氏名 (本籍)
学位の種頬
学位授与番号
学位授与目付
学位授与の要件
学位論文題目
審 査 委 員
安 田 成 雄(岐阜県)
博
士(医学)
乙第1101号
平成
9
年1月16
日
学位規則第4粂第2項該当
スーパー抗原StaphylococcalEnterotoxin
Bによる肝障害･致死作用と
その機序に関する研究一特にエンドトキシンとの対比
(主査)教授 武 藤 泰 敏
(副査)教授
藤
原
久
義 教授 安 田 圭 吾
論 文 内 容 の 要 旨
草色ブドウ球菌由来の細菌性スーパー抗原であるstaphylococcalenterotoxinB(SEB)をD一ガラクトサミン
(GalN)に感作されたマウスに投与すると.グラム陰性菌由来のエンドトキシン/1ipopolysaccharide(LPS)
と同様.肝に広範な出血性肝細胞障害を伴う致死作用が惹起されることが報告されているQこれらの作用はt
sEB投与後に血中のTNF一αやIFN-γが上昇することや,これらサイトカインに対するモノクローナル抗体を予
め投与しておくことでSEBの致死作用が抑制されることより.SEB自身の直接作用よりもむしろSEBにより誘導
されたサイトカインによって引き起こされるものと考えられている｡
そこで申請者は,StaphylococcalenterotoxinBにより惹起される肝障害と致死作用をエンドトキシンによる
それと対比し.これらのトキシンの作用機序を比較検討した｡
材料及び方法
(l)LPSおよぴSEBの致死作用:GalNにより感作されたC3H/HeNマウスおよびC3H/HeJマウスにLPa SEB
を各々投与した｡そして.48時間後の生存率と肝の組轍学的変化を検討した0(2)血清サイトカイン測定用サン
プルの採取:C3H/HeN,C3H/HeJマウスの各々にGalN20mg+SEBlOOFLg･GalN20mg+LPSIFLgを投与し･
投与2時間後に下大静脈から血液を採取した｡血液は3,000rpm,15分間の遠心にて･血清を分離しTNF-a･
IFN_γ,Ⅰし2,Ⅰし1αの分析まで-80℃で保存した｡(3)i几Uか0でのマウス脾リンパ球によるTNF一αの産生‥
肺リンパ球は肺細胞浮遊液を作製後.比重分離液を用いて分離した｡10%牛胎児血清と30〝g/mlのカナマイシ
ンを添加したRPMI1640培地でマウスリンパ球を2×106cells/miの濃度になるように調整し,24ウエルのプラ
スチックディッシュに播種した｡SEBとLPSを各々10ng/ml.10FLg/mlの濃度で添加し,37℃で24時間培養し
た｡培養液を吸引し,その上清を採取し,TNトαの分析まで-80℃で保存した0(4)よれUか0でのマウスマク
ロファージによるTNF-αの産生:腹腔内に3%の無菌性のチオグリコレート培地を注射して.腹腔渉出細胞よ
り分離したマクロファージを1.0×10ソmlの濃度になるように調整し,24ウエルのプラスチックディッシュに各々
1mlを分注した｡CO,インキュベーター内で3時間静置後,プレートを30秒間振塗した乱温PBSで2回洗浄し,
非付着細胞を取り除いた｡次に,各ウエルに10%牛胎児血清と30〃g/mlのカナマイシンを含むRPMI1640培地
を1ml加え,-sEBとLPSを各々10ng/ml,10fLg/mlの濃度で添加した｡その後,37℃で24時間培養した後･
上澄み液を吸引し.3,000rpm.10分間遠心し,その上澄み液をTNF-aの分析まで-80℃で保存した○(4)TNF-a,IFN_†.IL-2.IL-1aの分析:Genzyme杜のマウスサイトカインイムノアッセイキットを用いて.酵素抗
体法(ELISA)により測定した｡なお,統計学的処理として2群間の比較検定にi享Student's t-teStを行い,検
討した｡
結 果
(1)LPSおよびSEBの致死作用:GalN20mg単独投与群においては一48時間後の生存率は両マウスともに100%
であった｡GalNと同時にLPSを投与したところ.C3H/HeNマウスではすべて死亡したが.C3H/HeJマウスで
は致死作用は全く認められなかった｡一方.SEBを単独投与した場合,C3H/HeNマウス,C3H/HeJマウ不の
両マウスともに致死作用は認められなかったが.GalNとの併用によりSEBlOOfLgの投与でC3H/HeNマウス･C
3H/HeJマウス両群に致死作用が惹起された｡(2)肝組嶽所見‥C3H/HeNマウスでは,GalN+･SEB(200FLg),
GalN+LPS(2FLg)投与時の肝の組織像は.広範な出血性鱒細喝障軍甲像を呈していた0一方･､C3H/HeJマ
ウスでは,GalN+SEB(200FLg)投与時の肝の組織像は,同様の肝純昭障害像を示したが..G年1N+LPS(2FLg)
投与では肝細胞障害を認めなかった｡(3)SEB.LPSによる血清中サイトカインJTの影響:C3H/HeNアウスと
C3H/HeJマウスにLPSを投与した場合,2時間後の血清TNF-g値昼.LPS感受性マウスであるC3H/HQNマウ
スでは2693±1125pg/mlと著明なTNF-aの上昇が認めら=TLキ町こらps面胆であるC鱒/H9Jアウスで甲pg/
ml以下古土昇し一.坤.った｡一丁方t
SEBを授与した場合,血清丁岬｢_q嘩はトミC殖/巧eNマウスで101±.27pg/ml,
C3ti/Hejマらス壱103i=47pg/甲膵bOL:庵ヤスと岬等や耶‥岬上昇力畢斡与れた0岳EB投与2時間後
の血清IFN-γ値は,C3H/HeNマウ
スで4450±2畠77pg/nil,C叩/H9Jマウネや云71±1445pg/mlと著明な上
昇が認められた｡しかし,LPS嘩与マチスで昧そ￠上翠は軽度で夷っ車こ∴SE坤与2時間後の血痕m-2値は,
C3H/HeNマウスで1047'±590pg/ml∴C3H/heJマウスで白57±298pg/ふ1であった｡LPS投与群でほすべて測
定感度以下であった｡IL-1aはSEB,LPS投与群ともすべて測定感度以下であった｡(4)マウス陣リンパ球に
おけるSEBあるいはLPSによるTNF-aの産生刺激:SE邑を10ng/申1及び10FLg/ml添加した場合,TNF-a値は
C3H/HeNマウスで366±36.931±32pg/ml,C3H/HeJマウスで337±138,899±97pg/mlであり.C3H/HeN
マウスとC3H/HeJマケスの間でTNF-tt産生には有意差を認めなかったム▲一方,'LpSを10壷/mlおよぴIO元/
ml添加した場合,･､C3H/HeNマウス婆舶31±58,-972±51bg/hl,C如/HeJすケスでは233±由/855±44pg
/mlであり,C3H/房eNラヴ如こおいて有意it高い甑F-dlわ産生能が認められた(P<0.05)｡･:･(5ト与'り又々ク
ロラケージにおけるSEBあとる小ばLPSに-よるTNF-､aノめ産生刺激声S軸を10ng/hll及び10毎/山鹿如した場合;
TNF-a値はC3H/HeNヤウズモ紬±0.-4226j=186由/血トC餌/HeJ寺サえせ7､±2∴9±4わg/ml さあり;
C3H/HeNマウスにおいて有意に高値を示した(P<O.bl)さ二万,号Lpsを10ng7klおよU'iOFL倉/ml添加した場
合,■C3H/HeNマウスではJ2433主r410,3243±430p占/血`C3H/HeJマウスセは153:±26,2141主f80pg/mlで
あり,C3H/HeNマウスにおいて有意に高値を示した(P<0`.05)｡■一
漆研究において申請者は･S舶により惹起さ一れる病態をLpsによ竿それ摘比し∴由泊ゐ作用癖を凝れキ0
トキシン投与2時間後の血清TNF一α､を測定したとこち,七縮投与鋲e細/自eN与すスでは極めて著明な輔女●-α
の上昇がみちれた￠に対し.′･･C3H/HeJマウースではT■NF｣αば検由されなカゝYった∴エか-SEBを疫与し美瘍合,
c3H/鵬虹C3H/白eJ′マウズそ中等度如N女-αの上寿が認めちれた｡一:
また/マーク占フし';セジた料ナる佃戸-ん
の産生能は.C3白/HeJ七,ウスた患いてLf･S,SEB利敵ともにC3白/H試惇ウズに比して著明に低下していた永
脾リンパ球におけるS由利執土よるTNF-i産生能はC3H/白6Ni:ヶス,-c3HノHe謳ウスにおい{有意差が認
められなかった｣ょこれより'
細Bに三よるサ醇産生刺激は,LPSめ卓れとは作用機序か異なっており∴由Bやはで細
胞由来め､TNFを,Lpsセはヤク占与{⊥ジ由来ゐTNFを介しセ腑障象ゝ致尭作用を生七千させてい右もめ七考え
られた｡また
,C3H/HeJマウスモは｢マク`占′ファージた削､て外来刺激た対するTNF-α誘導能が低下し七い
ると考えられたd
●
ヽ ▼ l
一･.･
論文審査の結果の要旨
申請者憲安田戯酎ま,Staphylococcalentefoto叉in`もにより惹起される肝障害∴致死作用が,T細胞由来の
t｡露｡rneCr｡SISfact｡r
aを介していること盲萌占あ)にした｡この新知見ゝは肝臓病学の進歩に少なカiらず寄与す
るもめrと認める｡
l･
[主論文公表誌]
スーパー抗原StaphylococcalEnterotoxin Bによる肝障害･致死作用とその機序に関する研究一特にエンド
トキシンとの対比
平成9年1月発行予定､-岐阜大医紀 45(1)
､ メ
⊥
