抗腫瘍性溶連菌 有 関す 効因子 研究

3 4 金 沢大 学 十 全 医 学会 雑 誌 第89巻 第1 号 3 4 ^‑4 6 (1 98 0)

抗 腫 瘍 性 溶 連 菌^の 有^{効 因子 に}関 す^る研 究

第⁵ 報 有効 因 子よ り^の溶血性物 質分 離 除 去 実 験

金 沢 大学 医 学 部 薬理学 教 室 (主 任^: 正 印 達 教 授)

河 野 照 茂

(昭和^{5 4}年^{1 2} 月^{2 0}日受 付)

リボ核 酸^によ る溶 連 菌 溶 血 毒 素^{str e}ptolysin S 増 産 効 果す な わ ち核 酸 効 果^りの研 究に端を発して行な わ れ た 溶 連 菌 ^に よ る 実 験 的 制 が ん 研 究 ^で

Str eP tOlysin S 産 生 能を有 する溶連 菌^に制が ん能が み ら れ ること²切ⁱ実験 的^に証 明さ れ たことによ り腫 瘍 患 者^に丹 毒が併 発す る と腫 瘍が縮 少 ^･消 失す る と^いう 古^い臨 床 家^の報 告^3Iを実 験 的^に証 明す る と と もに,溶 連 菌によ る ^一 連^の制が んに関 する実 験 的 研 究が行な わ れ る よ うになっ た^. 実 験は や が^て溶 連 菌^の無 毒 化と制が ん能 増 強 化^の方 向^へ と進みt その結 果 新しい制が ん剤 P C ^‑ B ^‑ 4 5 (O K ^‑ 431^4持)及び その凍 結 乾 燥 模 品 O K ^‑ 432^珊) が開発さ れ るに至っ た^{. 一}方^{, こ}れ ら

一 連の研 究と と もに抗 腫 瘍 性 溶 連 菌^の有 効 因 子^に関す る研 究も行な わ れ,抗 腫 瘍 性 溶 連 菌Su 株 ( 以 下S^u 菌 と略 記) ^の無 細 胞抽 出液よ り硫 酸^{アンモニ ウ ム の}濃 度 別 分 画 沈 澱 法^によっ てエ ^ー ルリ^{ッ ヒ}が ん細 胞^に抗が ん 活 性を有し⁷⁾.その他^の可 移 植 性 腹 水 腫 瘍 細 胞に対して も細 胞 傷 害 性を も^{つ2 0)}分 画 60 F が分 離さ れ るに至っ

た^. 同分 画^{につ い て}は腫 瘍 細 胞 傷 害 性^のほ か常^に溶 血 活 性が あ る^こと^{7 抑}並びに同分 画^の本 態は タ^{ン パ} クであ り, 他^に核 酸 体, 多糖 類が若 干 含ま れ^{て い}る^こと^丁),及 び タン パク も^{一 つの}も^{の で}な く数 種 類^の タ ン パ ク が 60F分 画^に混 在す る^こと も報 告さ れて いる.

溶 連 菌^の抗 腫 瘍 能と str ep tolysin S 産 生 能と は密 接な関係に あ る^{仰 1 )}が, し か し な が ら同菌^の腫 瘍 細 胞 傷害 作 用が溶 連 菌 生 菌体ま た は菌 体 内成 分^によ るのか 或^いは菌 体 外 溶 血 毒 素(^{str e}ptolysin S 及び str ep ^･ t olysin O)ま た は G in sbu rg ら^{1 1)1 4)} の いわ ゆ るC ell bo u nd he m ol_ysin によ る^のか は未 解 決^のま まであ^っ

Studie s o n the A ntic a n c e r Fa cto r(^S) ^{fr o m}

た.

一方,抗 腫 瘍 性6 0 F 分 画も常にStr eptOlysin S産 生 能を有す る溶 遵 蘭か ら^のみ え る^こと ができ, し かも 同 分 画^には常^に溶 血 徳 性が あ ること⁸⁾か ら,6 0 F 分 画に おい ても その抗 腫 瘍 作 用が溶 血 活 性 物 質^によ るのか或

いは溶 血 活 性 物 質が た ま た ま同 分 南 中^に混 入して い て

抗 腫 瘍 性 物 質^と溶 血 活 性 物 質が別^のもの であ る かにつ い て は明ら かでな か った^. これ らの こと か ら本 研 究^で は60F 分 画^の精 製と溶 血 活 性 物 質^の分 離 除 去を目 的 と して実 験を行ない_, 抗 腫 瘍 徳 性と溶 血 活 性につ い て

考 察を行な^った^.

材 料お よび方 法

1,60F 分 画^: 60F 分 画を S hoin の方 法^7)によって 調 製し た^. す な わ ち, 教 室 保 存^の溶 遵 薗Su 株 (Su 菌^t T y pe 3 )^の18 時 間 肉 汁ブ イ^{ヨ ン}培 養 液3 0 0 mL を 5L の

3 % 酵 母^エキス培 地^￠)(pfi 7.1) ^に接 種し,37 ℃で2 4 時 間 培 養し たのち培 養 液を冷 却して低 温 下で連 続 遠^JL^､

(1 2,0 0 0rpm t1 2 0 mL /min) して集 菌し, 菌 体を冷生 理食 塩 水^で2 回 洗 浄し たのち冷 蒸 留 水^に浮 遊さ せ た｡

これにさ ら に適 量の蒸 留 水^を加えて薗 海 産が O D 260

n m( 日立^一 塊 場^spe ctr o nic s20)^で4 0 にな る よ うに調 整し た. 次い で7 0mエ^の細 胞 破 砕 用 瓶 (^{ブラ ウ ン}社 製)

にSu 菌 浮 遊 液 30^Inは ガラ ス粒 (ブラ ウ ン 社 製. 径 0 .1 ^{m m})4 0g を入れ^て細 胞 破 砕 機 ( ブラ ウン社 製) によ り 二酸 化 炭 素ガスに よ る冷 却 下で 4,000rpm2 分

●

間2 回 ( 計4 分 間) ^{ホ モ} ジ ネ ^ー トし たのち, 直ちに ホ モ ジ ネ ^ー ト液を ガラ スろ過 器 (^{G l}) ^でろ過してろ液 ( 無細 胞 抽 出液 c ell fr e e e xtr a ct)を採 取し,これに硫 酸^ス

トレプトマイ^シンを最終 濃 度^{が 2 % にな る よ うに}加え

Gr o up A Str ep t^{o c o c c}i. Pa rt 5 . R e m o v al Exp^{e r}im e nt of H e m ol_{y t}ic Substa n c e fr o m A ntic a n c e r Fa cto r 6 0‑ F ^{. Te r u shi}g^･e K ohn o,

D ep^{a r}tm e nt of P ha r m a c olog y

■

( ^{D ire cto r : Pr of. S . S hoin}), Scho ol of M edicine

,

K a n a z a w a U ⁿiv e r si_{t y}.

抗 腫 瘍 性 溶 連 菌^の有 効 因 子に関する研 究

て低温 下^で30 分 間 放 置し た^のち,遠心に よ^っ て沈澱物 を除 去し た^.え ら れ た上 宿 液を V isk iⁿg の セ ルロ ^ー ズ チュ

ー ブに入れて硫 酸^アンモ^ニ ウム飽 和 溶 液 (^アンモ

ェァ水^{に て p}H 7.2 ^に調 整) ^に対し て ^一昼 夜 透 析を行な い, 生じ た沈 澱を遠 心^によっ て集め, これ を冷 蒸 留 水

に溶解し^て再びセ ルロ ^ー ズチュ

ー ブに入れて硫 酸^アン

モ^ニ ウ^ムの4 0 %飽 和 溶 液に対して ^一夜 透 析し た.生じ た沈 澱物は遠心によ^っ て除去し, え ら れ た上 宿 液を さ らに5 0 % 飽 和溶 液, 次い で60 % 飽 和 溶 液^の順^にそ れ ぞ れ^一 昼 夜 ずつ低 温 下で透 析を行な^っ た^{.こ の}う ち60

% 飽和 溶 液^で沈 澱す る沈 澱 物 ( 60F 分 画) を遠^JLりこよ

って集め, 蒸留 水に溶 解し^て蒸 留 水^に対して透 析を行

6 0 F ^‑fr a ctj.0 n

Sロp^{e r n a}ta nt (d土s c a rded)

35

な^っ て脱塩し たのち, 凍結 乾 燥を行な^っ て60F 分 画^の 無 品形 粉 末^を用 意し た.

2^.60 F ^の再 分 画

1) 再分 画 法1^: 60Fの再 分 画は全 操作_を低 温下^で図 1 に示す如く行 なっ た^. 前 記^の如く に して作 製し た無 品 形粉 末 ( 60 F 分 画) 300 mg に硫 酸^{アンモ ニウム}57.5

% 飽 和 溶 液 (pH 7^.1) 30m ほ 加えて低 温 下^で30 分 間 撹 拝し た^の ち遠心 ( 10.00 0rpm .30 分) して上 宿 液と沈 殿 物^に分け た^. 上 浦 液^{に つい て}はこれ をセ ルロ

ー ズチ ュ

ー ブに入れて ^一夜 硫 酸ア ンモ ^ニウ^ム飽 和 溶 液

に対して透 析を行な^いt 生じ た沈 澱 物を遠 心によ^っ て採取し, 蒸 留 水に溶 解し^て透 析^によ^っ て脱塩し た^の

D土8 S Olv ed in O･575 s atur a七色d 相打 4)

2S O 4 a nd c e ntrlfu9^ed

Sed im e nt D土al y^{z ed a}g^ains七

S atu r ated (N

㌔⁾2S O 4 a nd c e n七r土fu9^ed

Sed土m e nt

Dis s oIv ed in diti l led W ate r_′ d土aliヱ ed a9^aln s七 dis七土1 1ed l V ate r a nd l lopbi l 土z ed

6 0 F^‑5 75

( d i^{s c a r}ded)

D is s olv ed in O.55 s atu r at^ed (N H

4) 2S O

4

a nd c e nt^ri f^u₉ed

Sed土m e mt D土al_y^{z e}d

ag^aln st S attl r ated (N H

4) 2S 0

4 a nd c e nt^r土fug^■ed

C e ntr土fu9^ed

D土s s olv ed in O.52 5 S atu ra七ed (N

㌔⁾2S O 4 a nd c e ntr土fu9^ed

S q p^{e r n a}ta nt Di=S S Olved

ln

d 土st土1 1^ed W ate r _′

d 土al i.z ed a9^a土nst d土st土1 1ed W ate r a nd l 土op bil i.z ed 6 0 f^'‑55

a s tbat of ^I

ワr e ated :^{D土s s olv ed in}

in tbe 1 0.5 s attユr畠t占d

S a m e W ay ^‑(N

㌔⁾2S O 4^･ 6ロF^‑5 75 0 ヱ^･

60 F^‑5 5

0.475 s atu r ated

ー(Ⅶ

4) 2S O

4^･

: ^{0.4 5 s atu r ated}

‑(N E 4)

2S O 4^･ 1 0.4 2 5 s atu 工 ated

:^(m ₄⁾₂^{S O}₄^･

■0 .4 s atu r ated

6 0 ト525 ^】川H

4) 2S O

4

･ 1

●O s atu r ated

: ^{(N H}₄⁾₂^{S 0}₄

l

l l

l

Sed土m e nt

Step b y ^step a nd tr e ated a s S a I れe a S 6 0 F^‑5 75 a nd 6 0 F^‑5 5

60 F^‑50 6 0 F^‑4 7 5 6 0F^‑4 5 6_{0 F}^‑4 25 6 0 F^‑4 0

F ig^･ 1･ Pr o c edu r e l fo r r efr a ctio n atio n of a ntic a n c e r 6 0 F ^‑fr a ctio n of he mol_{y t}ic Str ep tO C O C Ci Su str ain

N ote : A ll the steps w e r e c a r ried o ut at 2⁰ C ^疇4^BC.

3 6

ち凍 結 乾 燥を行ない, え ら れ た粉 末棟 品を60 F ^‑ 5 7 5 分 画 ( 収 量1 6 ^mg) と し た.硫 酸アン モ ニウム5 7.5 % 飽 和 溶 液^に溶 解し な か^っ た沈 澱 物につい ては硫 酸^アンモ

ニウム 55 % 飽 和 溶 液 30 最 を加えて30 分 間撹 拝^{し た}

のち遠 心に付して上 宿 液と沈 殿 物に分け, 上帝 液^につ い てほ前 記と同 様^にして無 品 形 粉 末 棲 品 60F ^‑ 5 5 分 画 ( 収 量 18^.5mg) をえ た^. 55 % 飽 和 溶 液^に溶 解し な か^った沈 毅物は さ らに硫 酸^{アンモエウム}飽 和 濃 度5 2.5

% 液, 50 %液, 4 7^.5 % 液^.4 5 % 液, 4 0 % 液^t及び0

%液に よって順 次 前 記と同 様^に処理 し, 各 飽 和 濃 度の

6 0F^‑fr ac七io n

Dis s olv ed 土n o.5 25

S atu ra七ed ㈱ 4

) 2

S O

･l a nd c e n七山fug^ed Sup^{e r n a}ta n七

Di^al y^{2 : e}d a g^ain st S a 加r a七^ed (m

4) 2S O

4

a nd c e nセエi fug^ed S^up^{e r n a}ta n七

(dis c a rd^ed)

D⊥s s olv ed 土n

d j̲S七i l led

Wate r_′

d ial_yz ed

a9^a土ns七 dls七i l led

W ate r a nd l iop b i l ま^{z e}d

60 F 工

Sup^{e r n a}ta n七

F i_g^. 2^. Pr o c edur e 2 fo r

N ote : A ll the steps

野

硫 酸^{ア ンモ ニ ウム}液^に溶 解し た60 F ^の各分 画を沈 軋 脱 塩, 凍 結 乾 燥^に付して え ら れ た粉 末 棲 品を そ れ ぞ れ 6 0 F ^‑ 525 ( 収 量 30 ^mg),60F ^‑ 5 0( 収 量 33 mg),

60 F ^‑ 4 7 5( 収 量2 5mg) ,60 F ^‑ 4 5 ( 収 量2 3mg).60F

‑ 425 ( 収 量1 8 ^mg),60 F ^‑ 40 ( 収 量^{1 7.}5 咽), 及び 60 F ^‑ 0分 画 ( 収 量9 5mg)と し た.

2) . 再 分 画 法2: 60 F の再 分 画を図2 に示す ように

も行な^っ た. すな わ ち,6 0F分 画100mgを硫 酸^アンモニ

ウ ム5 2^.5 %飽 和濃 度 溶 液1 0 m‖^こ溶 解さ せ,30分 間捜 拝し たのち同 液を遠 心 (1 0,000rpm ,30 分) に付し上

Sed 土m e n七

D土s s 01v ed i.n O.47 5

S atu ご ated 佃 4)

2S O 4 a nd c e ntrifu9^ed Sl ユp^{e r na}ta nt

D土al y^{z e}d a 9^a土n st (阻

4) 2S O

4 ^{a nd}

C e ntri f 叩^ed

Sl ユp^{e r n a}七a n七 ( d ま^{.s c a r}ded)

Sup^{e r n a}七a n七 D土aly^{z e}d

a9^ai.n st S atu r ated (肝

4) 2S O

4

a nd c e ntri fug^e d

Sed im e nt

se;dim e nt Dis s 0lv ed in d ist i 1 1ed w ate r,

d i,al y^ヱed a 卵in st d i.stil led a nd l y^op bi l i^{z e}d 6 0 F エエエ

D is s 01v e d in dj.s t土1 1ed w a七e r _, d⊥al y^{乞 e}d a9^ain st dis til led w ate r a nd llop b ll 土z ed 60F 工 工

r ep t^omy^cin s ul fate 2 亀C O n C e ntr ati.o n nd c e ntrifu

g^ed

(dis c arded )

Dis s 0lv ed in d istil led W aヒe r_, d i.al y^{z e}d a9^ain s七 d istiユ 1ed w ate r a nd l iopbil土z ed 60 F エ工 1

r efr a ctio n atio n of a ntic a n c e r 6 0 F ^,fr a ctio n w e r e c a r ried o ut at 2⁰C ^‑ 4⁰C.