Jpn Pharmacol Ther( 薬理と治療 )vol. 44 no RANKL 処理 RAW264.7 細胞の NFATc1 発現に 対する Palmatine 抑制効果 Palmatine s Suppression on NFATc1 for RANKL treated

RANKL 処理 RAW264.7 細胞の NFATc1 発現に

対する Palmatine 抑制効果

■

Palmatine s Suppression on NFATc1

for RANKL treated RAW264.7 Cells

■

金木 清美

石川慎太郎

張

夢

小林 善之

樋口 毅史

金田 祥明

池本 英志

砂川 正隆

久光

正

ABSTRACT

Objectives Isoquinoline alkaloid palmatine isolated from plants, such as Coptidis rhizoma,

has long been known as a natural yellow pigment. Previously, we have reported that palmatine

inhibited bone loss in an osteoporosis model, and mentioned the effect of palmatine for

apopto-sis

︱

induction and resorption

︱

depression on osteoclast. However, there is no concrete evidence

about an effect of palmatine for differentiation of osteoclast.

Methods This study investigated whether the effect of palmatine could reflect osteoclast

acti-vation via Nuclear factor of activated T

︱

cells, cytoplasmic 1

（

NFATc1

）

, the genetic

transcrip-tion factor on osteoclast differentiatranscrip-tion, or not.

Results Palmatine decreased receptor activator of nuclear factor kappa

︱

B ligand

（

RANKL

）︱

induced bone resorption in RAW264.7cells like osteoclast cell. The mRNA expression and

pro-tein of NFATc1 in RANKL

︱

treated RAW264.7cells were inhibited by palmatine treatment.

Conclusions These results demonstrated that palmatine inhibited RANKL

︱

mediated

osteo-clast differentiation in RAW264.7cells in a dose

︱

dependent manner. In conclusion, palmatine

may have therapeutic potential in preventing bone loss.

（Jpn Pharmacol Ther 2016；44：997 1004）

KEY WORDS RAW264.7 cell，

Differentiation of osteoclast

，

Bone resorption

，

Nuclear

factor of activated T

︱

cells

，

cytoplasmic 1

（

NFATc1

），

Receptor activator of nuclear factor

kappa

︱

B ligand

（

RANKL

），

Palmatine

昭和大学医学部 生理学講座生体制御学部門

Kiyomi Kaneki, Shintaro Ishikawa, Meng Zhang, Yoshiyuki Kobayashi, Takeshi Higuchi, Yasuaki Kanada, Hideshi Ikemoto, Masataka Suna-gawa, and Tadashi Hisamitsu: Department of Physiology, School of Medicine, Showa University

はじめに 骨はリン酸カルシウムの一種であるヒドロキシア パタイトとⅠ型コラーゲンを主成分とした組織であ る。骨内部では破骨細胞による骨吸収と骨芽細胞に よる骨形成がつねに繰り返されている。この骨代謝 は「骨リモデリング」とよばれ，骨の強度の維持や 血清カルシウム濃度の調節における重要な役割を果 たしている。しかしこの骨代謝のバランスが崩れ， 破骨細胞による骨吸収が亢進すると骨損失を招き， 骨粗鬆症，関節リウマチ，歯周炎などに伴う骨破壊 が発生する1～3）_。 単球╱マクロファージ系細胞の融合から生じる多 核巨細胞である破骨細胞は石灰化した骨を再吸収で きる唯一の細胞である4,5）_{。破骨細胞の成熟および分} 化は骨芽細胞╱ストローマ細胞上で発現される

mac-rophage colony

︱

stimulating factor

（

M

︱

CSF

），

receptor

activator of nuclear factor kappa

︱

B ligand

（

RANKL

），

osteoprotegerin

（

OPG

）などがおもな調節因子であ る5～7）_{。腫瘍壊死因子（}

_{tumor nercrosis factor: TNF}

_）

スーパーファミリーに属する

RANKL

は，破骨細胞

の 前 駆 細 胞 に 発 現 す る

NF

︱κ

F

活 性 化 受 容 体

（

RANK

）に結合すると，

RANK

の細胞内ドメイン

に

TNF receptor

︱

associated factor

（

TRAF

）︱

6

などの アダプター分子が会合し，各種の分裂促進因子活性

化タンパク質キナーゼ（

MKK

，

ERK

，

JNK

，

p38

な

ど）が活性化され，最終的に

c

︱

Fos

や

nuclear factor

of activated T cell c1

（

NFATc1

），

PU.1

などの転写因 子の発現が調節されることによって破骨細胞分化が 進行する1,5）_{。とくに破骨細胞分化初期に}

_RANK

_シ グナルによって

NFATc1

の発現レベルが劇的に上昇 し，破骨細胞の前駆細胞に

NFATc1

を強制的に発現 させると

RANKL

の刺激なしで破骨細胞分化が誘導 されることなどの事実から

NFATc1

は破骨細胞分化 に必須な転写因子であると考えられている1,8～10）_。

Palmatine

は黄連（

Coptis Rhizoma

）や黄柏（

Phel-lodendri Cortex

）などの植物から単離されるプロト ベルベリン系のアルカロイドである11,12）_。

_Palmatine

の逆転写酵素活性に対する阻害作用は炎症あるいは 腫瘍に対して有効であるとの報告がある4,13～15）_。ま た

palmatine

に近い構造をもつイソキノリン・アル カロイドは骨粗鬆症モデルにおいて骨損失を阻害す ると報告されている16）_{。われわれは以前，}

_palmatine

が骨粗鬆症モデルにおいて骨量の減少を抑制するこ と11）_{，また破骨細胞のアポトーシスを誘導する可能} 性について報告した17）_{。しかしながら}

_palmatine

_の 破骨細胞分化に対する効果について本質的な証拠は な い。 そ こ で 本 研 究 で は，

RANKL

処 理 さ れ た

RAW264.7

細胞を用いて，破骨細胞マスター転写因 子である

NFATc1

に対する

palmatine

の影響を検討 した。 Ⅰ 材料と方法 1 細胞の培養 本実験で使用した

RAW264.7

細胞は，大日本住友 製薬㈱（大阪）から購入した。細胞株に

10

％牛胎児

血清（

Fetal bovine serum; Flow Laboratories

，

North

Ride

，

Australia

）を含む

D

︱

MEM

（

SIGMA JAPAN

，

東京）培地を用い，

37

℃，

5

％

CO

2条件で培養し，実

験に用いた。なお，すべての測定は

triplicate

にて

行った。

2 培養細胞への薬物投与

Palmatine

（

Palmatine Chloride

，

10605

︱

02

︱

4

；和光

純薬工業㈱（大阪））は

PBS

で溶解後に培地に溶解

され終濃度が

1

，

5

，

10

，

40

および

100

μ

M

になる

ように調整された18,19）_。また

_RAW264.7

_{細胞の分化}

を誘導する目的で

50 ng

╱

mL

の

RANKL

（

recombinant

mouse RANKL

，

462

︱

TEC

︱

010; R & D systems

，

Inc.

Minneapolis

，

MN

，

USA

）とともに培地に添加され た5）_。

3 細胞生存率の測定

細 胞 生 存 率 は，

Cell Counting Kit

︱

8

（

CCK

︱

8;

Dojindo

，熊本）を使用して測定された20）_{。細胞は，}

96

︱

well

︱

plate

に

5

⊠

10

3_╱

_well

_{の割合で播種され，}

₂₄

時間後に

palmatine

および

RANKL

を含んだ調整培 地に置換された。

24

時間後あるいは

5

日後，細胞は

3

回

PBS

で洗浄，

10

％

CCK

︱

8

試薬含有培地に置換 し，さらに

1

時間

37

℃で静置，

450 nm

の吸光度を 測定した。細胞生存率は得られた吸光度から以下の 公式に従って算出された。 細胞生存率（％）＝［

OD

（

experimental sample

）－

OD

（

blank

）］╱［

OD

（

control

）－

OD

（

blank

）］⊠

100

％

4 骨吸収活性の測定

RAW264.7

細胞は，骨吸収活性評価用プレート （

Bone Resorption Assay kit 24; PG research

，東京）に

5

⊠

10

4_╱

_well

_{になるように播種され，}

₂₄

_時間後に

palmatine

および

RANKL

含有培地に置換された。

5

日間培養後，培養上清

100

μ

L

が

96 well

プレートに

移され，

50

μ

L

の骨吸収試薬を添加後，蛍光強度測

定 プ レ ー ト リ ー ダ ー（

Twinkle LB970; Berthold

Japan

，東京）を用いて

excitation: 485 nm

，

emission:

535 nm

で測定された。さらに骨吸収活性評価用プ

レートの骨吸収像は，

5

％次亜塩素酸ナトリウムで

処理後，光学顕微鏡（

BX53

，

DP21

；オリンパス社，

東京）によって撮影された。 5 NFATc1の測定

NFATc1

発 現 は

Nuclear Factor Of Activated T

︱

Cells

，

Cytoplasmic 1

，

ELISA Kit

（

SEL941MU;

Cloud

︱

Clone Corp., Houston

，

TX

，

USA

）を用いて

測定された。

RAW264.7

細胞は，

24 well

プレートに

5

⊠

10

4_╱

_well

_{になるように播種され，}

₃₇

_℃，

₅

_％

_CO

2 の環境下で培養された。

24

時間後にパルマチンおよ び

RANKL

含有培地に置換された。

24

時間培養後， 細胞を回収して，付属のマニュアルに従って細胞質 分画のライセートを作製し，

ELISA

の測定に用い た。なお

NFATc1

の測定限界は

63 pg

╱

mL

であった。 6 NFATc1 mRNAの発現

RAW264.7

細胞は

1

⊠

10

4_╱

_well

_{となるように}

₂₄

well

プレートに播種され，

24

時間後に

palmatine

お よび

RANKL

含有培地に置換し，さらに

24

時間培 養した。細胞における

NFATc1

の遺伝子発現につい て

real

︱

time RT

︱

PCR

による相対的定量法により解 析を行った21）_。

_{total RNA}

_の抽出と

_cDNA

_合成には

TaqMan

®

_{Gene Expression Cells}

_︱

_to

_︱

_CT

TM

_Kit

（

Applied Biosystems

，

CA

，

USA

）を使用した。細 胞を

Lysis Solution

（

P

╱

N4383583

）で溶解して

total

RNA

を抽出後，逆転写酵素（

RTEnzyme Mix; P

╱

N438358

）と混合し，

T100 Thermal Cycler

（

Bio

︱

Rad

Co., Hercules

，

CA

，

USA

）を用いて

cDNA

を合成し た22,23）_。

_PCR

_{プライマーには}

_{TaqMan Gene}

Expres-sion Assay

を 使 用 し， タ ー ゲ ッ ト 遺 伝 子 と し て

NFATc1

（

Assay ID: Mm00479445_m1; Applied

Bio-sysytem

，

CA

，

USA

）を，内在性コントロールには

18S ribosomal RNA

（

Assay ID: Mm03928990_g1;

Applied Biosysytem

，

CA

，

USA

）を選択した。

ABI-PRISM 7900HT Fast Real

︱

Time PCR System

（

Applied Biosysytem

，

CA

，

USA

）を用いて，

95

℃

で

10

分間留置した後，

95

℃で

15

分および

60

℃で

1

分を

1

サイクルとして

40

サイクルの増幅反応を行

い22,23）_，

_{ABI PRISM 7900HT Sequence}

_︱

_Detection

System

（

SDS

）

sofyware 2.3

（

Applied Biosystem

，

CA

，

USA

）を用いて解析し22,23）_{，相対定量値（}

rela-tive quantification: RQ

値）を求めた24）_。

7 統計学的解析

各測定項目の値は，平均値±標準偏差（

mean

±

SD

）で示した。得られた値の有意差検定は一元配置

の分散分析（

ANOVA

）ならびに

post hoc

︱

test

とし て

Scheffe test

を用い，統計的有意水準は

1

％，

5

％未 満とした。 Ⅱ 結 果 1 骨吸収活性に対するpalmatineの影響 骨吸収活性評価プレートに

RAW264.7

細胞を

5

⊠

10

4_╱

_well

_{で播種し，}

₂₄

_時間後に

_{RANKL 50 ng}

_╱

_mL

および

palmatine

を含む培地に置換した。

5

日間の培 養後，

5

％次亜塩素酸ナトリウムで処理してカルシ ウム固層化プレートに形成された骨吸収窩（

pit

）を 光学顕微鏡にて観察した。その結果，

RANKL

添加 群は

control

群にくらべて

pit

が多く形成された。ま た

palmatine

濃度依存性に

pit

の数が減少し，吸収窩 は小さくなった（図

1）。また当該プレートの培養上

清中に溶出した蛍光標識リン酸カルシウム量を測定 したところ，

pit

の結果と同様に

RANKL

で有意に増 大する蛍光強度が

palmatine

濃度依存性に有意な減 少を認めた（図

2）。

2 細胞の生存率に対するpalmatineの影響

RAW264.7

細胞を

96 well

プレートに

5

⊠

10

3_╱

_well

で播種し，

24

時間後に

RANKL 50 ng

╱

mL

および

palmatine

を含む培地に置換した。

24

時間あるいは

5

日間の培養後，

Cell Counting Kit

︱

8

（

CCK

︱

8

）を用

いて細胞生存率を測定した。

24

時間培養では，

40

μ

M

以上の

palmatine

濃度で生存率が有意に減少し た（図

3A）。また

5

日間培養では，

control

群にくら べて

RANKL

添加群（

0

μ

M

）で有意に増加するのに 対して，

10

μ

M

以上の

palmatine

の添加で細胞生存

率は有意に減少した（図

3B）。

3 転写因子NFATc1に対するpalmatineの影響

RAW264.7

細胞を

24 well

プレートに

5

×

10

4_/

_well

で播種し，

24

時間後に

RANKL 50 ng

/

mL

および

palmatine

を含む培地に置換した。

24

時間の培養後， 培養細胞を回収して市販の

ELISA

キットにて細胞 内の

NFATc1

濃度を測定した。その結果，

control

群 にくらべて

RANKL

添加群（

0

μ

M

）で有意に増加す るのに対して，

10

μ

M

以上の

palmatine

の添加で

NFATc1

_{量は有意に減少した（図}

4）。

4 転写因子NFATc1のmRNAに対するpalmatineの 影響

RAW264.7

細胞を

24 well

プレートに

1

×

10

4_/

_well

で播種し，

24

時間後に

RANKL 50 ng

/

mL

および

palmatine

を含む培地に置換した。

24

時間の培養後，

Real time RT PCR

による

NFATc1 mRNA

を測定し た。 そ の 結 果，

RQ

値 は

control

群 に く ら べ て

RANKL

添加群（

0

μ

M

）で有意に増加するのに対し て，

1

μ

M

以上の

palmatine

の添加で

NFATc1 mRNA

発現は有意に減少した（図

5）。

図 2 骨吸収活性評価プレートを用いた蛍光標識リン 酸カルシウムの観察 RAW264.7細胞に対してRANKL（50 ng/mL）および palmatine（0, 1, 10, 40, 100 μM）を投与後，5日間培養 した骨吸収活性評価プレートの培養上清中に溶出した 蛍光標識リン酸カルシウム量をELISA法で測定した。 ＊＊_P＜0.01，†_{P＜0.05 vs. control} 図 1 骨吸収活性評価プレートにおける骨吸収窩の観察

RAW264.7細胞に対してRANKL（50 ng/mL）およびpalmatine（0, 1, 10, 40, 100μM）を投与後，5日間培養した骨 吸収活性評価プレートの吸収像。

○印が吸収窩を，barは500μmを示す。

Control（0μM） 0μM 1μM

Ⅲ 考 察 骨組織は骨リモデリングとよばれる骨芽細胞と破 骨細胞との微妙なバランスによって維持され，骨格 の形成だけでなく，筋や神経を含めた多くの生体機 能の調節に寄与する体内カルシウムの貯蔵庫として の 役 割 を も ち， さ ま ざ ま な 生 体 機 能 に 関 与 す る6,25∼29）_{。骨組織の代表的な疾患である骨粗鬆症} は，悪性腫瘍や脳血管障害，虚血性心疾患のように 疾患自体が生命をおびやかす病気ではないが，二次 的に起こる骨折による疼痛や日常生活動作の制限に よる介護など

QOL

を著しく低下させる30,31）_ととも に社会的経済負担の大きい疾患の一つである32）_。閉 経後の骨粗鬆症は，破骨細胞による骨吸収がおもな 要因である高回転型骨粗鬆症として知られ，破骨細 胞や骨芽細胞の分化および機能にかかわる分子機構 の解明および骨代謝を調節しうる物質の探索は高齢 社会を迎える国々において解決すべき必須の課題で ある。われわれはこれまでに

palmatine

が閉経後骨 粗鬆症の進行を抑制する候補物質になりうること， 図 3 _{細胞の生存率に対する}palmatine_の影響

RAW264.7細胞に対してRANKL（50 ng/mL）およびpalmatine（0, 1, 10, 40, 100μM）を添加して24時間（A） あるいは5日間培養（B）した後の細胞生存率をCell Counting Kit 8により測定し，以下の式で算出した。 （式）細胞生存率（％）＝［OD（experimental sample）OD（blank）］/［OD（control）OD（blank）］×100％

＊＊_P＜0.01，†_{P＜0.05 vs. control}

図 5 転写因子NFATc1のmRNAに対するpalmatine

の影響 RANKL（50 ng/mL）およびpalmatine（0, 1, 10, 40, 100 μM）を投与後，24時間培養したRAW264.7細胞におけ るNFATc1 mRNAの発現を観察した。 ＊＊_P＜0.01，†_{P＜0.05 vs. control} 図 4 転写因子NFATc1に対するpalmatineの影響 RANKL（50 ng/mL）およびpalmatine（0, 1, 10, 40, 100 μM）を投与後，24時間培養したRAW264.7細胞におけ るNFATc1の発現を観察した。 ＊_P＜0.05，†_{P＜0.05 vs. control}

また破骨細胞の機能を抑制する可能性について報告 した11,17）_{。しかしながら破骨細胞における細胞内伝} 達シグナルについての検討については行っていな い。そこで本研究では，破骨細胞様細胞である

RAW264.7

細胞における

RANKL

誘導性分化機構に 着目して，破骨細胞分化に対する

palmatine

の影響 を解明することを目的とした。 第一の検討では，

RANKL

誘導性破骨細胞による 骨吸収活性を観察した。骨吸収窩の画像から

control

群に対して

RANKL

を添加すると多くの骨吸収の痕 跡が認められ，今回の

RANKL

濃度（

50 ng

╱

mL

）が 至適に破骨細胞の分化・成熟を促していることを示 している。それに対して

palmatine

を投与すると濃 度依存的に骨吸収窩が減少し，破骨細胞による骨吸 収能が低下していることが推察された（図

1）。また

骨吸収能を示す培養上清中の蛍光標識リン酸カルシ ウム量の検討においても骨吸収窩の結果と同様に

RANKL

で有意に増大する蛍光強度が

palmatine

濃 度依存性に有意に減少したことは（図

2），骨吸収窩

の結果を客観的に支持し，

palmatine

が破骨細胞の 分化・成熟に直接影響することを示唆する。さらに

RAW264.7

細胞の

palmatine

に対する細胞生存率に ついて検討したところ，

5

日間培養後の生存率は

10

μ

M

以上の

palmatine

濃度で有意に減少しており，蛍 光標識リン酸カルシウム量の検討の結果と一致し た。これらの結果は先行研究である

Ishikawa

らの

palmatine

が破骨細胞様細胞の初期にアポトーシス を誘導する17）_{という見解を支持している。} 第二の検討では，

RANKL

誘導性破骨細胞による 細胞内伝達シグナルを観察した。まず

palmatine

の

24

時間刺激での細胞生存率を観察した結果，

40

μ

M

以上で有意な生存率の減少を認めた。次に破骨細胞 分化のマスター転写因子である

NFATc1

6,33,34）_が

pal-matine

に 依 存 す る か 検 討 し た と こ ろ，

10

μ

M

の

palmatine

添加で有意に減少することが判明した。 さらに

NFATc1 mRNA

については

1

μ

M

で発現量が 有意に減少していた。これらの結果は，

palmatine

が 転写因子である

NFATc1

の遺伝子発現を抑制して破 骨細胞の分化および成熟が制御されたことを示唆し ている。 破骨細胞は，骨基質の脱灰およびタンパク質の分 解を行う唯一の細胞である35～37）_{。生体での破骨細} 胞分化調節因子としては

M

︱

CSF

と

RANKL

に加え

TNF

︱αなど多種の生理活性物質が重要な役割を果 たしている25,27）_{。われわれの検討では閉経後モデル} 動 物 に

palmatine

を 投 与 す る と 骨 芽 細 胞 由 来 の

RANKL

分泌26）_{を制御することが判明しており}11）_， 骨芽細胞や骨細胞を介した骨免疫学的な作用と破骨 細胞への直接的作用をあわせもつ骨吸収抑制物質で ある可能性が示唆された。 結 論

Palmatine

は用量依存的に破骨細胞分化調節因子 である

RANKL

の分泌を制御し，破骨細胞の分化お よび成熟を抑制することから骨損失の予防に関与し ている可能性が推察される。 抄 録 目的

palmatine

は黄連などの生薬から分離される イソキノリン・アルカロイドである。われわれはこ れまでに

palmatine

が骨粗鬆症モデルにおいて破骨 細胞を減少させること，また

RAW264.7

細胞を用い て破骨細胞化の初期のアポトーシスを誘導する可能 性を報告した。しかしながら，破骨細胞分化あるい は骨吸収において，

palmatine

がどのように関与し ているか詳細は不明である。そこで本研究では

RAW264.7

細胞を用いて，破骨細胞分化および骨吸 収に関わる

NFATc1

発現に着目して

palmatine

の影 響を検討した。 方法 破骨細胞様細胞である

RAW264.7

細胞に

RANKL

（

50 ng

╱

mL

）および

Palmatine

（

0

，

1

，

5

，

10

，

40

，

100

μ

M

）を添加し，骨吸収活性，細胞の生

存率，転写因子

NFATc1

発現，

NFATc1 mRNA

発現

について検討した。

結果

RAW264.7

細胞に

RANKL

を添加すると骨吸

収，細胞増加，

NFATc1

発現，

NFATc1 mRNA

発現

のいずれにおいても有意に増加した。しかし

palma-tine

を添加群では濃度依存的にそれらのパラメー ターの有意な減少が認められた。 考察

Palmatine

は破骨細胞の転写因子

NFAIc1

を抑 制し，破骨細胞の分化および成熟を制御することが 推察された。

【利益相反】 本研究に関し開示すべき利益相反はない。 文 献 1）高見正道，上条竜太郎．破骨細胞分化の制御機構．生化 学2011; 83: 110︱4． 2）甲川昌和．Pax6によるNFATc1を介した破骨細胞分化 を制御する新たな転写調節機構．埼玉医大誌2006; 33: 35︱43． 3）久木田明子，菖蒲池健夫，久木田敏夫．破骨細胞の分化 と機構を制御する転写因子の役割．化と生2012; 50: 488︱97．

4） Lee JW, Mase N, Yonezawa T, Seo HJ, Jeon WB, Cha BY, et al. Palmatine attenuates osteoclast differentiation and function through inhibition of receptor activator of nuclear factor︱κB ligand expression in osteoblast cells. Biol Pharm Bull 2010; 33: 1733︱9.

5） Choe CH, Park IS, Park J, Yu KY, Jang H, Kim J, et al. Transmembrane protein173 inhibits RANKL︱induced osteoclast differentiation. FEBS Lett 2015; 589: 836︱41. 6） Walsh MC, Kim N, Kadono Y, Rho J, Lee SY, Lorenzo J, et

al. Osteoimmunology: interplay between the immune sys-tem and bone metabolism. Annu Rev Immunol 2006; 24: 33︱63.

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受理日（2016︱05︱18），採択日（2016︱06︱20）