Title
Studies on the Modes of Action Underlying a Food Contaminant,
Ochratoxin A-induced Renal Carcinogenesis in Rodents( 内容と
審査の要旨(Summary) )
Author(s)
日比, 大介
Report No.(Doctoral
Degree)
博士(獣医学) 甲第379号
Issue Date
2013-03-13
Type
博士論文
Version
none
URL
http://hdl.handle.net/20.500.12099/48005
※この資料の著作権は、各資料の著者・学協会・出版社等に帰属します。氏名(本(国)籍) 主 指 導 教 員 名 学 位 の 種 類 学 位 記 番 号 学位授与年月 日 学位授与の要件 研究科及び専攻 研究指導を受けた大学 学 位 論 文 題 目 審 査 委 貞 (16) 日 比 大 介(大阪府) 岐阜大学 教授 柳 井 徳 磨 博士(獣医) 獣医博甲第379号 平成25年3月13日 学位規則第3条第1項該当 連合獣医学研究科 獣医学専攻 岐阜大学
Studies on the Modes of Action Underlying a Food
Contaminant,Ochratoxin A-induced Renal Carcinogenesisin Rodents (食品汚染物質オクラトキシンAのげっ歯類における腎 発がん機序解明に関する研究) 主査 岐阜大学 教 授 副査 帯広畜産大学 教 授 副査 岩手大学 教 授 副査 東京農工大学 教 授 副査 岐阜大学 教 授 副査 岐阜大 学 教 授 丸 尾 幸 嗣 古 林 与志安 御 領 政 信 渋 谷 淳 柳 井 徳 磨 西 川 秋 佳 論 文 の 内 容 の 要 旨 オクラトキシンA(OTA)はカビ毒の一種であり,穀類等の食品の汚染物質 として広く知られている｡.OTAは,げっ歯類で近位尿細管S3セグメントから進 展する腎臓腺腫/癌を高頻度に誘発し,ヒトではバルカン腎症あるいは上部尿 路癌の原因物質となる可能性が指摘されている｡しかし,各種迫伝毒性試験で 明確な陽性結果は認められておらず,その腎発がん機序は明らかでない｡ヒト は食物から日常的にOTAを摂取する可能性があるため,その腎発がん機序を解 明することは,食品のリスク評価において必要である｡本研究では,OTA誘発 腎発がん機序を解明する目的で,レポーター迫伝子導入動物である邸Jdeltaラ ットあるいはマウスを用いて,腎臓での加1血相変異原性評価,病理組織学的お
-140-よび網羅的迫伝子発現解析を含めた分子病理学的解析を行い,OTA誘発腎発が ん機序における遺伝毒性メカニズムの関与の可能性を調べた｡ 第一章では,OTA誘発腎発がん機序への遺伝毒性の関与を調べるために,発 がん用量のOTAをgptdeltaラットに投与し,腎臓の病理組織学的所見,腎臓ゲ ノムDNA中のレポーター遺伝子における遺伝子変異頻度(MFs)および酸化的 DNA損傷の指標である8-hydroxydeoxyguanOSine(8-OHdG)形成畳について検索 した｡実験1では,雌雄のgptdeltaラットにOTAを5ppmの投与濃度で4ある いは13週間混餌投与したところ,雌雄共に腎臓髄質外帯外層部の近位尿細管上 皮細胞にアポトーシス,カリオメガリーおよび空胞化が認められたが,点突然 変異頻度を示すgptMFs,欠失変異頻度を示すSPi-MFsおよび8-OHdG形成量に 顕著な差はみられなかった｡実験2では,雄のgptdeltaラットに実験1と同用 量のOTAを4週間混餌投与し,腎臓を皮質(COR)および髄質外帯(OM)に つき検索したところ,CORではgptおよびSpi MFs共に対照群との有意差は認 められなかった｡一方,OTAの毒性･発がん標的部位を含むOM-では,gPtMFs に変化はみられなかったが,Spi.MFsに有意な上昇が認められた｡また,8-OHdG 形成量にはCORおよびOM共に有意差はみられなかったことから,ラットにお けるOTA誘発腎発がん機序には,酸化的DNA損傷以外の遺伝毒性メカニズム が関与することが示唆された｡ 第二章では,OTA投与で変動した遺伝子発現を網羅的に遺伝子発現解析し, CORとOM間で比較検討した｡さらに変動迫伝子のいくつかはrealtimeRトPCR
法によりmRNA発現レベルの検索を行ったご網羅的迫伝子発現解析では,COR
で1796個,OMで1726個の発現変動遺伝子を検出した｡その内,CORでは変 化は認められずOMにおいてのみ発現変動が認められた迫伝子として,mA二 重鎖切断修復に関わる(C鹿足,凡慮朋,βゆjおよびβ化Cjなど),細胞周期促 進に関わる(Ccnel,Ccna2およびCcnblなど),DNA損傷応答を介したG2Marrest 誘発に関わる(Cheklおよび一柁el),Bcl-2family(BaklおよびBik),がん抑制 迫伝子p53に関わる(P朋血jおよびCゐ粛など)遺伝子群が抽出された｡これら避伝子の多くはrealtimeRTIPCR法においてもmRNAレベルの有意な発現増加 あるいは減少が確認された｡しかし,酸化的ストレスに関連した遺伝子群につ
いては,COR,OM両部位間で変化した迫伝子の数および機能に差は認められな
かった｡これらのことから,OTAが標的部位において強いDNA損傷を誘発し, そして酸化的ストレス以外の他の因子から引き起こされるDNA二重鎖切断が OTAの変異原性を引き起こしていることが示唆された｡ 第三章では,〆j欠損条件下でのOTA誘発変異原性,アポトーシスおよびカ リオメガリーへの影響を検討するために,p5j正常あるいは〆j欠損邸拍elta マウスに発がん用量を含む0,1および5mg/kgを4週間強制経口投与し,腎臓 における加Ⅴ地変具原性評価,p53タンパク質発現および病理組織学的検索を 行ったop53正常gptdeltaマウスの5mg此g投与群において,P53タンパク質 発現の顕著な増加が認められた｡〆J正常邸=iぬマウスでは,OTA投与によ りgptおよびSpi MFsに変化は認められなかったが,P53欠損gptdeltaマウス の5mg此g投与群において,gPtMFsに変化はみられなかったものの,Spi･MFs は対照群と比較し有意な上昇を示した｡さらにOTA誘発アポトーシスおよびか リオメガリーはp53正常gptdeltaマウスの5mg/kgと比較して,同用量のp53 欠損gptdeltaマウスにおいて増加した｡P53はDNA二重鎖切断における相同組 換え修復を制御することから,OTA誘発欠失変異がDNA二重鎖切断に対する相 同組換え修復過程において引き起こされている可能性が示唆された｡また,OTA 誘発アポトーシスおよびカリオメガリーはDNA損傷を反映あるいは遺伝毒性ス トレスの排除を示唆する現象であると考えられた｡ 本研究から,OTA誘発腎発がんに酸化的DNA損傷以外の遺伝毒性メカニズム の関与が強く示唆された｡次いでOTA誘発変異原性はDNA二重鎖切断の相同 組換え修復過程において引き起こされていることが示唆された｡これらの結果 は,OTA誘発腎発がん機序の解明に新たな知見を提供し,食品の安性全評価に 大きく貢献するものと考えられた｡-142-審 査 結 果 の 要 旨 カビ毒の一種であるオクラトキシンA(OTA)は,げっ歯類で近位尿細管S3セグメント から進展する腎臓腺腫/癌を誘発することが知られている｡また,ヒトではバルカン腎症 あるいは上部尿路癌の原因物質である可能性がある｡しかし,その各種辿伝毒性試験明確 な陽性結果が認められておらず,その腎発がん機序は明らかでない｡本研究では,Omの 腎がん誘発の機序解明を目的とし,レポーター迫伝子導入の邸fdeltaラットあるいはマウス を用いて,加v地変異原性評価,病理組織学的検索および網羅的迫伝子発現解析による分子 病理学的解析を行い,OTA誘発腎発がんにおける遺伝毒性メカニズムの関与を検討した｡ 第一章では,OTAの腎がん誘発機序への遺伝毒性の関与を調べるため,発がん用量のOTA をgptdeltaラットに投与し,腎臓の病理組織,腎臓ゲノムDNA中のレポーター迫伝子にお ける避伝子変異頻度(MFs)および酸化的DNA損傷の指標として知られる 8-hydroxydeoxyguanOSine(8-OHdG)形成量について検索した｡すなわち,雌雄のgptdelta ラットに5ppmを餌に混じて4あるいは13週間摂取させたところ,OTA投与群の雌雄にお いて,腎臓髄質外帯外層部の近位尿細管上皮細胞にアポトーシス,カリオメガリーおよび 空胞化が認められた｡さらに,雄の邸JdeltaラットにOmを4週間混餌投与し,腎臓を皮 質(COR)および髄質外帯(OM)に分けて検索したところ,CORではgptおよびSpi-MFs 共に有意差は認められなかった｡これらの結果から,酸化的DNA損傷以外の迫伝毒性メカ ニズムがラットにおけるOTA誘発腎発がん機序に関与することが示唆された｡ 第二章では,OTA誘発腎発がん機序に関連する迫伝子群を同定するため,網羅的遺伝子 発現解析によりOTA投与で変動した迫伝子発現をCORとOM間で比較解析し,さらに変 動した迫伝子のいくつかはrealtimemPCR法によるmRNA発現レベルの検索も行ったと ころ,皮質部で1796個,髄質外帝都で1726個の発現変動迫伝子が検出された｡その内, 皮質部では変化は認められず髄質外帯部においてのみ発現変動が認められた迫伝子として, DNA二重鎖切断修復に関わる(αeれ助〟β,βゆノおよびβ打Cjなど),細胞周期促進に 関わる(Ccnel,Cbna2j3よびCcnblなど),DNA損傷応答を介したG2几4arrest誘発に関わ る(C丸山〃および恥ej),Bcl-2血mily(助たJおよび励),がん抑制迫伝子p53に関わる(タカ肋j およびC血路など)迫伝子群が抽出された｡これらのことから,OTAは標的部位に強いDNA 損傷を誘発し,次いで酸化的ストレス以外の他の因子で引き起こされるDNA二重鎖切断が, OTAの変異原性を引き起こしている可能性が示めされた｡ 第三章では,〆j正常あるいはタブj欠損汐fdeltaマウスに発がん用地を含む0,lおよ び5mg此gを4週間強制経口投与し,■腎臓におけるinvivo変異原性評イ軋p53タンパク質発 現および病理組織学的検索を行ったところ,P53正常BPtdeltaマウスの5mgA(g投与群に おいて,p53タンパク質発現の顕著な増加が認められた｡OTA誘発欠失変異がmA二重鎖 切断に対する相同組換え修復過程において引き起こされていること,さらにOTA誘発アポ トーシスおよびカリオメガリーは,mA損傷を反映あるいは辿伝毒性ストレスの排除を示 唆する現象である可能性が考えられた｡ 本研究から,OTA誘発腎発がんに酸化的DNA損傷以外の迫伝毒性メカニズムの関与が強 く示唆された｡そしてOTA誘発変異原性はDNA二重鎖切断の相同組換え修復過程におい
て引き起こされることが示唆された｡ これらの結果は,On誘発腎発がん機序の解明に新たな知見を提供し,食品の安性全評 価に大きく貢献するものと考えられた｡ 以上について,審査委員全員一致で本論文が岐阜大学大学院連合獣医学研究科の学位論 文として十分価値があると認めた｡ 基礎となる学術論文 1)題 目‥Site-SpeCi瓜cinvivomutagenicityinthekidneyofgptdeltaratsgivena CarCinogenicdoseofochratoxinA 著 者名‥Hibi,D.,Suzuki,Y,Ishii,Y,Jin,M.,Watanabe,M.,Sugita-Konishi,Y,Ⅵmai,T, Nohmi,T.,Nishikawa,A.andUm寧mura,T. 学術雑誌名:TbxicologicalSciences 巻･号･頁･発行年月:122(2):406-414,2011 2)題 目‥MolecularmeChanismsunderlyingochratoxinA-inducedgenotoxicity:Global geneexpressionanalysISSuggeStSinductionofDNAdouble-Strandbreaksandcell CyCleprogression 著 者 名‥Hibi,D.,Kiiima,A.,Kuroda,K.,Suzuki,Y,Ishii,Y,Jin,M.,Nak再ima,M., Sugita-Konishi,Y,Ⅵnai,Tl,Nohmi,Tl,Nishikawa,A.andUmemura,T 学術雑誌名:TheJoumalofTbxicologicalSciences 巻･号･頁･発行年月:inpress 既発表学術論文 1)題 目‥Thee蝕ctofantioxidantOndevelopmentof丘brosisbycisplatininrats 著 者 名:Kawai,Y,Satoh,T.,Hibi,D.,Ohno,Y,Kohda,Y,Miura,K.andGemba,M. 学術雑誌名:JoumalofPharmacologicalSciences 巻･号･貢･発行年月:lll(4):437-439,2009 2)題 目:ExperimentalintranaSalinfectionofequineherpesvirus9(EHVづ)insuckling hanSterS:KineticsofviraltranSmissionandinnammationinthenasalcavltyand brain 著 者 名:El-Habashi,N.,El-Nahass,El-S.,Fukushi,H.,Hibi,D.,Sakai,H.,Sasseville,V mdlねnai,T. 学術雑誌名:JournalofNeurovirology 巻･号･貢･発行年月:16(3):242-248,2010
-144-3)題 目:OxidativeDNAdamageandreportergenemutationintheliversofgptdeltarats givennon-genOtOXichepatocarcinogenswithcytochromeP450-induciblepotency 著 者 名:Tbsaki,M.,Umemura,T.,Suzuki,Y,Hibi,D･,Inoue,T･,Okamura,T･,Ishii,Yl, Maruyama,S.,Nohmi,T.andNishikawa,A･ 学術雑誌名:CancerScience 巻･号･頁･発行年月:101(12):2525-2530,2010 4)題 目‥InvestigationofcarcinogenicityforlevamisoleadministeredinthediettoF344 ra土S 著 者 名:Hibi,D.,lmazawa,T.,Kiiima,A.,Suzuki,Y,Ishii,Y,Jin,M.,Umemura,T.and Nishikawa,A, 学術雑誌名:FoodandChemicalTbxicology 巻･号･貫･発行年月:4即12):332l-3326,2010 5)題 目:Uterinecarcinosarcomaina2-year-01dftmalewistarhannOVerGALASrat 著 者 名:職kami,S.,Ogawa,K.,Umemura,T.,Hibi,D.,Ishii,Yl,Okamura,T,Thsaki,M･, Inoue,T.,Suzuki,Y,Jin,M.,Cho,YM.andNishikawa,A. 学術雑誌名:JoumalofTbxicologicPathology 巻･号･貢･発行年月:24(1):63-67,201l 6)題 目:E飴ctsofequineherpesviruS-9inftctioninpregnantmiceandhamsters 著 者名:El-Habashi,N.,El-Nahass,E.,Fukushi,H.,Nayel,M.,Hibi,D.,Sakai,H.and Ⅵmai,T. 学術雑誌名:JoumalofComparativePathology 巻･号･頁･発行年月:144(2-3):103-112,201l 7)題 目:Detectionandquanti丘cationofspeCiBcDNAadductsbyliquid Chromatography-tandemmassspectrometryintheliversofratsglVeneStragOleat thecarCinogenicdose 著 者 名:lshii,Y,Suzuki,Y,Hibi,D.,Jin,M.,Fukuhara,K.,Umemura,T.andNishikawa, A. 学術雑誌名:ChemicalResearchin7bxico)ogy 巻･号･頁･発行年月:24(4):532-541,2011 8)題 目:Comprehensivetoxicitystudyofsa丘01eusingamedium-termanimalmodelwith gptdeltarats 著 者名:Jin,M.,Ki3ima,A.,Suzuki,Yl,Hibi,D.,Inoue,T･,Ishii,Y,Nohmi,T.,Nishikawa, A.,Ogawa,K.,andUmemura,T. 学術雑誌名:Tbxicology 巻･号･貢･発行年月:290(2-3):312-32l,2011
9)題 目:PossibleinvoIvementofgenotoxicmechanismsinestragole-induced hepatocarcinogenesisinrats 著 者 名:Suzuki,Y,Umemura,T.,Hibi,D.,Inoue,T.,Jin,M.,Ishii,Y,Sakai,H., Nobmi,T･,Ⅵmai,T,Nishikawa,A.andOgawa,K. 学術雑誌名:ArchivesofTbxicology 巻･号･真･発行年月:86(10):1593-1601,2012 10)題 目:h7Vivogenotoxicityofl-methylnaphthalene舟omcomprehensivetoxicitystudies WithB6C3Flgptdeltamice 著 者 名:Jin,M.,K毎ima,A.,Suzuki,Y,Hibi,D,,Ishii,Y,Nohmi,T.,Nishikawa,A., Ogawa,K.andUmemura,T. 学術雑誌名:TheJoumalofTbxicologicalSciences 巻･号･貫･発行年月:37(4):711-72l,2012 11)題 目:PossibleinvoIvementofsulfotranSferaselAlinestragole-inducedDNA modi重cationandcarcinogenesisintheliversofftmalemice 著 者 名:Suzuki,Y,Umemura,T,Ishii,Y,Hibi,D.,Inoue,T.,Jin,M.,Sakai,H.,Kodama, Yl,Nohmi,T.,Yanai,T.,Nishikawa,A.andOgawa,K. 学術雑誌名:MutationResearch 巻･号･頁･発行年月:749(l-2):23-28,20Ⅰ2
