北海道医療大学学術リポジトリ
2 型糖尿病を有する歯周炎患者における Porphyromonas gingivalisとMnSODの関係
著者 渡邉 裕之
学位名 博士（歯学）
学位授与機関 北海道医療大学
学位授与年度 平成29年度 学位授与番号 30110甲第299号
URL http://id.nii.ac.jp/1145/00064594/
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Porphromonas gingivalis MnSOD
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【 諸 言 】
歯 周 炎 は P o r p h y r o m o n a s g i n g i v a l i s ( P . g i n g i v a l i s ) や
A g g r e g a t i b a c t e r a c t i n o m y c e t e m c o m i t a n s ( A. actinomycetemcomitans) な ど の 歯 周 病 原 細 菌 が 関 与 し た 慢 性 炎 症 性 疾 患 で あ り ， 発 症 と 進 行 に は 遺 伝 的 ， 環 境 的 リ ス ク フ ァ ク タ ー が 関 与 し て い る と 考 え ら れ て い る ． と り わ け 糖 尿 病 は 歯 周 炎 の リ ス ク フ ァ ク タ ー で あ り ， 血 糖 コ ン ト ロ ー ル の 不 良 が 歯 周 炎 の リ ス ク を 上 昇 さ せ る こ と が 明 ら か と な っ て い る ． ま た 歯 周 炎 が 血 糖 コ ン ト ロ ー ル の 不 良 を も た ら す こ と も 報 告 さ れ ， 歯 周 炎 と 糖 尿 病 が 相 互 に 影 響 を 与 え て い る こ と が 注 目 さ れ て い る ．
Reactive oxygen species (ROS) の コ ン ト ロ ー ル は 生 体 の 恒 常 性 を 維 持 す る 上 で 重 要 で あ り ， R O S の 上 昇 は 生 物 の 寿 命 を 短 縮 す る こ と が 知 ら れ て い る ． 生 理 的 な 状 態 に お い て R O S は 細 胞 が グ ル コ ー ス を 取 り 込 ん で エ ネ ル ギ ー と し て 利 用 す る 過 程 で 産 生 さ れ る ． し か し 感 染 症 で は 多 量 の ROS が 産 生 さ れ ， 殺 菌 の た め に 用 い ら れ る ． 糖 尿 病 を 有 す る 歯 周 炎 患 者 で は ， グ ル コ ー ス の 代 謝 異 常 に 加 え て 歯 周 病 原 細 菌 の 感 染 が 存 在 す る た め ， 多 量 の ROS の 産 生 が 示 唆 さ れ る が ， 生 体 内 で 発 生 す る ROS を 直 接 測 定 す る こ と は 困 難 で あ り ， こ れ ま で 糖 尿 病 を 有 す る 歯 周 炎 患 者 に 対 す る ROS が 与 え る 影 響 に つ い て は 十 分 に 明 ら か に な っ て い な い ．
Manganese superoxide dismutase (MnSOD) は 細 胞 内 で 発 生 す る ROS を 無 毒 化 す る 主 要 な 抗 酸 化 酵 素 で あ り ， 生 体 の 抗 酸 化 シ ス テ ム の バ ラ ン ス の 維 持 に 寄 与 し て い る ． 血 清 中 の MnSOD は 高 齢 者 で 上 昇 す る こ と が 報 告 さ れ て お り ， 老 化 に よ る 活 性 酸 素 の 増 加 に 伴 い 血 清 MnSOD が 上 昇 す る こ と が 示 唆 さ れ て い る ．
本 研 究 で は 糖 尿 病 患 者 の 血 清 MnSOD と 歯 周 炎 の 関 係 を 明 ら か に す る こ
と を 目 的 と し て 糖 尿 病 患 者 と 非 糖 尿 病 患 者 を 対 象 に 血 清 MnSOD 活 性 を 検
討 し た ． さ ら に 血 清 MnSOD の 産 生 細 胞 で あ る 単 球 系 細 胞 の MnSOD 産 生 に
対 し て ， グ ル コ ー ス 濃 度 と P . g i n g i v a l i s 刺 激 が 与 え る 影 響 を 明 ら か に す
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る こ と を 目 的 と し て ， ヒ ト 単 球 系 細 胞 株 を 用 い て P . g i n g i v a l i s L P S 刺 激 に よ る M n S O D 産 生 機 構 を 検 討 し た ．
【 材 料 と 方 法 】
1. 糖 尿 病 患 者 の 血 清 MnSOD と 歯 周 炎 の 関 係
被 験 者 は 北 海 道 医 療 大 学 病 院 歯 科 に 通 院 す る 糖 尿 病 患 者 を 糖 尿 病 群 (n = 76) と し て ， 非 糖 尿 病 患 者 を コ ン ト ロ ー ル 群 (n = 78) と し た ． 歯 科 検 査 と し て 被 験 者 の 現 在 歯 数 ， Probing pocket depth (PPD) ， Bleeding on probing (BoP) を 測 定 し た ． 被 験 者 の 唾 液 を 採 取 し ， 唾 液 中 の DNA を 抽 出 し た ． P.
gingivalis に 特 異 的 な プ ラ イ マ ー を 用 い て Quantitative polymerase chain reaction (qPCR) を 行 っ た ． 既 知 の P. gingivalis 細 菌 数 を 陽 性 対 象 と し て 段 階 希 釈 し て 測 定 し ， 標 準 曲 線 を 作 成 し ， 検 体 の 細 菌 数 を 算 出 し た ． ま た ， 血 液 検 査 と し て 血 清 中 の LDL コ レ ス テ ロ ー ル ， HDL コ レ ス テ ロー ル ， 中 性 脂 肪 ， 空 腹 時 血 糖 ， HbA1c を 利 用 し た ． 被 験 者 の 血 液 を 採 取 し ， 血 清 を 分 離 し て MnSOD を 測 定 し た ．
2. 異 な る グ ル コ ー ス 濃 度 と P . g i n g i v a l i s が ROS の 産 生 細 胞 で あ る 単 球 系 細 胞 の MnSOD 産 生 に 対 し て 与 え る 影 響
ヒ ト 単 球 系 細 胞 細 胞 (THP-1 細 胞 ) を グ ル コ ー ス 濃 度 （ 100 ， 200 ， 300mg/dl ） の 異な る 10%FBS 含 有 RPMI で 培 養 し ， P. gingivalis
lipopolysaccharide (LPS) 刺 激 を 行 っ た ． 培 養 後 ， 上 清 と 細 胞 を そ れ ぞ れ 回
収 し た ． 細 胞 か ら RNA を 抽 出 し ， Reverse transcription に よ っ て cDNA を 合
成 し た ． MnSOD ， TNF- α ， β-actin に 特 異 的 な プ ラ イ マ ー を 用 い て qPCR を
行 っ た ． 未 刺 激 時 の THP-1 細 胞 の mRNA 発 現 を 陽 性 対 象 と し て 段 階 希 釈 し
て 測 定 し ， 検 体 と 陽 性 対 象 と の 発 現 比 を 求 め ， 得 ら れ た MnSOD ， TNF- α と
β-actin の 値 の 比 を MnSOD mRNA と TNF- α mRNA 発 現 量 と し た ． 培 養 上
清 中 の Tumor necrosis factor (TNF) - α 濃 度 は ELISA 法を 用 い て 測 定 し た ．
統 計 解 析 に は IBM SPSS Statistics 23 を 使 用 し た ． 2 群 間 の 比 較 は Mann-
Whitney U test ま た は Pearsons’s chi-square test で 比 較 し た ． 多 群 間 の 比 較 は
ANOVA with Tukey's HSD Post Hoc Test で 比 較 し た ． 糖 尿 病 群 の 血 清
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