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好 塩 菌 の 特 性 と利 用 大西 博 海 水 や 塩 蔵 食 品 の 中 で 生 育 す る 好 塩菌 は,我 々 の生 活 に も深 い関 連 を持 っ てい る.常 るだ けで な く,温 度 やpHな 事 実 で あ る.こ に高濃度の食塩中で生育す どが 異 な る特 異 条 件 下

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好 塩 菌 の 特 性 と利 用

大西 博

海 水 や 塩 蔵 食 品 の 中 で 生 育 す る 好 塩菌 は,我 々 の生 活 に も深 い関 連 を持 っ てい る.常 に 高 濃 度 の 食 塩 中 で 生 育 す るだ けで な く,温 度 やpHな どが 異 な る特 異 条 件 下 に お い て も ユ ニ ー ク な好 塩 菌 が 見 いだ され る こ と も興 味 深 い 事 実 で あ る.こ れ らの 特 性 を 備 えた 微 生 物 や そ の 酵 素 の 利 用 は,バ イ オ テ ク ノ ロジ ー の今 後 に大 い に期 待 され る 分 野 とな る で あ ろ う.

塩 濃度 ほ とん どゼ ロか ら飽 和 濃 度 に至 る種 々の

塩濃 度 に生 育 す る微 生 物 が 知 られ て お り,中 に は

か な り広 範 囲 の塩 濃 度 に生 育 で きる ものが あ る.

一 般 に食 品 の 腐 敗 菌 は耐 塩 性 が ご く低 い の で,古

来 食 品 の 保 存 の た め に 塩 漬 けが 行 なわ れ た.恐

食 中毒 菌Clostridium botulinumは5∼7%

NaCl

に よ り生 育 が 完 全 に 阻 止 され る.し か し,飽 和 に

近 い 高濃 度 塩 水 を 用 い て 塩 蔵 した 魚 や皮 の よ うな

特 に蛋 白性 の ものが 赤 く着 色 した り赤 い 斑 点 を生

じて腐 る こ とが あ り,汚 染 菌 は 赤 色 の高 度 好 塩菌

で あ っ た.海 水 か ら天 日塩 を製 造 す る際 に 海 水 が

濃 縮 さ れ る に つ れ て赤 くな る とい う記 載 が 中 国 に

あ る とい わ れ,こ れが 好 塩 菌 の存 在 を示 す も の と

す る と,紀 元 前 か ら知 られ て い た こ とに な る.普

通 に塩 とい え ぼ赤 また は紫 色 の着 色 して い る も の

と思 わ れ て い た とい わ れ るほ どで あ り,天 日塩1

g当

り105∼106の

細 菌 が 一 般 に見 い だ さ れ る と

い われ る.天

日塩 の簡 便 な殺 菌 法 と して は,赤 色

高 度好 塩 菌 が 低 いpHに

弱 い ので,結 晶 化 の 始 ま

る直 前 の 飽 和 塩 水 を 塩酸 また は酢 酸 でpH 2.7以

下 に酸 性 化 し,好 塩 菌 を死 滅 させ た後 濃 縮 ・結 晶

化 ・風 乾 させ る のが 実 用 的 で あ る(1).好 塩 菌 の研

究 は こ の よ うな 産 業 との か か わ りか ら始 ま った

が,特

に赤 色 高 度 好 塩菌 は後 述 の よ うな きわ 立 っ

た 特 性 が あ る ので 研 究 が 集 中 す る こ とに な っ た.

生 育 の塩 濃 度 に対 す る対 応 の パ ター ンに よっ て

微 生 物 を大 ざ っぱ に 分 け る と耐 塩 菌 と好 塩 菌 に な

る(2)(図1).特 に 断 ら な い 限 り塩 は 食 塩 とす る. 耐 塩 菌 は ゼ ロに 近 い 塩 濃 度 で 生 育 が よ い が,か な り広 い 塩 濃 度 範 囲 に 生 育 で き る も の が あ る.好 塩 菌 は 生 育 の た め に 塩 を 要 求 し,低 度,中 度,高 度 好 塩 菌 に 分 け られ る.低 度 好 塩 菌 は 主 に 海 産 細 菌 で あ り,0.3∼0.5M NaCl (1M NaClは 約6%濃 度 で あ る)で 最 も よ く生 育 す る が,比 較 的 狭 い 塩 濃 度 範 囲 に の み 生 育 す る とい う特 徴 が あ る.高 度 図1 ■微 生 物 の 生 育 の 塩 濃 度 に 対 す る 対 応 パ タ ー ン(2) I:非,II:低 度,III:中 度,IV:高 度

Characteristics of Halophilic Microorganisms and Its Ap-plication

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好 塩 菌 は5.2Mの 飽 和 食 塩 濃 度 に 生 育 す る が, 2.5M以 下 の 塩 濃 度 で は 生 育 で きず,好 塩 性 が 最 も顕 著 で あ る.こ れ に 対 し て 中 度 好 塩 菌 は,0.5 ∼5.2Mの 広 い 塩 濃 度 範 囲 に 生 育 で き る と い う利 点 が あ る.し た が っ て,好 塩 菌 の 産 業 へ の 利 用 の 立 場 か らは,高 度 好 塩 菌 の 活 発 な 研 究 の か げ に 隠 れ て い る 中 度 好 塩 菌 が 今 後 も っ と注 目 さ れ て 然 る べ き で あ ろ う. 赤 色 高 度 好 塩 菌Halobacteriumは,真 核 生 物 と も 原 核 生 物 と も 異 な る 第 三 の 生 物 系 統 た る 古 細 菌(Archaebacteria)で あ る こ と が 提 唱 さ れ て い る が,高 度 好 塩 菌 こ そ が 最 初 に 詳 細 に 研 究 さ れ た 古 細 菌 で あ る(3). 1963∼65年 に 筆 者 は,カ ナ ダ の オ タ ワ

のNation-al Research Councilで,今 は 亡 きN.E.

Gib-bons先 生 の 指 導 の 下 にHalobacteriumの 栄 養 要 求 と人 工 培 地 の 設 定,細 胞 表 層 成 分 お よび 低 張 液 中 の 細 胞 のlysisの 機 構 な ど に つ い て 研 究 を 行 な っ た が,先 生 は 塩 蔵 魚 や 天 日塩 か ら 多 く の 赤 色 高 度 好 塩 菌 を 分 離 し,当 時 先 生 の 下 に 集 っ た Kushner(生 理 ・生 化 学),Kates(脂 質 化 学), Bayley(蛋 白 化 学 ・分 子 生 物 学), Matheson(酵 素 化 学 ・分 子 生 物 学)ら の 若 い 優 れ た 研 究 者 と協 同 し て 先 駆 的 な 研 究 を 進 め,好 塩 菌 研 究 の メ ッ カ と な っ た.こ れ らの 方 々 は そ れ ぞ れ の 専 門 分 野 の 立 場 か ら現 在 も 好 塩 菌 の 研 究 を 進 め て お られ,有 益 な 総 説(3∼6)が み ら れ る.好 塩 菌 全 般 に つ い て は

筆 者(7),亀 倉(8),Brown(9,10), Lanyi(11),

Dun-das(12), Grantと 掘 越(13), Sharp & Munster(14)

の 総 説 も 参 照 さ れ た い.本 稿 で は,高 度 お よ び 中 度 好 塩 菌 の 特 性 に つ い て,で き る だ け 産 業 へ の 利 用 の 立 場 か ら解 説 し た.

中度 お よび 高 度 好 塩 菌 の分 離 と分 類

微 生 物 の利 用 に あた って は,目 的 に従 っ て ス ク

リー ニ ン グを して有 用 菌 株 を 見 つ け る の で あ る

が,そ

のた め に は 多 種 多 様 の特 性 を 有 す る菌 株 を

広 く集 め る こ とが1つ

の重 要 な 方 針 と な る.生

理,生 化 学 的 研 究 の集 中 して い た のは,高 度 好 塩

菌Halobacterium属

菌 や 中 度 好 塩 菌Vibrio

costi-colaの よ うな比 較 的少 数 株 に 限 られ て い た.近 年

高 度 好 塩 菌 も 中 度 好 塩 菌 もか な りユ ニ ー ク な 特 性 を 示 す も の が 次 々 と発 見 さ れ,こ の 傾 向 は 利 用 面 の 開 発 の 立 場 か ら は 歓 迎 さ れ る べ き で あ る. 筆 者 ら(15)は,塩 蔵 魚,塩 田 試 料,醤 油 醸 造 用 塩 と醤 油 も ろ み,海 砂,海 藻 な ど の 含 塩 試 料 よ り

高 度 好 塩 菌 用 培 地 で あ る4M NaCl Sehgal and

Gibbons複 合 培 地(16)を 用 い て 集 積 培 養 を 行 な い, 168株 の 好 塩 菌 を 分 離 し た.そ れ ら は 生 育 に 対 す るNa, K, Mgの 要 求 性 に 基 づ い て9つ の タ イ プ に 分 類 さ れ,グ ラ ム 染 色,細 胞 の 形 態,運 動 性,胞 子 形 成 な ど の 点 で 異 な る 種 々 の 属 の 細 菌 が 含 ま れ た.そ の 中 でNaClを 特 異 的 に 要 求 し, Mg要 求 は 低 い タ イ プ が 最 も 多 く種 々 の 試 料 に 見 い だ さ れ た.分 離 株 に は 後 述 の よ う に 好 塩 性 ア ミ ラ ー ゼ(17,18),ヌ ク レ ア ー ゼ(19,20),5′ーヌ ク レ オ チ ダ ー ゼ(21)の 生 産 菌 やC20, C25ジ ェ ー テ ル 結 合 脂 質 を 有 す る 非 着 色 性 高 度 好 塩 菌(22),ま た 高 度 カ ド ミ ウ ム 耐 性 菌(23)な ど,興 味 あ る 性 質 を 有 す る も の が 含 ま れ て い た.集 積 培 養 の 際,4M NaCl培 地 の 他 に4M KCl培 地 を 併 用 した と こ ろ,同 じ試 料 か ら両 培 地 で そ れ ぞ れ 異 な る 好 塩 タ イ プ の 菌 が 得 ら れ た が,KClの み を 特 異 的 に 要 求 す る 菌 は 得 ら れ な か っ た.ま た,醤 油 も ろ み か らHalo-bacteriumは 分 離 さ れ な か っ た が,こ の 菌 が 難 分 解 の 脂 質 成 分 を 有 す る こ と か ら,食 品 に と っ て は 幸 い で あ る.Halobacteriumに と っ て は,醤 油 の 塩 濃 度 で も 生 育 の 最 適 濃 度 よ り低 く,pHも 低 い(酸 性 に 弱 く,pH 5以 下 で 死 滅)こ と に よ る の だ ろ う.Halobacteriumは 日 光 照 射 の 好 気 条 件 下 に 他 の 微 生 物 と 生 存 競 争 を す る に は 有 利 で あ る が,暗 所 で 嫌 気 条 件 下 で は 耐 塩 性 の 醗 酵 微 生 物 に 負 け る と 考 え られ る(3). 既 知 の 中 度 お よ び 高 度 好 塩 菌 の 種 属 名 と 分 解 源 に つ い て は 筆 者 の 総 説(7,16)に ま と め て あ り,そ れ に は 炭 水 化 物 利 用 性Halobacterium mediterra-nei,好 ア ル カ リ性 高 度 好 塩 菌Natronobacterium とNatronococcus属,箱 型 高 度 好 塩 菌Halo-arcula属 な ど ユ ニ ー ク な 性 質 の 好 塩 菌 が 集 積 培 養 に よ り分 離 さ れ る こ と も 記 した.こ こ で は,以 後 に 分 離 ・記 載 さ れ た 分 の うち 利 用 面 か ら興 味 を ひ く よ う な 性 質 を も つ も の を 挙 げ て み た.

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(3)

海 産 細 菌 と し て 新 属Pyrococcusの 新 種P. furiasusが イ タ リ ヤ の 地 熱 で 熱 く な っ て い る 海 岸 で 分 離 さ れ た(24).こ の 菌 は0.5∼5% NaClに 生 育 す る 低 度 好 塩 菌 で あ るが,文 字 ど お り “火 の 玉 ” 細 菌 で あ り,70∼103℃ に 生 育 し,最 適 の 生 育 温 度 は100℃ の 好 熱 古 細 菌 で あ る.次 い で,100∼ 103℃, 3% NaClに 最 大 生 育 を 示 す 超 好 熱 古 細 菌 の 新 種Pyrococcus woesiが 海 の 硫 気 孔 か ら分 離 さ れ た(25).ま た,高 度 好 熱 性 メ タ ン生 成 菌 の 新 種 Methanococcus jannaschiiが 海 底 の 熱 水 噴 気 孔 よ り分 離 さ れ た(26).H2+CO2気 相 中 の 培 地,85 ℃, 2∼3% NaClで 最 大 生 育 を 示 し,本 菌 の 分 離 は 深 海 で の メ タ ン の 生 物 生 産 の 証 拠 で あ る と い う. 一 般 に,嫌 気 性 菌 は 耐 塩 性 や 好 塩 性 が 弱 い と い わ れ て い た が,中 度 好 塩 性 の 偏 性 嫌 気 性 菌 が 分 離 さ れ た.1つ は,米 国 ユ タ 州 の 大 塩 湖 の 沈 澱 物 か ら 分 離 さ れ た 新 属 新 種Haloanaerobium prae-valens(27)で,2∼30% NaC1(最 適 塩 濃 度 は13%), 5∼60℃(最 適 温 度 は37℃), pH 6.0∼9.0(最 適 pH 7.0∼7.4)に 生 育 し,グ ル コ ー ス か ら 酪 酸, 酢 酸,プ ロ ピ オ ン酸,H2, CO2を 生 産 した.他 の 1つ は,死 海 の 沈 澱 物 か ら分 離 さ れ た 新 属 新 種 Halobacteroides halobius(28)で,生 育 に1.4∼ 2.8M NaClを 要 求 す る(最 適 塩 濃 度 は1.5∼2.5 M).本 菌 はKClとMgCl2がNaClの 代 用 と な り,0.3M NaCl+1.7M KClま た は1.7M MgCl2 で も生 育 し,37∼45℃ に よ く生 育 す る が,50℃ で は 生 育 し な い.こ れ は 大 塩 湖 と 死 海 の 塩 組 成 (大 塩 湖 はNa+が 主 要 な カ チ オ ン で あ る が,死 海 はNa+よ り もMg2+が 多 い)と 湖 の 温 度(死 海 が 21∼36℃ で あ る の に 対 し,大 塩 湖 は-5∼35℃ (浅 瀬 は45℃ と な る))な ど の 環 境 条 件 の 差 を 反 映 し て い る の か も 知 れ な い.本 菌 は グ ル コ ー ス を 醗 酵 し て エ タ ノ ー ル,酢 酸,H2, CO2を 生 産 し, 醗 酵 基 質 と し て 種 々 の 単 糖,少 糖,澱 粉 も用 い う る.こ の2つ の 中 度 好 塩 性 偏 性 嫌 気 性 菌 の た め に 新 た にHaloanaerobiaceae科 を も うけ た(28). 中 度 好 塩 性 メ タ ン 生 成 菌 が ト リ メ チ ル ア ミ ンを 用 い た 集 積 培 養 で カ リ フ ォ ル ニ ヤ の 塩 田 か ら分 離 さ れ た(29).生 育 と メ タ ン生 成 の た め に メ チ ル ア ミ ン ま た は メ タ ノ ー ル の み を 利 用 し,生 育 の 最 適 塩 濃 度 は2.1Mで あ る.ま た,大 塩 湖 の 沈 澱 物 か ら も好 塩 性 メ タ ン生 成 菌 が 分 離 され た(30).メ タ ノ ー ル,メ チ ル ア ミ ン,ジ メ チ ル ア ミ ン,ト リ メ チ ル ア ミ ン が 生 育 と メ タ ン 生 成 を 支 持 し,H2-CO2, 蟻 酸,酢 酸 は 利 用 さ れ な い.生 育 と メ タ ン生 成 の 最 適 塩 濃 度 は1.2∼2.0Mで あ る. 南 極 の 塩 湖 か ら は2.5∼17.5% NaCl培 地 に 生 育 す る 新 種 中 度 好 塩 菌Halomonas subglaciescola が 分 離 さ れ た(31).0∼25℃ の 低 温 に 生 育 し,37℃ に は 生 育 せ ず,-5℃ に 生 育 す る 株 も あ る と い う. 海 産 のAlcaligenesとPseudomanasの も の が 新 属.Deleyaに 入 れ られ た が(32),高 塩 分 土 壌 か ら2∼30%塩 濃 度 に 生 育 す る(7.5%が 最 適)中 度 好 塩 性 新 種D.halophilaが 分 離 さ

れ(33),Plano-coccus halophilusそ の 他 の 中 度 好 塩

性Plano-coccus sp.は 細 胞 壁 が メ ソ ジ ア ミ ノ ピ メ リ ン酸 型, メ ナ キ ノ ン 系 がMK-7, DNA塩 基 組 成 が43.9 ∼46.6%で あ る 点 でPlanococcus属 の 性 質 と異 な る の で,新 属Marinococcusが 提 唱 さ れ た(34).ま た,ポ ル トガ ル の 塩 田 か ら は6∼18% NaClで 最 も よ く生 育 す る光 合 成 細 菌Rhodospirillum sali-nariumが 分 離 さ れ た(35).

『Bergey's Manual第8版(1974)』 で

はHalo-bacterium salinariumとH. halobiumは 別 々 の

種 に 分 け られ て い た が,『 第9版(1984)』 で はH. cutirubrumも 含 め て す べ てH. salinariumの1 種 に ま と め た.こ の 再 分 類 は16Sリ ボ ゾ ー ム RNAの 塩 基 配 列 が 同 じ カ タ ロ グ を 示 す こ と に 基 づ い て い る.『 第9版 』 に はHalobacteriumの 他 の 種 と し て,H. saccharovorum, H.

vallis-mortis, H. volcanii, H.pharaonisが 登 載 さ れ

た. 最 近,種 々 の 高 濃 度 塩 環 境 か ら 分 離 さ れ た Halobacteriumに つ い て 数 値 分 類 を 行 な い,Halo-bacterium属, Haloarcula属,Haloferax属 の3つ の グ ル ー プ に 分 け て い る(36).そ の 区 別 の 基 準 と な っ た 性 質 を 表1に 示 す.ま た 新 し く提 唱 さ れ たHaloarculaとHaloferaxの 両 属 に つ い て は,新 種Haloarcula hispanicaとHaloferax gibbonsiiの 詳 細 な 性 質 が 示 さ れ て い る(37). 高 度 好 塩 菌 が ご く少 数 の グ ル ー プ に 分 け ら れ る

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表1 ■既 知 高 度 好 塩 菌 の種 の3つ の属 へ の新 分 類 と主 要 な 性 質(36)

PGS: phosphatidyl glycerosulfate, S-DGD: sulfated diglycosyl diether, DGD-1: diglycosyl diether, S-TGD-1: sulfated triglycosyl diether, S-TeGD: sulfated tetraglycosyl diether, GL-2: unknown glycolipid, DGD-2: unknown diglycosyl diether, TGD-1: triglycosyl diether (galactosyl-mannosyl-glucosyl diether), TGD-2: triglycosyl diether (glucosyl-mannos-yl-glucosyl diether) と い う こ と は,こ れ ら の 菌 が 遺 伝 的 に 安 定 で あ る こ と を 示 唆 し,多 く の 微 生 物 が 変 異 性 に 富 む こ と か ら す る と逆 説 的 で あ る と い う人 も い る.塩 依 存 性 は 増 大,低 下 の い ず れ の 方 向 に も 変 異 し に く い よ うで あ る(3). 種 々 のHalobacterium属 菌 と 好 塩 好 ア ル カ リ 性 菌Natro-nobacteriumの 生 育 と 最 適 の 培 地 のNa+とMg2+濃 度 お よ び pHと の 関 係 を 図2に 示 す(38). グ ル ー プIのHalobact.salina-riumとHalococcus morrhuae は4.0∼4.5M NaCl, 0.1∼1M Mg2+,中 性pHで 最 大 生 育 を 示 し,グ ル ー プIIのHalobact. 図2 ■ 高 度 好 塩 菌 の 生 育 と 培 地 のpH, Na+お よ びMg2+濃 度 と の 関 係(38) グ ル ー プI: Halobacterium salinarium,Halococcus morrhuae,グ ル ー プII: Halo-bacterium volcanii,グ ル ー プIII: Halobacterium vallismortis, Haloarcula, グ ル

ー プIV: Natronobacterium magadii ■:Na+,□:Mg2+,□:pH volcaniiは よ り低 いNaCl濃 度 の1.5∼2.5Mで 最 大 生 育 を 示 す が,Mg2+要 求 は 高 く0.5∼1.5M で あ り,グ ル ー プIよ り も 酸 性 へ の 耐 性 が 大 き く, pH 4.5∼8.0の 広 いpH範 囲 で 生 育 す る(最 適 pHは6.0∼6.5で あ る),グ ル ー プIIIのHalo-bact.vallismortisとHaloarculaは グ ル ー プII と 同 じ よ うなMg2+要 求 を す る が,生 育 す るpH 範 囲 が 狭 く,NaCl要 求 は グ ル ー プIと 同 じで あ る.グ ル ー プIVのNatronobacterium magadii は3.5∼4.5M NaClに 最 大 生 育 を 示 す が,ア ル カ リpH (9.0∼10.5)に 生 育 し,Mg2+要 求 は 低 く0.1∼2.0mM濃 度 で 最 大 生 育 を 示 す. 高 度 好 塩 性 脱 窒 菌 も 知 ら れ,Halobacterium denitrificans sp. nov.が 硝 酸 塩 の 存 在 下 に 嫌 気 的 に 集 積 培 養 し て サ ン フ ラ ン シ ス コ 湾 岸 の 塩 田 か ら分 離 さ れ た(39).硝 酸 培 地 に 嫌 気 培 養 す る とN2 241

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を 生 成 し,好 気 培 養 す る 時 は 多 くの 炭 水 化 物 を 利 用 し て 酸 を 生 産 し た.

好 塩 菌 の 特 性

か な り初 期 の 研 究 で,中 度 好 塩 菌 に

はPara-coccus halodenitrificansの よ うに 生 育 にNaClを

特 異 的 に 要 求 す る も の と,Vibrio costicolaの よ うにNaClの み な らず 種 々 の 塩 培 地 に 生 育 で き る も の の あ る こ と,ま た 高 度 好 塩 菌Halobacterium は 生 育 の た め に3M以 上 のNaClを 特 異 的 に 要 求 し,他 の 塩 類 はNaClの 代 用 と な らず,そ の 上 Mg2+が 必 須 で0.1∼0.5M Mg2+で 最 大 生 育 を 示 す こ と,お よ び こ の 菌 を 水 ま た は 稀 薄 塩 水 に さ ら す と速 や か に 溶 菌 現 象 を 起 こ す の で 短 時 間 と い え ど も15%以 下 の 塩 水 に さ ら し て は い け な い と い う こ と が 知 られ て い た. Halobacteriumの 細 胞 内 塩 濃 度 は 培 地 の 塩 濃 度 と 同 じ く高 い.こ の 菌 は 飽 和 食 塩 培 地 に 生 育 し,細 胞 内 に 飽 和 濃 度 のKを 含 ん で い る.し か し,細 胞 内 の 塩 組 成 は 培 地 の そ れ と異 な り,培 地 中 のK+濃 度 は 低 い が こ の 濃 度 勾 配 に 逆 ら っ て K+が 菌 体 に 蓄 積 さ れ,細 胞 内/細 胞 外K+の 勾 配 は1000:1と 高 い 。 細 胞 内 で の 存 在 状 態(結 合 図3 ■ 高 度 好 塩 菌 の 燐 脂 質 と 糖 脂 質(22)

PG: phosphatidyl glycerol, PGP: phosphatidyl glycerophosphate

メ タ ノ リシ ス を 行 な う と グ リセ ロ ー ル ジ エ ー テ ル部 分(四 角 の 囲 み の 内 側)が 遊 離 す る.糖 脂 質 は グ リセ ロ燐 酸 部 分(四 角 の 囲 み の 外 側)が 糖 に よ り置 き 換 わ った もの で あ る. 型 か 遊 離 型 か)は 興 味 あ る 問 題 で あ る が,は っ き り し な い. 高 度 好 塩 菌 の 一 般 的 な 代 謝 パ タ ー ンが 非 好 塩 菌 の も の と基 本 的 に 異 な る こ と は な い よ うで あ る. こ の 菌 は 蛋 白 消 化 物 に 最 も よ く生 育 し,ア ミ ノ 酸 代 謝 は よ く発 達 し て い る の に 炭 水 化 物 は 一 般 に は 利 用 さ れ ず,主 と し て 蛋 白 分 解 物 を 用 い て 培 養 さ れ る.ま た,栄 養 要 求 が 複 雑 で,こ の こ と は ペ ニ シ リ ン 淘 汰 を うけ に くい こ と と 相 俟 っ て 栄 養 要 求 変 異 株 の 分 離 を 困 難 に し て い る. 筆 者 が か つ てGibbonsの 研 究 室 でHalobacte-riumの 栄 養 要 求 を 詳 し く調 べ て 人 工 合 成 培 地 作 りの 仕 事 を し て い た 時,糖 の 生 育 促 進 効 果 の あ る な し も調 べ よ う と し た ら,“Already studied!” (既 知 の こ とを 繰 り返 す 必 要 は な い)と い わ れ た こ とが 印 象 に 残 っ て い る.こ れ は 確 か に 研 究 者 の 大 事 な 姿 勢 の1つ で あ る が,微 生 物 の 利 用 を 考 え る 者 と し て 糖 を 利 用 し て 珍 し い 生 産 物 を 作 っ て く れ る 菌 は な い も の か な と思 っ た り も し た.こ の 研 究 は ア ミ ノ酸 の 複 雑 な 要 求 と グ リ セ ロ ー ル の 生 育 促 進 効 果 を 明 らか に し た が(40),近 年Halobact. saccharovorumやHalobact. mediterraneiな ど の 炭 水 化 物 利 用 性 菌 が 発 見 さ れ て い る.H. saccharovorumは 種 々 の 糖 を 代 謝 し て 酸 を 生 産 し,そ の 代 謝 経 路 は “modified Entner-Dou-doroff” 経 路 に 従 っ て 行 な わ れ る(41). HalobaGteriumの 最 適 生 育 温 度 は40∼45℃ で,10℃ 以 下 ま た は55℃ 以 上 で は 生 育 し な い.し た が っ て,冷 蔵 庫 の 普 及 と と も に そ の 汚 染 は ほ と ん ど な くな っ た. 高 度 好 塩 菌 の き め 手 とな る 他 の 特 性 は 脂 質 成 分 で あ る.脂 肪 酸 を 含 ま ずC20のphytanyl基 が2つ エ ー テ ル 結 合 し て い る 燐 脂 質 と糖 脂 質 で あ り(図3), そ れ ら は 鹸 化 処 理 に 耐 性 で あ る か ら,そ の 存 在 は 容 易 に わ か

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り,薄 層 ク ロマ トに よ る 迅 速 簡 便 検 出 法(42)が 提 示 さ れ て い る.好 ア ル カ リ 性 好 塩 菌 はC25の pester terpanyl基 も 含 み,C20:C20ジ エ ー テ ル と C20:C25ジ エ ー テ ル の 両 成 分 を 有 す る(43).筆 者 らは,非 着 色 性 でMg要 求 の 低 い 点 以 外 はHalo-bacteriumと 類 似 の 性 質 を 示 す 好 塩 菌 を 分 離 し, 赤 色 か ら非 着 色 へ の 自然 変 異 は 高 い 頻 度 で 見 ら れ る と い わ れ て い る の で(44),こ れ も 単 に 色 の 変 異 株 と考 え て い た が,脂 質 成 分 にC20:C25ジ エ ー テ ル 成 分 が 検 出 さ れ た(22).分 離 株 は 好 ア ル カ リ性 で な い の で,こ の 脂 質 の 構 造 決 定 と と も に,こ の 菌 の 分 類 学 が 興 味 を そ そ る. 好 塩 性 酵 素 高 度 好 塩 菌 の 酵 素 の 活 性 と 塩 濃 度 の 関 係 に は3 つ の 基 本 的 タ イ プ が あ る(3).(1)活 性 の た め に 少 な く と も1Mの1価 塩 を 必 要 と し,2∼4M塩 で 最 大 活 性 を 示 す も の で,Halobact.cutirubrumの ア ス パ ラ ギ ン 酸 トラ ン ス カ ル バ ミ ラ ー ゼ(ATCase) の 例 で あ る.(2) 0.5∼1.5M塩 で 最 大 活 性 を 示 し,よ り高 濃 度 の 塩 に よ り阻 害 さ れ る も の で,た と え ばHalobact. salinariumの イ ソ ク エ ン酸 デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ で あ る.(3)塩 が な い 時 最 大 活 性 を 示 し,高 濃 度 の 塩 に よ り強 く阻 害 さ れ る も の で, 脂 肪 酸 合 成 酵 素 が そ れ で あ る.多 く の 酵 素 に 対 し NaClとKClは ほ ぼ 同 じ効 果 を 示 す が,KClで よ り活 性 の 高 ま る 酵 素 も あ る.特 殊 な 塩 要 求 タ イ プ の 例 と し て,Halobact. cutirubrumの リ ン ゴ 酸 酵 素 が み ら れ る(45).1M NH4Clで 最 大 活 性 を 示 し,3M KClで 最 大 活 性 の60%の 活 性 を 示 す が,5M濃 度 ま で の ど のNaCl濃 度 で も 活 性 が な い.す な わ ち,NH4Clは 最 良 の 活 性 化 剤 で あ る. 一 方 ,安 定 化 に は 活 性 化 に は 役 立 た な いNaClの ほ うが 有 効 で あ る. 酵 素 の 活 性 に 対 す る 塩 の 影 響 と 安 定 性 に 対 す る そ れ と は 明 瞭 に 区 別 し て 考 え る 必 要 が あ る.特 に 反 応 時 間 の 長 い 時 は 注 意 を 要 す る.安 定 性 の ほ う が 活 性 よ り も 高 い 塩 濃 度 を 要 求 す る 場 合 が あ り, 顕 著 な 例 と し てHalobact. cutirubrumのATCase は3.5M NaClで2M NaClの4倍 の 活 性 を 示 す が,こ の2つ の 塩 濃 度 で の 安 定 性 は3.5Mの ほ う が500倍 も 安 定 で あ る(46)(活 性 の 半 減 時 間 は8時 間 と1分 で あ る). こ の よ う に,ATCaseは 塩 濃 度 が2M以 下 に 低 下 す る と1分 以 内 に 不 可 逆 的 に 変 性 失 活 し て し ま うの に 対 し,リ ン ゴ 酸 デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ(47)や ヌ ク レア ー ゼH(19)な ど は 稀 薄 塩 溶 液 中 で 失 活 し て も, 高 濃 度 食 塩 に 対 し て 透 析 す る こ と に よ り大 部 分 活 性 が 回 復 す る.こ の 事 実 は 酵 素 の 精 製 に う ま く利 用 さ れ る. Halobact. salinariumの 精 製 ア ラ ニ ン デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ は 活 性 に 高 濃 度 の 塩 を 要 求 す る が,酸 化 反 応 と 還 元 反 応 で は 塩 の 種 類 に よ っ て 効 果 が ま っ た く異 な る(48).す な わ ち,KCl, NaCl, RbCl, CsClは ピ ル ビ ン 酸 の 還 元 的 ア ミ ノ化 に は 同 様 の 効 果 を 有 す る が,ア ラ ニ ン の 酸 化 的 脱 ア ミ ノ反 応 で はKClが 他 の 塩 よ り も有 効 で, NaClの 存 在 下 に は 活 性 が な い.Halobact. halobiumの グ ル タ ミ ン酸 デ ヒ ド ロゲ ナ ー ゼ も α-ケ ト グ ル タ ル 酸 の 還 元 的 ア ミ ノ 化 反 応 とL-グ ル タ ミ ン 酸 の 酸 化 的 脱 ア ミ ノ反 応 と で はNaClとKClの 影 響 が 異 な る(49). Kushnerが 要 約 し た よ うに(3,4),ATCaseは 活 性 と フ ィ ー ドバ ッ ク 阻 害 の 両 方 と も 高 い 塩 濃 度 に 依 存 し,最 大 活 性 も 最 大 の 阻 害(CTPに よ る フ ィ ー ドバ ッ ク 阻 害)も3M NaClま た はKClで 起 こ る.塩 濃 度 を2M以 下 に 下 げ た 時 は 活 性 は 低 下 す る が,フ ィ ー ドバ ッ ク阻 害 は も っ と 低 下 し, CTPに よ る 阻 害 が な い よ う に な る.活 性 に は NaClとKClは 同 様 の 効 果 を 示 す が,フ ィ ー ド バ ッ ク阻 害 はNaClよ り もKClが 少 し強 い.前 述 の よ う にATCaseは2M NaClで き わ め て 不 安 定 で あ り,低 い 塩 濃 度 に お け る 制 御 的 性 質 の 消 失 が 触 媒 性 サ ブ ユ ニ ッ トへ の 解 離 に よ る も の か ど うか の 決 定 を 困 難 に し て い る.こ の 好 塩 菌 の ATCaseの 塩 と の 関 係 は,酵 母Saccharomyces cerevisiaeの 同 じ酵 素 の 場 合 と正 反 対 で あ る.フ ィ ー ドバ ッ ク 阻 害 は0.5M NaClで 阻 害 さ れ,こ の 塩 濃 度 は 酵 素 活 性 よ り もUTPに よ る フ ィ ー ド バ ッ ク阻 害 を よ り強 く阻 害 し た . Halobacteriumの 酵 素 の 生 合 成 を 制 御 す る 因 子 に つ い て は 研 究 が ほ と ん ど な い.こ の 菌 の 栄 養 243

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要 求 の 複 雑 な こ とが 酵 素 生 成 の 誘 導 と 抑 制 の 研 究 を 困 難 に し て お り,最 少 培 地 に 生 育 す る よ う な 好 塩 菌 を 用 い る 研 究 が 期 待 さ れ る(3,4).単 一 炭 素 源 と し て 糖 を 利 用 す るHalobact. SRC-charovorum が グ ル コ ー ス 培 地 に 生 育 す る 時 はmodified Entner-Doudoroff経 路 が 誘 導 さ れ る が,ガ ラ ク トー ス ま た は 表2 ■好 塩 性 リ ン ゴ酸 デ ヒ ドロゲ ナ ー ゼ の 精 製(52) 糖 な し の 培 地 の 時 は 誘 導 さ れ な い と い わ れ る(50). Lanyi(11)は,蛋 白 の 構 造 に 対 す る 塩 の 影 響 に つ い て 詳 細 に 考 察 し て い る.高 度 に 精 製 さ れ た 好 塩 性 酵 素 は ま だ 少 な い が,グ ル タ ミ ン 酸 や ア ス パ ラ ギ ン酸 を 多 く含 む た め に 酸 性 で あ る こ とが 知 ら れ て い る.塩 の カ チ オ ンが 酵 素 の(-)荷 電 を 遮 蔽 し て 荷 電 の 相 互 反 発 に よ る 蛋 白 の 構 造 破 壊 を 防 い で い る と 考 え られ る.こ の 役 割 は 重 要 だ ろ う が,酵 素 の 活 性 と安 定 性 に 必 要 と され る1価 塩 の 濃 度 は あ ま り に も高 す ぎ る の で,塩 の 効 果 の す べ て が 荷 電 遮 蔽 作 用 で あ る と は 考 えに く い.ポ リ グ ル タ ミ ン 酸 の よ ぢに 高 度 に 荷 電 し た ポ リア ニ オ ン の 荷 電 の 中 和 は0.2M NaClで 充 分 で,し か も 高 濃 度 のNaClで は か え っ て 不 安 定 に な る と い わ れ る.Lanyi(11)は,高 濃 度 のNaClが 好 塩 性 酵 素 の 疎 水 的 相 互 作 用 の 保 持 に 必 要 で あ る 可 能 性 を 考 え た.こ の 作 用 は 蛋 白 の 構 造 の 保 持 に 重 要 で あ る が,好 塩 性 蛋 白 で は 弱 い.高 濃 度 の 塩 に よ り疎 水 的 相 互 作 用 が 増 し,よ り し っ か りつ ま っ た 折 りた た ま れ た 構 造 を と る よ う に な る.疎 水 結 合 の 重 要 性 を 示 す も う1つ の 証 拠 は,前 述 のATCaseが 冷 所 不 安 定 性 を 示 す こ とで あ る.す な わ ち,0℃ 以 上 の 温 度 で 最 大 の 安 定 性 を 示 し,よ り低 温 で は 安 定 性 が 低 く な る の で あ る.こ れ が 疎 水 結 合 の 特 徴 で も あ る. Pundakら(51)はHalobact. maris-mortuiの 精 製 リ ン ゴ酸 デ ヒ ドロ ゲ ナ ー ゼ が 異 常 に 大 量 の 水 と 塩 と結 合 で き る こ と を 発 見 した.1ml/g蛋 白 の 水 と0.3g/g蛋 白 のNaClが 結 合 し,対 照 の 非 好 塩 性 蛋 白 の 仔 ウ シ 血 清 ア ル ブ ミ ン は0.2ml/g 蛋 白 の 水 と0.01g/g蛋 白 のNaClと 結 合 し て い た.こ の 高 い 結 合 能 は,好 塩 性 酵 素 が 低 い 塩 濃 度 で 変 性 し て 構 造 が こわ れ る 時 に 失 わ れ る の で,酵 素 の 活 性 構 造 と関 係 す る と 思 わ れ る. 好 塩 性 酵 素 は 安 定 性 の た め に 高 い 塩 濃 度 を 必 要 とす る の で,そ の 精 製 に 蛋 白 精 製 の 標 準 的 な ク ロ マ ト グ ラ フ 法 を 用 い る こ と が で き な い .Ca-ヒ ド ロ キ シ ル ア パ タ イ トを 用 い る ク ロ マ トは 高 い 塩 濃 度 に よ り妨 害 さ れ な い の で 有 用 で あ る.精 製 の1 例 と し て は,Mevarechら(52)がHalobacterium sp.の リ ン ゴ酸 デ ヒ ドロ ゲ ナ ー ゼ を 表2に 示 す 手 順 で 行 な っ た 報 告 が あ る.す な わ ち,音 波 破 砕 (粗 酵 素 液)→ 硫 安 分 画 → 硫 安 の 減 少 濃 度 勾 配 を 用 い た セ フ ァ ロ ー ス4Bの 疎 水 ク ロ マ トグ ラ フ ィ ー → セ フ ァ デ ッ ク スG-100の ゲ ル 濾 過 → ヒ ド ロ キ シ ル ァ パ タ イ ト ク ロ マ ト→4.26M NaClに お け る8-(6-aminohexyl) amino-NAD+-セ フ ァ ロ ー ス の ア フ ィ ニ テ ィ ー ク ロ マ トを 行 な っ て い る.Leicht とPundak(53)は,Halobacteriumの リ ン ゴ酸 デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ と グ ル タ ミ ン酸 デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ の 大 規 模 な 精 製 法 を 報 告 し て い る が,塩 析 ク ロマ ト法 を 用 い て2.1kgの 細 胞 ペ ー ス トか ら50%の 収 率 で200mgの グ ル タ ミ ン酸 デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ と300mgの リ ン ゴ酸 デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ の95%純 度 の も の を 得 た. 好 塩 性 酵 素 の 利 用 面 好 塩 菌 お よび そ の 酵 素 や 生 産 物 の 産 業 へ の 利 用 面 の 開 発 は ほ と ん ど行 な わ れ て い な い.こ こ で は,筆 者 ら の 研 究 を 中 心 に,利 用 面 に 結 び つ く よ う な 好 塩 性 酵 素 を と り上 げ る こ と に す る. 醤 油 も ろ み か ら分 離 し た 中 度 好 塩

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菌Micm-coccus varians subsp. halophilusは1∼4M NaCl ま た はKCl培 地 に 培 養 す る と 菌 体 外 ヌ ク レ ア ー ゼ を 生 産 す る(3M濃 度 で 最 大 生 産).精 製 酵 素 はRNAとDNAを 基 質 と し て エ キ ソ型 の 分 解 を 行 な い,末 端 か ら 逐 次 分 解 して5′-ヌ ク レ オ チ ド を 生 産 し呈 味 性 核 酸 関 連 物 質 へ の 利 用 の 可 能 性 が 考 え られ た(19,20).本 酵素 は3∼4M NaClで 最 大 活 性 を 示 し,既 知 ヌ ク レア ー ゼ が い ず れ も0.5∼ 1M NaClで 活 性 が 阻 害 さ れ る こ と を 考 え る と, 好 塩 性 の 顕 著 な 酵 素 と い え る(ヌ ク レ ア ー ゼHと 命 名 し た).本 菌 の 培 養 上 澄 液 を 用 い てRNAの 分 解 を 行 な う場 合,そ の 中 に は ヌ ク レ ア ー ゼHの み な らず 好 塩 性 の5′-ヌ ク レ オ チ ダ ー ゼ が 含 ま れ る の で,生 成 した5′-ヌ ク レ オ チ ドが さ ら に 分 解 さ れ て し ま う.そ こ で,5′-ヌ ク レ オ チ ダ ー ゼ 作 用 を 阻 害 す る1つ の 試 み と し て,60℃ の 高 温 で24 時 間 分 解 を 行 な い,59のRNAか ら805mgの 5′-グ ア ニ ル 酸 を 得 た(54). ま た,こ の 好 塩 菌 の 特 性 と し て,3M NaCl, 2 % MgSO4・7H2O, 1%カ ザ ミ ノ酸,1%酵 母 エ キ ス 培 地 の 培 養 で フ ロ ッ ク の 形 成 と菌 体 外 ヌ ク レ ア ー ゼ 活 性 の 低 下 が み られ た(55).こ の 凝 集 は,3 M NaClの 複 合 培 地 に40mM以 上 のMgSO4と 14mM濃 度 以 上 のKH2PO4の 共 存 す る 時 起 こ り, 凝 集 が 起 こ る と菌 体 外 ヌ ク レ ア ーゼ 活 性 が 低 下 し た の は フ ロ ッ ク表 面 に 酵 素 蛋 白 が 吸 着 さ れ る た め で あ り,酵 素 の 生 合 成 の 阻 害 で は な い こ とが 明 ら か に な っ た(56).ま た,こ の フ ロ ッ ク は 菌 体 外 ヌ ク レ ア ー ゼHを 選 択 的 に 吸 着 し,5′-ヌ ク レオ チ ダ ー ゼ は む し ろ 除 外 す る こ と が 見 い だ さ れ,こ の よ うに さ ら に ヌ ク レ ア ー ゼ を 吸 着 さ せ て 活 性 を 増 加 さ せ た フ ロ ッ ク と セ ラ イ ト545を 混 合 し て フ ロ ッ ク カ ラ ム を 作 り,こ の バ イ オ リア ク タ ー の5′-ヌ ク レ オ チ ドの 生 産 へ の 利 用 が 試 み ら れ た(57). 好 塩 性 リ ン ゴ酸 デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ を プ ロ モ シ ア ン で 活 性 化 した ア ガ ロ ー ス に 固 定 化 す る と可 溶 性 の 酵 素 よ り も安 定 性 が 増 大 し,よ り 低 い 塩 濃 度 で 最 大 活 性 を 示 す よ うに な る こ と も 知 ら れ て い る(58). 好 塩 菌 の 生 産 す る プ ロ テ ア ー ゼ や ア ミラ ー ゼ が 知 ら れ て い る が,興 味 あ る 酵 素 と し て は 死 海 の Halobact. sodomensの 生 産 す る 菌 体 外 ア ミ ロ グ ル コ シ ダ ー ゼ が あ る(59).こ の 酵 素 は,澱 粉 を 分 解 し マ ル トー ス に す る こ と な し に グ ル コ ー ス を 生 成 し,1.4M NaClで は65℃, 3.9M NaClで は 75℃ に 最 大 活 性 を 示 す 好 熱 好 塩 性 酵 素 で あ っ た. ま た,高 度 好 塩 菌Actinopolyspora halophilaは 20% NaCl培 地 に 生 育 す る 時,菌 体 内 お よ び 菌 体 外 β-ラ ク タ マ ー ゼ を 生 産 し,両 酵 素 と もNaCl に よ り活 性 が 促 進 さ れ,多 く の ペ ニ シ リ ン と セ フ ァ ロ ス ポ リ ン を 分 解 し た が,菌 体 内 酵 素 は フ ェ ノ キ シ メ チ ル ペ ニ シ リ ン,メ チ シ リ ン,セ フ ァ ロ グ リ シ ンを 効 率 よ く分 解 し,一 方 菌 体 外 酵 素 は メ チ シ リ ン,カ ル ベ ニ シ リ ン,ア ン ピ シ リ ン,セ フ ァ ロ ス ポ リ ンCに 高 い 活 性 を 示 し た(60). Kushner(3)は 好 塩 菌 の 将 来 の 研 究 の 方 向 を 予 測 し て,膜 の 機 能 に つ い て 新 し い 理 解 が 得 られ, 食 品 や エ ネ ル ギ ー の 生 産 に 光 を 用 い る 新 しい 方 法 が 開 発 さ れ よ う と 述 べ て い る が,好 塩 菌 の 特 性 を 利 用 し た 新 し い 産 業 化 の 起 こ る こ と を 夢 み た い.

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発するか,あるいは金属が残存しても酸性あるいは塩