を家畜の飼料に利用する場合は､飼料としての栄養成分の比較や導入蛋白質の安全性を評価する｡この段階で､安全性が確認されたものについては､一般圃場での商業栽培や生産された農作物の輸入が認可される｡さらにその組み換え体による生産物が､食品を

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目的とする場合は､厚生労働省において食品衛生法に基づく指針により食品としての安全性の評価を受けなければならない｡すなわち､食品としての栄養成分の比較や導入蛋白質のアレルギー誘発性､毒性試験などの項目についての安全性を細かく評価する

a.

生長点から誘導したカルス

C.

ハイグロマイシン耐性カルスからのシュート形式

e.

遺伝子組み換え植物体南方資源利用技術研究会誌ことになる｡上に述べた一般的な開発のほかに､遺伝子組み換え体固有の開発に向けて行うべきことがある｡例えば､治療用抗体蛋白､アルブミン蛋白､コラーゲン蛋白などの遺伝子が組み換え植物体で効率よく発現 b.ハイグロマイシンによる選抜 d.遺伝子導入細胞からの再生千.遺伝子組み換え体の馴化､栽培図- 1.遺伝子組み換えサトウキビの作出

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2-し､その有用遺伝子から発現した有用蛋白質が､医薬品として有効な生理活性を持ち､産業としての生産性が達成できるのかなどの課題は多い｡たとえば以下の点が挙げられる｡ 1,有用外来蛋白質が植物体の細胞､組織の中で安定的に存在しうるか､ 2, 植物体のどの組織､部位で効率よく発現､蓄積しているのか､ 3,植物体の適切な栽培法はどうか､4, 収穫はいつ頃､どのように行われるか､ 5,植物体からの蛋白の粗抽出法の確立､ 6,蛋白の精製法の確立､ 7,工業的生産技術､設備の開発､医薬品としての精製技術の確立､ 8､医薬品としての安全性評価､臨床試験､などである｡そのような気が遠くなるような研究開発は､数年間で達成するのは困難で､少なくとも

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数年はかかると思われる｡しかも, 多くの専門的な機関や企業が関与する必要があることは当然であろう｡しかしこの技術開発が達成された際に想定される､産業としての可能性は､サトウキビ生産にずっと関わってきた沖縄県にとって非常に大きいものであることは明らかである｡

遺伝子治療･DNA ワクチン治療のための

プラスミドDNA大量生産システムの開発

さらに私たちは､遺伝子組換え技術を用いたバイオ産業として､遺伝子治療やDNA ワクチンなど､医薬品として使用される高純度なプラスミドDNA を大量に作成する製造法を開発し､生産するシステムを構築している｡プラスミドとは､大腸菌や枯草菌などの細胞質中にあり､自律して増殖できる二本鎖環状DNA で､細胞核としての染色体 DNA とは区別される｡そのプラスミドDNA に試験管の中で操作する､いわゆる組み換えDNA技術を用いて､インスリン､成長因子､インターフェロンなどの特殊な物質を作る遺伝子DNA をつなぎあわせ､そのプラスミドDNA を､大腸菌や枯草菌に導入して､その菌を培養すると､その菌がインスリンや成長因子やインターフェロンなどの目的とする物質を作るようになる｡この組み換えDNA技術は､医療の分野では､このプラスミドDNA に､ヒトや､動物に導入したい遺伝子DNA をつなぎ､ヒトや動物の体の細胞に導入するという､いわゆる遺伝子治療や DNA ワクチン治療に用いられる｡遺伝子治療とは既存の治療方法では有効性が期待できない疾患に対して､遺伝子自身もしくは遺伝子を導入した細胞を投与することで症状の改善や治癒を目指す治療法である｡遺伝子治療では遺伝子を細胞に導入する手段としてベクターと呼ばれる遺伝子の運び役に治療目的の遺伝子を組み込んで使用する｡そのベクターとして､アデノウイルスやレトロウイルスが用いられてきたがそれらよりも､安全性の優れたベクターとして最近プラスミドDNA ベクターが注目されている｡ DNA ワクチン治療は､遺伝子治療というより､核酸医薬と表現される｡つまりDNA を医薬として投与するという意味で､より安全である方法と考えられている｡生きた弱毒病原ウイルスなどの生ワクチンよりも安全に､そして不活化ワクチンよりも強力に免疫誘導できるものとして考案された新しい免疫法として用いられる｡その原理として,病原体の蛋白質の一部をコードする遺伝子DNA をプラスミドDNA につないで､直接体内に接種することにより細胞内で病原体蛋白質の一部を発現させる｡この蛋白は病原体由来ではあるが､一部であるために､病原性はなく､しかし免疫を誘導できる抗原決定基としての機能を持っているので､病原蛋白質に対する免疫ができるというメカニズムである｡私たちはこの遺伝子治療やDNA ワクチン治療に用いられるプラスミドDNA を､大腸菌を大量に培養し､それから高純度に精製する新しい技術を開発した｡現在､我が国では､遺伝子治療やDNA ワクチン治療に医薬品として使用できる高純度なプラスミドDNA を大量に生産精製できる工業的生産システムは構築されておらず､研究機関がプラスミド DNA を用いて遺伝子治療などを臨床治験する際も､その供給を海外に依存せざるを得なくなっている｡私たちが開発しているシステムは､国内ではじめて､遺伝子治療などの医療用に用いられるプラスミド DNA を工業的に生産しようというものである｡このプラスミドDNA の生産法は､従来より実験室レベルでの､手作業で､遠心分離器を多用するという､大量に生産するには不向きな方法で精製を行ってきた｡この遠心分離器を用いる方法をそのまま用いると､遠心分離する前後に遠心チューブから別の容器に移す作業が必要になりチューブのフタを開けるたびに外界の環境にさらされ､操作中に外界からのコンタミネーションの危険にさらされることになり､それを防ぐために作業をすべて安全キャビネッ

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ト内で行うか又は作業者が完全防塵服を着て､室内を完全なクリーンルーム環境にする必要があり､操作が手作業で効率が悪く､大量処理が困難となる｡しかも精製工程には数ステップも遠心分離法を用いなければならないのである｡この間題を解決するために､これまで遠心分離法を用いていたすべてのステップをTFF膜を用いた波過方法に置き換えることにより､まったく新しい､効率的な方法を開発することに成功した｡琉球大学遺伝子実験センターと先端医学生物科学研究所とでこのプロジェクトを平成12年度コンソーシアム事業として受託し以下のような開発を行った｡ TFF膜とは､限外渡過膜をサンドイッチ状に

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枚を平行に重ね､その間隙に源過しようとする溶液を流し波液は､サンドイッチ状の膜の外側に流すという方法で､膜と平行に膿過しようとする溶液が流れることで流れが遮られることなく､目詰まりが起こりにくく､溶液を巡回させることにより効率よく濃縮できる｡この限外膿過膜のポアサイズを選ぶことにより､目的の物質を分子の大きさにより分離することができ､そのことにより､遠心分離法の沈降係数の違いによる分離方法を､この限外波過法に置き換えることができるのである｡また､膜と直角の方向に溶液がしみ出すために､源液を異なる経路で集めることができる｡たとえば､この膜が

2

0 c

mX2

5 c

m

の大きさで

2

枚一組とすると

､1

0

平方センチメートル/組となり､これを

1

0

組並列に重ねると､

1

平方メートルの面積をもつカセットとなる｡原理的にはこのカセットをいくらでも並列につなぐことができるので､大量の溶液を短時間に効率よく源過できる｡この方法により､いままで開放系､つまり遠心チューブのフタを開けて別の容器に移す操作のかわりに､閉鎖系､つまり溶液や濃縮液を閉鎖したパイプを用いて次の行程に移動させることができるようになった｡このことは､開放系での操作の際に必要とされた外界からのコンタミネーションを防ぐための対策が不必要となり､より高純度な精製が容易に可能となった｡それのみではなく､それまでの限外滅過膜法では蛋白質の分子の大きさとボアサイズの関係のみが明らかになっていたが､私たちは､プラスミドDNAという紐状の分子を分離するための限外波過法を新規に開発することに成功した. この開発により､TFF膜を用いた波過方法を用南方資源利用技術研究会誌いる事により高純度なプラスミドDNAを大量に作成することができ､これまで開放系で行われていた操作を､菌体の培養から､濃縮､バッファー交換､アルカリによる溶菌､酸による中和､デブリスの除去､宿主由来の蛋白除去､プラスミドDNAの濃縮､カラムによる精製まで､閉鎖系で連続して行う方法を確立した｡この方法は連続した閉鎖系で行うため装置の小型化が計る事ができ､またTFF膜は膜面積の増加をカッセトの数を増やす事により簡単に行う事が出来る優れた方法である｡この新規な分離精製法を主な請求項目とする特許を国内及び米国に申請し､すでに特許を取得した｡ (｢ベクター精製用装置及び方法｣特許第3547715号

DEVICE AND PROSESS FOR PURIFYING VECTORS米国特許番号US6773913B2) 現在この方法による医薬品としてのプラスミド DNAを生産できる施設を先端医学生物科学研究所において､環境及び装置､運用手法を含めて整備を行っているところである｡この整備計画は 3年間で完成させる予定で､平成16年度は､改正薬事法の基準を満たした

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リットル規模の培養タンクを持つ大量培養装置を設置している｡それには､クリーンな空気製造装置､純水製造装置､クリーン蒸気供給装置､遺伝子組み換え体滅菌処理装置､HEPAフィルターを用いた空調換気システム､組み換え微生物を取り扱うための条件を満たしたP2レベルの培養室が含まれている｡今後､平成17年度はTFF膜を用いた祖精製装置を完成させ､平成

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年度に､高純度DNA精製装置､製剤封入システムを完全クリーンルーム内に設置する計画で､これらが完成すれば改正薬事法に定められた基準をクリアすることができ､医薬品レベルのDNA製剤が生産できるようになる｡

おわ Uに

私たちは､沖縄県ではじめての､遺伝子組み換え技術を用いたバイオ産業の成功例を築くことを目指している｡新産業としてのバイオ産業は､高付加価値の製品を生産でき､輸送にコストがかかるハンディキャップがないので､沖縄県の離島としての不利な条件をクリアでき､容易に他のアジア諸国にも奪われることがない産業として期待できるのではないだろうか｡ - 1

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4-参考文献

1) Arakawa,T., Y

u,

J.

, Langridge, W.H.

R

.

Synthesis of a cholera toxin B subunit -rotavirus NSP4 fusion protein in potato.

PlantCellReport,20:3431348,2001.

2)Arakawa,T.,Yu,J.,Chong,D.K.X.,Hough,J.,

Engen,P.C.,Langridge,W.H.氏.A plant-based cholera toxinBsubunit-insulin fusion protein

protect against development of autoimmune diabetes.Nat.BiotechTWl.16:934-938,1998. 3) 平成11年度地域コンソーシアム研究開発事業｢ベンチャー企業支援型地域コンソーシアム開発 (中小企業創造基盤型)｣｢簡便化高純度大型プラスミド抽出･精製法の開発｣成果報告書､平成13年3月､新エネルギー･産業技術総合開発機構､委託先財団法人南西地域産業活性化センター

[総説]遺伝子組換え技術を用いたバイオ産業の可能性: 沖縄地域学リポジトリ

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