Salmonella enterica subsp. enterica serovar 4：b：- 株の解析
1）
国立感染症研究所，
2）神奈川県衛生研究所，
3）滋賀県衛生科学センター，
4）秋田県健康環境センター（
＊現 株式会社日吉）
泉谷 秀昌
１）黒木 俊郎
２）林 賢一
３）＊齊藤志保子
４）八柳 潤
４）今野 貴之
４）大西 真
１）（平成 28 年 4 月 26 日受付）
（平成 28 年 6 月 29 日受理）
Key words : Salmonella, serotype, multilocus sequence typing（MLST）, pulsed-field gel electrophoresis（PFGE）
要 旨
サルモネラは代表的な食中毒起因菌である．近年血清型 Typhimurium に由来すると考えられる S. I 4：
i：-などの単相菌の報告が増加している．本研究では，S. I 4：b：-に着目し，試験菌株 10 株について MLST および PFGE による遺伝子解析を行い類似血清型株 34 株（Paratyphi B，Paratyphi B var Java，Schleissheim および II 4：b：-）と比較した．試験した I 4：b：-株（単相株）10 株は全て hin 陰性であり，6 株は fljB 陰 性であった．MLST 解析により，44 の供試菌株は 12 の型（ST），6 つの ST complex（STC）に分かれた．
STC は PFGE クラスターと相関性が見られた．単相株は 3 つの STC（19，32，155）に含まれ，既報の ST データベースのデータも考慮するといずれも Paratyphi B var Java（およびその単相菌）の STC に含まれ た．これらの結果から，今回試験した単相株はいずれも多様な Paratyphi B var Java に由来するものと推 定された．本単相株の抗原構造は血清型 Schleissheim などとも類似しており，遺伝子解析の併用は，菌株 の由来の推定に有用であると考えられた．
〔感染症誌 90：652〜656，2016〕
序 文
サルモネラは国内外を問わず代表的な食中毒起因菌 である．サルモネラは Salmonella enterica および Salmo- nella bongori の 2 菌種からなり，前者は 6 つの亜種（en- terica （I），salamae （II），arizonae，diarizonae，houtenae，
indica）から成る．サルモネラには O 抗原（リポ多糖）
および H 抗原（鞭毛）から規定される 2,500 種以上の 血清型がある
１）．H 抗原は多くが 2 相性であり，この 相変換は鞭毛を構成するフラジェリンタンパク質を コードする fliC および fljB 遺伝子のどちらか一方の発 現が hin 遺伝子によりコードされるインベルターゼに よって可逆的に選択されることによる
２）３）．
近年，S. enterica 4：i：-など，2 相性を欠いたサル モネラの報告が相次いでいる．また，血清型別を補完 するツールの一つとして multilocus sequence typing
（MLST）が注目されている
４）．本研究では，S. enterica 4：b：-を主な対象とし，MLST，パルスフィールド
ゲル電気泳動（PFGE），hin 遺伝子の欠損について解 析したので報告する．
材料と方法
1．菌株
サルモネラ 44 株を供試した．8 株は血清型参照株，
残り 36 株のうち 29 株はヒト由来株（1976〜2013 年 分離），7 株は非ヒト由来株（うち 6 株はカメ由来株，
1 株はカメ飼育水由来株；2007〜8 年分離）であった．
2．血清型別および生化学性状試験
市販の診断用免疫血清（デンカ生研）を用いて定法 に従い実施した．酒石酸利用性試験およびゼラチナー ゼ試験は Jordanʼs tartrate agar および nutrient gela- tin を用い定法に従い実施した．
3．MLST
既報
４）に従い，housekeeping 遺伝子（aroC，dnaN，
hemD，hisD，purE，sucA，thrA）を PCR で 増 幅 し，
遺伝子配列を決定後，MLST データベース（http://
mlst.warwick.ac.uk/mlst/dbs/Senterica/）を検索 し，
シークエンス型（ST）を決定した．
原 著
別刷請求先：（〒162―8640）東京都新宿区戸山 1―23―1 国立感染症研究所細菌第一部 泉谷 秀昌
Table Distrubution of serovars and STs of the testing strains used in this study.
STC 5 19 32 155 76 214
Total
ST 43 86 149 307 88 127 42 423 1,838 2,923 1,833 276
Serovar, fljB Origin h h ref ref h nh h nh h ref h nh nh ref ref
I4: b: − 4 1 3 1 1 10
fljB− 1 3 3 1 6
fljB＋ 4 4
Paratyphi B 3 4 7
Paratyphi B Java 16 1 1 3 1 2 1 25
Schleissheim 1 1
II 4: b: − 1 1
Total 16 3 4 1 1 3 5 2 1 1 3 1 1 1 1 44
＊h, Human; nh, Non-human; ref, Reference
4．fljB および hin 遺伝子の有無および PFGE につ いては，既報
５）〜７）に従い実施した．
結果と考察
供試した血清型参照株は，Paratyphi B（抗原構造 4：b：1,2，酒石酸利用性試験陰性）が 4 株（運動性 陰性株 1 株を含む），Paratyphi B var Java（4：b：1,2，
酒石酸利用性試験陽性）が 2 株（単相性株 1 株を含 む），Schleissheim（4：b：-）が 1 株，S. II 4：b：-が 1 株であった．
残る 36 株のうち 3 株が Paratyphi B，23 株が Para- typhi B var Java，10 株が S. I 4：b：-であった．Para- typhi B は 3 株ともヒト由来株であった．Paratyphi B var Java は 23 株中 18 株がヒト由来株であった．
S. I 4：b：-は 10 株中 8 株がヒト由来株であった（Ta- ble）．
S. I 4：b：-は 10 株すべて酒石酸利用性試験陽性で あった．また，S. I 4：b：-株は 10 株とも hin 遺伝子 陰性であった．fljB は 4 株が陽性であり，これらはヒ ト由来株であった．増幅された fljB 断片の塩基配列は Paratyphi B（/var Java）のそれと一致した．
供試菌株を MLST により解析した結果， S. I 4：b：- は，ST127 が 4 株（いずれもヒト由来），ST423 が 3 株（いずれもヒト由来），ST42（ヒト由来），ST1838
（非ヒト由来），ST2923（非ヒト由来）が 1 株ずつで あった（Table）．
Paratyphi B は参照株，ヒト由来株ともすべて ST86 であった．Paratyphi B var Java は，16 株が ST43（い ずれもヒト由来），1 株が ST149（参照株），1 株が ST 307（ヒト由来），3 株が ST88（いずれも非ヒト由来），
3 株が ST127（1 株がヒト由来，2 株が非ヒト由来），
1 株が ST42（参照株）であっ た．Schleissheim 参 照 1 株は ST1833， S. II 4：b：-参照 1 株は ST276 であっ た．
供試菌株の MLST 解析の結果に基づく minimum
spanning tree を Fig. 1に示す．MLST データベース において，ST43，86，149 および 307 は ST complex
（STC）5 を，ST42 および 423 は STC32 を，ST88 お よ び 127 は STC19 を，ST276 は STC214 を，そ れ ぞ れ形成している．既存のデータベースの ST に対して，
ST1838 が STC155 に含まれる ST404 などと，ST1833 が STC76 に含まれる ST280 などと 1 遺伝子座違いで あった．このことから ST1838 およびその 1 遺伝子座 違いである ST2923 は STC155 に，ST1833 は STC76 に含まれると推定された．
S. I 4：b：-は，4 株が STC19 に，4 株が STC32 に，
2 株が STC155 に含まれた（Table）．fljB 陽性 S. I 4：
b：-は，STC19 に含まれた．
XbaI-PFGE パターンに基づくクラスター解析を実 施したところ，ほぼ STC に相当するクラスターが観 察された（Fig. 2）．STC5 は多様な PFGE パターンを 示し，類似性 70% を基準に 3 つの比較的大きなクラ スターに分かれた（CL1，2 および 3）．うち 1 つ（CL 3）は Paratyphi B から成っていた．STC19 は単一の PFGE クラスターを形成した．Schleissheim お よ び S. II 4：b：-参照株はそれ以外の株とは大きく異なり，
類似性は約 40% であった．
Schleissheim は 抗 原 構 造 と し て は 4：b：-だ が，
Kauffmann-White のスキームにおいてゼラチナーゼ 試験陽性となっていることから，Schleissheim 参照 1 株ならびに S. I 4：b：-10 株についてゼラチナーゼ試 験を実施したところ，Schleissheim 参照株のみが陽性 となった．
本研究において，サルモネラの血清型の補完ツール としていくつかの遺伝的解析を実施した．hin 遺伝子 は単相菌試験菌株においてすべて陰性であった．また，
fljB 遺伝子は STC32 および 155 の株では陰性であっ
た．本法は単相性 S. Typhimurium（S. I 4：i：-）の
迅速試験として開発されたものであるが，他の血清型
Fig. 1 MLST-based minimum spanning tree of strains used in this study.
The sequence types (ST) and ST complex (STC) are indicated. A circle shows each ST. The size of the circle corresponds to the number of strains included. Each STC comprising two or more STs is displayed as a shadow. The number on the branch shows the number of different loci between the circles. STC76 and STC155 were deduced from the sequence types in the public database (http://mlst.warwick.ac.uk/mlst/dbs/Senteri- ca/).
においても，相誘導試験と並行して実施することで単 相菌の試験の迅速化に寄与すると考えられた．
MLST 解析は通常系統解析に利用されるが，サル モネラでは血清型との相関からその有用性が示唆され ている
４）．本研究でも Paratyphi B はすべて ST86 と なり，逆にそれ以外の株は ST86 とはならなかった．
Paratyphi B var Java では STC5，19 および 32 が，
S. I 4：b：-では STC19，32 および 155 が検出された．
また既報から STC155 も Paratyphi B var Java 関連 であることが示されている
４）．このことから，S. I 4：
b：-が Paratyphi B var Java と関連することが示唆さ れる．
PFGE 解析と MLST 解析の結果は比較的よく相関 していた．特 に STC は PFGE パ タ ー ン で 70% の 類
似性を基準にしたクラスターとほぼ一致していた．
STC5 は本研究でも 4 つの ST を含み，PFGE クラス ターでも 3 つのクラスターに分かれ，多様であること が示された．Paratyphi B は単一の ST かつクラスター であったが，Paratyphi B var Java は STC も複数に またがり，PFGE クラスターも多様であることから，
由来も多様であることが示唆された．
S. I 4：b：-は抗原構造のスキームに照合すると S.
Schleissheim と な る が，本 研 究 の S. I 4：b：-は Schleissheim 参照株とは MLST 解析および PFGE 解 析において大きく異なった．さらにゼラチナーゼ試験 が陰性であったことから Schleissheim ではなく他の 血清型に起源をもつことが推測された．
一方で本研究における S. I 4：b：-は，MLST およ
Fig. 2 Clustering analysis of XbaI-PFGE patterns. Corresponding strain no. (R, H and NH indicate reference, human and non-human strains, respectively), ST, STC, serovar or an- tigenic formula, and major clusters (CL) are indicated on the right. The PFGE patterns were analyzed using BioNumerics software (Applied Maths, Belgium) using the Dice co- efficient and UPGMA clustering with a tolerance of 1.2 %.
び PFGE 解析から Paratyphi B var Java と関連して いることが強く示唆された．すなわち Paratyphi B var Java と同様，複数の STC および複数の PFGE ク ラスターを示しながらも，それらを Paratyphi B var Java と共有していた．この傾向は特に STC において 顕著であった．また，陽性株の fljB 遺伝子配列が 1,2 抗原を有する Paratyphi B（/var Java）のそれと同 じであったこと，酒石酸利用性試験陽性であったこと などから，本研究における S. I 4：b：-は Paratyphi
B var Java に由来し hin 遺伝子（および fljB 遺伝子）
を欠失したために単相菌になったものと考えられる．
STC32 および 155 がそれぞれヒト由来株，非ヒト 由来株で偏って検出され，両コンプレックスに属す株 は fljB 陰性を示すなど，由来によって偏りが見られる が，試験菌株が増えることで今後傾向が明らかになる と考えられる．
近年，2 相目を欠いたサルモネラが報告されるよう
になっている．血清型は抗血清によって規定されるこ
とは言うまでもないが，単相菌においては遺伝的背景 を調べることで由来を推定することが肝要と考えられ る．
謝辞：菌株を供試等本研究に協力していただきまし た神奈川県衛生研究所 石原ともえ先生，滋賀県衛生 科学センター 石川和彦先生，福島敬介先生，船橋市 立医療センター 長野則之先生をはじめとした関係機 関に深謝いたします．本研究は厚生労働科学研究費補 助金（H25―食品―一般―014，H27―食品―一般―007，H27―
新興行政―一般―002）等の補助を受けて実施された．
利益相反自己申告：申告すべきものなし
文 献1
）Patrick AG, Weill F-X：Antigenic forumulae of the Salmonella serovars（9
thed）. Institut Pas- teur, Paris, 2007.
2
）Johnson RC, Simon MI：Hin-mediated site- specific recombination requires two 26 bp re- combination sites and a 60 bp recombinational enhancer. Cell 1985；41：781―91.
3
）Yamamoto S, Kutsukake K：FljA-mediated posttranscriptional control of phase 1 flagellin expression in flagellar phase variation of Salmo-
nella enterica serovar Typhimurium. J Bacteriol 2006；188：958―67.
4
）Achtman M, Wain J, Weill FX, Nair S, Zhou Z, Sangal V, et al.：Multilocus sequence typing as a replacement for serotyping in Salmonella en- terica. PLoS Pathog 2012；8：e1002776.
5
）Tennant SM, Diallo S, Levy H, Livio S, Sow SO, Tapia M, et al.：Identification by PCR of non- typhoidal Salmonella enterica serovars associated with invasive infections among febrile patients in Mali. PLoS Negl Trop Dis 2010；4：e621.
6
）Soyer Y, Moreno Switt A, Davis MA, Maurer J, McDonough PL, Schoonmaker-Bopp DJ, et al.：
Salmonella enterica serotype 4,5,12 : i : -, an emerg- ing Salmonella serotype that represents multiple distinct clones. J Clin Microbiol 2009；47：
3546―56.
7
）Ribot EM, Fair MA, Gautom R, Cameron DN, Hunter SB, Swaminathan B, et al.：Standardiza- tion of pulsed-field gel electrophoresis protocols for the subtyping of Escherichia coli O157 : H7, Salmonella, and Shigella for PulseNet. Foodborne Pathog Dis 2006；3：59―67.
Molecular Characterization of Salmonella enterica subsp. enterica Serovar 4：b：-
Hidemasa IZUMIYA
１）, Toshiro KUROKI
２）, Ken-ichi HAYASHI
３）, Shioko SAITO
４）, Jun YATSUYANAGI
４）, Takayuki KONNO
４）& Makoto OHNISHI
１）1)
