損傷

ウサ ギ脳損傷^モ デ ^ル にお け^るイ ^ン タ ^{ー ロ} イ キ ^ンー8 (^{I L 8}) ^の役割

金沢 大 学 医 学 部 医 学 科 脳 神 経 外 科 学 講 座 ( 主 任^: 山下純 宏 教授)

木 嶋 保

頭 部 外 傷 直 後に続 発 する 二次 的 障 害は予 後 を 悪 化 させ る重 要な因 子である^. 脳 損傷 後^の脳 浮 腫^の発 生と イ^ンタ ^ー ロ イ キ ン^ー8 (^{inte rle ukin‑8},IIJ8) ^との関係^に着 日^し, ウ サ ギ凍結 脳損 傷^モデルを 用^いて抗^IIJ8中和 抗 体^{に よ る}脳 浮 腫^の治 療^の可 能 性を 検 討し た^. 正骨 対 照 群^{お よ び}偽 手 術 群^の脳 水 分 含 有 率はそれ ぞ れ 79^.3±0^.1 % , 7 9^.3 ±0^.1 % であ^った^. 凍 結 脳損 傷^モデル6時 間 後, 1 2時 間 後, 2 4 時 間 後, 4 8時 間 後, 7 2 時 間 後^の脳 水 分 含 有 率は そ れ ぞ れ 8 2.5±0.3 % , 8 3.2 士0.2 % , 8 3.9 士0.2 % ,

8 4^.0土0^.2 % , 8 1^.8 ± 0^.2 % であった^. 6 時 間 後^{か ら 2 4} 時 間 後 ま^{で は}経 時 的に増 加し2 4 ^〜4 8 時 間 後^で貴 大と なっ た^. 病理組 織 学 的に好 中 球 主 体^の炎 症 細 胞は 6時 間 後に クモ膜下腰 細 静 脈 内皮 細 胞へ接 着^し, さ ら に 血管 外^クモ膜^下腔へ浸 潤^{し た.} 脳 実 質 内 壊 死 巣に は リ^{ン パ}球 優 位の炎 症 細 胞 を 認め た^. また壊死巣 周 囲の脳 浮 腫 組 織^に多^{数の小 出 血 班 を認め た. 2 4}時 間 後に は好 中 味 主 体^の炎 症 細 胞が壊 死 巣辺緑 を 取 り 囲み, 脳 浮 腫 組 織^の出血斑は増 加し て^い た. 7 2時 間後^{で は}好 中 球 主 体^の炎 症 細 胞は 辺 縁^よりさ ら に内 部に浸 潤 し, 脳 浮 腫 組 織^の出 血 斑^は減 少し た^. 7 日後^{で は}炎 症 細 胞は壊 死 巣 中 心 部に凝 集^し脳 浮 腫 組 織^の出 血 斑^は消 失し て反 応 性 星 状 膠 細 胞の増 殖 を 認め た. Ⅰし8の免 疫組 織 化 学 染 色で は 6 時 間 後に好 中 球お よ び リ^{ン パ}球に陽性 所 見 を 認^{め た.} 脳損 傷 直 後^に抗^{I L 8}中 和抗 体 を 静 脈 内 投 与 す^{る と}脳 水 分 含 有 率ヤ ア^ルブ ミン の血管外 漏 出^は減 少し, 脳 浮 腫 組 織^の 出 血 も 抑 制^{さ れ た. ま た}好 中 球 主 体^の炎 症 細 胞^の浸 潤 も 抑 制さ れ た^. 以 上の結 果より 脳 損 傷 後^の脳血液 関 門 (^{b lo od‑br ain} ba 汀ie r) ^の透 過 性や好 中 球^の浸潤^{にⅠし8 が}関 与^{し ている と}考 え^{ら れ}, 脳損 傷 後^の浮 腫^{な どの二}次 的 損 傷^に対^{し て}抗^Ⅰし8 中和 抗

体 投 与^{に よ る}治 療の可能性^が示 唆さ れ た^.

E ey ^{w o r}ds brain ede m a,C Old inj^{u r}y^,inte rle uk in^‑8 (^IIJ8)^{,n e utr O}phil

頭 部 外 傷 直 後に続 発 する 二次 的 障 害は予 後 を 悪 化さ せ る重 要 な 因 子である. こ の二次 的障 害^は臨 床 的^{に は}脳 浮 腫^の増 大^{と し} て認め ら れ, 治 療^は主に浸 透圧利 尿 薬 投 与に頼^っ て^いるのが現 状である^{1 卜4)}. 脳 浮 腫^の原 因と し て^いくつかの メカニズムが報 告さ れ て^い る が, 総じ て神 経 細 胞, 星 状 膠 細 胞, 血管 内 皮 細 胞 を 含む脳 実 質や毛 細 血 管な ど^の炎 症に対 する反 応と考 え^{ら れ て}

いる⁵⁾. 二次 的 脳 損 傷^の機 序と し て は 血液 脳 関 門 (^{b lo od‑br ain}

ba r rie r,B B B) ^の破 壊に伴 う 脳 浮腫^の発 生⁶⁾, 浸 潤し た炎 症 細 胞

か ら放 出^{さ れ る}活 性 酸 素や蛋 白 分 解 酵 素^{に よ る}組 織 障 害^7)占),

細 胞 外^の興 奮 性^ア ミノ酸 増 加に伴 う 細 胞 内カルシ ウム濃 度上 昇^{に よ る}神経 細 胞^{死9)な ど が}挙 げ^{ら れ ている が}, そ^の病 態^はい ま だ完 全に は解 明さ れ て^いな^{い1 0).} 最 近^の報 告で は, 二次 的 損 傷^の病 態に好 中 球が重 要 な役 割 を果^{た し ている と}考 え^{ら れ てい}

る^{1 1)1 2).} 好 中 球は 血管 内 皮細 胞と接 着^し, 内 皮 細 胞^に障 害 を 与 え, B B B を 破 壊 するだ けで なく, 脳 実 質^に浸 潤し種^{々 の}細 胞 障 害 物 質 を 放 出 して脳 組 織を障 害 する^{13 ).} ま た, 好 中 球 減 少 症

モデルや, あるいは好 中 球^の血管内皮^{へ の}接 着 阻止が脳 損 傷 後

の二次 的 損 傷 を 軽 減 す^{る14卜1 7)}

近年, 好 中球 浸 潤が強^い免 疫複 合 体 型 急 性 糸 球 体 腎 炎^{1 8)}や敗 血 症 誘導性 成 人呼吸 窮 迫 症 候 群 (^{adult r e s}pir ato ry d istr e s s

syⁿdr o me,A R D S)^19)の実 験^モデルに お^{い て}イ^ンター^ロイ キ^ンー8 (int_{e r}le uk in^‑8,I し8) ^が検 出さ れ, 抗Ⅰし8ヰ^ー卿 抗 体^の投 与に よ^/) て 二次 的 障 害^が抑 制^{さ れ ること が}報 告さ れ て^いる. ま^た, 脳 虚 血後 再 潅 流 障 害^モ デル^{2( I)}に おいてもⅠし8 の検 H と抗I L 8^■l 用1抗 体^の投 与^{に よむ)}脳 浮 腫^が抑 制^{さ れ ること が}報 告さ れ て お り B B B とⅠし8の関 与が注 目さ れ て^いる^.

II:8 は リ ボ多糖 体 (¹ⁱpopolys a c cha ride,L P S) 刺 激^ヒト末梢^血 単 棲 球^の培 養ヒ清より 精 製さ れ た ケモカ イ^{ン2 1)}で_, 7 2佃^{の ア}ミ ノ酸より なり^{2 2)}, 分 子 量は約8,0 0 0である. Ⅰし8 は好 中 球 走 化 性 作 用 を 有 する^のみならず, 好 塩 基 球^{や T} 細 胞^の描 性 化, 骨 髄 より 末 梢血^へ の好 中 球^の動 員, 好 中球 を 括 惟 化し て リ^ソゾー^ム 酵 素^の放 出, 活 性 酸 素^の産生誘 導^{2 3)2 4)}, ロ イ^コ ト リ^{エ ン}B 4 (1e ukotrie n e B 4,I X B 4)^の塵生誘 導^{2 5)2 6)}など^の働 きをする. また,

Ⅰし8 は ウ サ ギ にも 存 在 す^{る が}, 寄 菌 類 (^{マウス, ラッ ト}) ^{に は}存 在し な^{い2 7).} ウ サ ギ Ⅰし8 はヒトⅠし8 と高^い相 同性 を 認め, ヒ ト 抗^Ⅰし8中 和 抗 体^{に よっ て}中和^{さ れ る2 8). こ の こと よ}り,Ⅰし8 に 関 する動 物 実 験^モデルに は主に ウ サ ギ が用^い ら れ ている^.

以 上 より, 脳 損 傷 後^{の 二}次 的損 傷^{に お}けるⅠし8の関 与, お よ び抗I L 8 中 和 抗 体 投 与^{に よ}り二次 的損 傷^の抑 制 効 果 を 検 討 する た め, ウ サ ギ凍 結 脳 損 傷^モデ^ルを 用^いて実験 を 行っ た.

平 成^{1 0}年¹¹ 月2 5 日受付, 平 成1 0年12月2 8 日受理

A b br e viatio n s : A R D S, ad ult r e spir ato ry distr e s s syⁿdr o m e; B B B

,b lo od^‑b r ain b _{a r r}i^{e r};Il;1,inte rle ukin^‑1;II:8,

inte rle ukin^‑8;I m 4_,1e ukotrie n e B 4_;L P S,1i_pop^ol_ys a c chari de;I X ,1e uk otrie n e;P B S ,Pho sphate^‑bufEe r ed salin e

対 象^{お よ}び方法

Ⅰ. 実験 動 物

体 重2^.7 ^〜3^.O k g ^{の ニ ュ ー} ジ ^ー ラ^ン ド種 雌ウ サ ギ(^{ニノックス} ラ ボ サプラ イ, 石 川) ^{7 2 羽}を 用^いた. 硫酸^{ア トロ ピン}(田 辺,

東 京) ^0･2mg/k g と塩 酸ケ タ ミ^ン(三共, 東京)^{6 5 m}g/k g の筋 肉 内 注 射に より 麻 酔し た.

Ⅰ. 実 験^モデ^ルの作 製

左 頭 頂 部に約3 c 皿の皮 膚切 開 を 加 え 頭 蓋 骨^を露 出 した^. 冠 状 縫 合上 で矢 状 縫 合より 左 側^へ7 m m の点 を 中心に歯 科 用ド リ ルで頭 蓋 骨に内 板の みを 薄 く 残 すよう^に直 径^{1 0 m m の}穴 を 開 け^た. 液 体 窒 素 を 満た し た直 径8 m m の アルミ製 凍 結 損 傷 尉 プ

ロ^ー ブを 頭蓋 骨 内板に 6 0秒 間 庄着^{し た}後^に皮 膚 縫 合し た.

1. 凍 鯨脳 損 傷 詳

凍結 脳 損 傷6時 間後 (5羽), 1 2時 間 後 (⁶羽),2 4時 間 後 (⁶羽),

4 8時 間 後 (⁵羽), 7 2時 間後 (5 羽), 7 日後 (³羽) ^に脳 組 織 を 摘 出 し た^.

2^. 対 照 群

正常 対 照 群 (^{7 羽}) ^{お よ び}偽 手 術 群と し て頭 蓋 骨 を 内 板のみ薄 く 残 し^た群 (⁷羽) を 作 成し た^. 後者^{は 4 8}時 間後^に脳 組 織 を摘 出

し た.

3^. 抗Ⅰし8中 和 抗体 投与 群

上記と同じ脳 損 傷^{モデルに おいて}, 凍 結 脳 損 傷 後に 1 0 mg^の

マ ウス抗^ヒト Ⅰし8モ ノク^{ロ ー} ナル中和 抗 体 (W S 4)^{28)を 1 0 mlの} 生 理食 塩 水で希 釈し, 耳静 脈か ら 1 0 分 間^で静 脈 内 投 与 し6時 間 後 (³羽), 2 4時 間 後 (8 羽) , 7 2時 間 後 (³羽) ^に脳 組 織 を 摘 出し た･ 対 照 実 験と し て ミ^{エロ ー} マ蛋 白b^{3.6.2 息 1})^{盟)1 0 m}gを 同様

に静脈 内投 与し6 時 間 後 (^{3 羽}), 2 4時 間後 (⁸羽), 7 2時 間 後 (3 羽) ^に脳 組織 を 摘 出 した^.

Ⅱ^. 脱 水 分 含 有 率測 定^{3 0)}

大 腿 動 脈 切 開^{に て}脱^血後, 断 頭し直 ちに脳 組織 を 摘 出し た^. 健 側 大 脳 半 球^{お よ び}小 脳 を 切 除し息 側 大 脳 半 球^のみを 測 定し

た^･ ま ず脳 組 織^の乾 燥 前^の重 量 ( 湿 重 量) を 測 定^し, 次に乾 燥 器 (^{1 2 0}℃) ^の中で 4 8 時 間 置 き 乾 燥さ せ た後^の重量( 乾 燥 重 量) を 測 定^し, 以 下^の式に より脳 水 分 含 有 率 を 算 出し た( 乾 燥 重 量 法) ^.

脳 水 分 含有 率 (^%) ⁼(湿 重 量 ^一乾 燥 重 量) / ( 湿 重量) ^×1 0 0

Ⅳ. 脳 浮腫 指 数 測 定^{3 0)}

乾燥 重 量法^で求め た 正常 脳と脳 挫 傷 脳^の水 分 含 有 率か ら 下記 の式^で算 出 し^た.(^{s w} el h g pe r c e ntage)

脳 浮 腫 指 数 (^%) ⁼

( 挫傷 脳^の水 分 含 有率^一正 常脳^の水 分 含有 率) / ^正常 脳の水 分 含 有率^×1 00

Ⅴ^. 病 理 組織学的検 討

脳 損 傷 後の ウ サ ギを 麻 酔下 に, 0.1 M リ^ン酸 緩 衝 生 理 食 塩 水 (_{p h}osp h^ate‑bu蝕r ed sali_{n e}

,P B S) に 4 % ^パラフ ォル ム ア^ルデ^ヒ ドを 加 えた固定 液4 00 mlを上行大 動 脈^より 注 入 し潅 流 固定 を 行

った･ 直 ち^に脳 組織を摘 出 し同 固定 液に よ る 亜時 間の浸 潰 固 定_{を 追 加 し}た^{･ パ}ラフ ィ ン包埋後⁴ 〃^m の組 織 切 片 を作製 し,

H E 染 色お よびm_{d ve}I^㌔Bar rer a染 色 を 行っ た^.

Ⅶ^. 免疫 組 織化 学的検討

免 疫 染 色は ア ピ ジン ^ー ビ オ チン ^ー ペ ルオ キ シ ダ ^ー ゼ複 合 体 (^{a vidi}n e^･biotin TPe r O Xida sらc o mp l^既) ^{法とマイクロウエ ー} ブ迅速 試 料 処 理 装 置M ト77 塾 (東 屋 医 科 機械, 東京) を用^いる賦 活 法に

て行っ た･ パラフ ィ ン切 片 を 脱^{パラフ ィ ン}しP B S で洗 浄後, 抗 原 賦 活 処 理 を 行っ た^. 広口 ビ ^ー カ ^ー に 0.1 M クエ ン酸緩 衝 液 と

ス ライ ドガ ラ^スを入 れ, 4 0 0 W,9 0 ℃で連続1 5分 間煮沸 反 応 を 行 ^{っ た.} 0^.3 % 過酸化 水 素 加メ タ ノ ^ー ルで内 因 性^ペル オ キ シ ダ ^ーゼを 失 格 さ^せ, P B S で洗 浄後, 非 特 異 的 反 応 抑 制^のため 5 % ^スキ^ムミ^ルク(D i女:O l^.abor at ories,Detr oit, U S A) を¹時 間作

用 させた.

一 次抗 体, 二次抗体, お よぴア ピ ジン ^ー ビ オ チン^ー ペ ルオ キ シ ダ^ー ゼ反 応は^マイク^ロウ^{エ ー} ブ(^{出 力3 00 W で 3}分 間 の間 欠照射) を 使 用^{し た. アルブ ミン}免 疫 染 色の ^一 次抗 体 と し て ヤギ抗ウ サ ギ ア ル ブ ミ ンI g G 抗体(^Org^{a n o n} Tekni ka

Co rp^{o r at}ion, Du rha m, U S A) を8F^Lg/ml に希 釈し反 応 させ た^. 二次抗体と し て ビ オ チ ン標 識^マ ウス抗ウ^マI g G 抗体(^{Ve ctor} h bor atoriesIn c･,Bu 血 ga me, U S A) を 反 応 させ た^. ま た. I L,8 免疫染 色^{で は一} 次 抗 体と し て 1 2 0_FLg/ml に希釈し たW S A を 反 応 させ た^■ 対 照として同 濃度に希釈^{し たマウスミエ ロ ー マ}蛋白 b^3･6.2.8.1) を^{W S･4 のか わ}りに用^いて同様^の操作を 行った. ニ

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Fig^･1^･ Wat er c o nte ntin theinj^{u r e}d hemisphe re 6,1 2,2 4,

4 8,7 2 hr a nd 7 days afte r a c ol d inj^{u r}y^. W ate r c o nte nt gr adual1yin c re_{a s e s an}d r e a chesitsp^{e a}k 2 4^‑48 hr aAe rinju ry^. D_ata a resho w n a s更±S E M . * p< 0.0 5(^Student^,stte st)^.

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Urltrd d Co れt.A b AntJ^･J L^･8 A b Fig^･2･ E 飴ct of anti^‑II]8 antibod y o n brain ede m a mea s u r ed

b y dry^{w et m e}thod･B^rain ede m ais dete r min ed a s s w elling pe r c e ntag^e･A d mi nistr atio n ofa nti^‑I L 8 and bod_yde c rea s ed the S W elling p^{e r c e n}tag^{e o}fthe da m aged he mis phe re. Data a r e Sho w n a s富 ± S E M . * p < 0^.0 5 (S tude nt^,st t^est), * * _{n o}t

SigⁿiAcant. も

次抗体と し て ビ オ テ^ン標 識^{ヤ ギ}抗マ ウ^スI g G 抗 体 (^{D A K O} ,

G lo struP^,Den m ar k) を 反 応 させ た^.各^{反 応}後^{に P B S で洗 浄 した.}

ア ピ ジ^ンー ビオチ^{ン ー ペ}ル オ キ シ ダ ^ー ゼ複 合体法^{と 0.0 0 5 %} 過 酸 化 水 素 加0^.0 2 % ジ ア ミ^{ノ ベ ン}チ ジ^ン(3^‑3^'‑d i am in obe n zidin e) (S ig^{m a.}St.l.o uis,U S A) 処 理^{に よ}り発 色 させ, へ マ ト キ シ リ^ンで 核染 色 を行った^. アルブ ミン の免 疫 染 色は W S 4投 与 群, およ

･･ ^■一､..■^研■^‑こ

･

一二三^二 ̲^丁

二 + 二^{一 二‥}

∴∴ ∵∴1耶㍉∴ ^{∴ ､}

びミエ ロ ^ー マ蛋 白 投 与 群とも 同時に施 行 した.

Ⅶ^. 統 計 学 的 検討

得^られた成 凍^はす^べて 更 ± S E M に て表 記し た. 統 計 学 的 有 意 差は F検定^{に よ る}等^{分 散の}検定 を 行^い, 分散が等し^い時に は S tude nt のt検 定 を, 等しく な^い時に は W elch の t検 定 を 行っ た.

危 険率^{5 %} 未 満 を もって有 意 差 あ りと判 定し た^.

Fig^.3. H istolog y ^of infla m m ato ry c ell re action fo 1lowi ng b^rain col d inj^{u r}y^. 仏,B,C) 6 hr,(D) 2 4 hr, 但)7 2 hr, の^{7 da}y^{s a}Aert he inj^{u r}y^･ Ne utr o帥^{ils a r ea}g g^{r e}g^ated inthe s ubar a血 mi d ven ule(B)^.匝^mp h^ocyt^{e s are}infi1tr ated in th e n e c r otic ar e aOf brainp ^{ar e n}血 ym a(^C)^･Bar

モ1m m 仏^D,E,F)^{.Ba r= 2 5}i^Lm (B,C)^.