氏 名 授 与 し た 学 位 専攻分野の名称 学 位 授 与 番 号 学位授与の日付 学位授与の要件
学位論文の題目
論 文 審 査 委 員
長谷川 利聡 博 士 歯 学
博甲第６１５５号 令和２年３月２５日
医歯薬学総合研究科病態制御科学専攻
（学位規則第４条第１項該当）
Lactate Transporter Monocarboxylate Transporter 4 Induces Bone Pain in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma
(乳酸輸送体モノカルボン酸トランスポーター4は頭頸部扁平上皮癌における骨痛を誘発する)
沢 禎彦 教授 岡元 邦彰 教授 松村 達志 准教授
学位論文内容の要旨
【 緒 言 】
頭 頸 部 扁 平 上 皮 癌 は ， 乳 癌 ， 前 立 腺 癌 ， 多 発 性 骨 髄 腫 な ど と 同 様 に ， 腫 瘍 が 骨 に 浸 潤 し 癌 性 骨 痛 を 誘 発 す る こ と が 知 ら れ て い る 。 が ん 臨 床 に お い て 癌 性 骨 痛 は 難 治 性 で あ り ， そ の 制 御 は 患 者 のQOL向 上 を 考 え る 上 で ， 極 め て 重 要 な 課 題 で あ る 。
悪 性 新 生 物 は エ ネ ル ギ ー 産 生 を 好 気 的 な 条 件 下 に お い て も 嫌 気 性 解 糖 系 に 依 存 し て お り ， こ れ はWarburg効 果 と し て 知 ら れ て い る 。 嫌 気 性 解 糖 系 の 最 終 代 謝 産 物 で あ る 乳 酸 は ，m onocarboxylate transporter 4 (以 下：MCT4) を 介 し て 細 胞 外 に 放 出 さ れ ，腫 瘍 周 囲 の 微 小 環 境 を 酸 性 に し ， 組 織 の 酸 性 化 は 癌 性 疼 痛 の 原 因 の 一 つ で あ る こ と が 知 ら れ て い る 。
一 方 で ， 近 年 ， 中 枢 神 経 系 に お い て 乳 酸 が 重 要 な エ ネ ル ギ ー 源 で あ る こ と が 明 ら か と な っ た 。
本 研 究 で は ， 乳 酸 の 細 胞 外 輸 送 体 で あ るMCT4の 発 現 低 下 と 頭 頸 部 扁 平 上 皮 癌 の 癌 性 骨 痛 と の 関 係 性 を 検 討 し た 。
【 方 法 と 結 果 】
1) 頭 頸 部 扁 平 上 皮 癌 と 頭 頸 部 正 常 組 織 で のMCT4発 現 の 検 討 。
頭 頸 部 扁 平 上 皮 癌 と 頭 頸 部 正 常 組 織 で のMCT4発 現 を 比 較 す る た め ， 頭 頸 部 扁 平 上 皮 癌 の 組 織 ア レ イ を 用 い て 免 疫 学 的 染 色 を 行 っ た 。 頭 頸 部 正 常 組 織 に 比 較 し て 頭 頸 部 扁 平 上 皮 癌 で はMCT4が 高 発 現 し て い た 。
2) 実 験 系 に 用 い る 口 腔 扁 平 上 皮 癌 細 胞 株 の 決 定 。
口 腔 扁 平 上 皮 癌 細 胞 株 で あ るHSC-2，HSC-3，HSC-4，SAS，OSC-19に お け るMCT4発 現 を ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト 法 に よ り 検 討 し た 。SASに お い てMCT4が 最 も 高 発 現 し て い る こ と を 確 認 し ， 以 下 の 実 験 はSASを 用 い て 行 う こ と と し た 。
3) MCT4発 現 抑 制 細 胞 株 の 作 製 。
エ レ ク ト ロ ポ レ ー シ ョ ン 法 を 用 い てSASに 対 い てshRNAを 導 入 しMCT4発 現 抑 制 細 胞 株 を 作 製 し た 。 コ ン ト ロ ー ル と し て 同 様 にcontrol shRNAを 導 入 し た 細 胞 株 を 作 製 し た 。M CT4の 発 現 低 下 は 蛍 光 免 疫 学 的 染 色 な ら び に ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト 法 に よ り 確 認 し た 。
4) in vitro に お け る 検 討 。
i) 増 殖 能 ， コ ン デ ィ シ ョ ン メ デ ィ ウ ム 中 の 乳 酸 濃 度 な ら び にpHの 測 定 。
親 株 ，control shRNA導 入 株 ，MCT4の 発 現 抑 制 株 を そ れ ぞ れ 培 養 し ，増 殖 能 に 対 す る 検 討 を 行 っ た 。ま た ，コ ン デ ィ シ ョ ン メ デ ィ ウ ム 中 の 乳 酸 濃 度 な ら び にpHを 測 定 し た 。増 殖
能 に 有 意 な 差 は 認 め な か っ た が ，MCT4発 現 抑 制 株 で 有 意 な 乳 酸 濃 度 の 低 下 とpHの 低 下 抑 制 を 認 め た 。
ii) 知 覚 神 経 へ の 影 響 の 検 討 。
MCT4発 現 抑 制 が 知 覚 神 経 に 与 え る 影 響 を 検 討 す る た め に ， ラ ッ ト 脊 髄 後 根 神 経 節 の 初 代 培 養 株 と 作 製 し た そ れ ぞ れ のSASを 共 培 養 し た 。 コ ン ト ロ ー ル と し て 共 培 養 せ ず 脊 髄 後 根 神 経 節 の み を 培 養 し た 群 を 作 製 し た 。5日 間 培 養 後 ，カ ル セ イ ン を 用 い て 染 色 し 蛍 光 に よ り 知 覚 神 経 軸 索 伸 長 を 測 定 し た 。 親 株 ，control shRNA導 入 株 と 比 較 し て ，MCT4発 現 抑 制 株 と 共 培 養 し た 神 経 細 胞 の 軸 索 伸 長 は 有 意 に 抑 制 さ れ て い た 。
5) in vivo に お け る 検 討
こ れ ま で の 結 果 を 踏 ま え ，BALB/c-nu/nu右 脛 骨 骨 髄 腔 に そ れ ぞ れ のSASを 移 植 し 癌 骨 浸 潤 モ デ ル を 作 製 し ，MCT4発 現 抑 制 が 癌 性 骨 痛 に 与 え る 影 響 な ら び に 知 覚 神 経 に 与 え る 影 響 に 関 し て 検 討 を 行 っ た 。 コ ン ト ロ ー ル と し て 同 様 の 手 術 を 行 っ た 偽 術 群 を 作 製 し た 。 移 植 後1日 ，3日 ，5日 ，7日 に 熱 感 受 性 試 験 を 行 っ た 。術 後7日 目 で ，MCT4発 現 抑 制 株 を 移 植 し た 群 に お い て ， 癌 性 骨 痛 が 有 意 に 抑 制 さ れ て い る こ と が 確 認 さ れ た 。 術 後8日 の 時 点 で ， 右 脛 骨 骨 髄 の 腫 瘍 増 大 を 確 認 す る た め に 軟X線 写 真 を 撮 影 し ，ImageJに よ り 骨 破 壊 病 変 の 範 囲 を 測 定 し た 。 有 意 差 は 認 め な か っ た も の の ，MCT4発 現 抑 制 株 を 移 植 し た 群 に お い て 腫 瘍 増 殖 が 抑 制 さ れ る 傾 向 に あ っ た 。
同 日 ， マ ウ ス を 屠 殺 し 心 臓 採 血 に よ り 全 身 の 乳 酸 濃 度 の 測 定 を 行 い ， 骨 髄 液 採 取 に よ り 腫 瘍 局 所 の 乳 酸 濃 度 の 測 定 を 行 っ た 。 全 身 の 乳 酸 濃 度 に 有 意 な 差 は 認 め な か っ た が ， 腫 瘍 局 所 の 乳 酸 濃 度 は ，MCT4発 現 抑 制 株 移 植 群 で 有 意 に 低 下 し て い た 。
ま た ， 脊 髄 後 根 神 経 節 を 採 取 し ， ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト 法 な ら び に 蛍 光 免 疫 学 的 染 色 に て pERK1/2の 発 現 な ら び に ， 酸 感 受 性 受 容 体 transient receptor potential cation chan nel subfamily V member 1 (以 下：TRPV1)の 発 現 を 測 定 し た 。MCT4発 現 抑 制 株 移 植 群 で はpERK1/2な ら び にTRPV1の 発 現 が 有 意 に 抑 制 さ れ て お り ，知 覚 神 経 の 興 奮 を 抑 制 し て い る こ と が 明 ら か と な っ た 。
【 結 論 と 考 察 】
口 腔 扁 平 上 皮 癌 細 胞 株 で あ るSASはMCT4を 介 し て 乳 酸 を 細 胞 外 に 放 出 す る こ と で ， 腫 瘍 周 囲 の 微 小 環 境 を 酸 性 化 し て い た 。 周 囲 微 小 環 境 の 酸 性 化 あ る い は 乳 酸 そ の も の が ， 知 覚 神 経 に 存 在 す る 酸 感 受 性 受 容 体 で あ るTRPV1発 現 の 亢 進 を 促 し ，癌 性 骨 痛 の 原 因 の 一 つ と な っ て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。
頭 頸 部 扁 平 上 皮 癌 の 癌 性 骨 痛 制 御 の 一 つ と し て ，MCT4が 治 療 の タ ー ゲ ッ ト と な り う る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。
今 後 の 研 究 課 題 と し て ，MCT4が 腫 瘍 周 囲 の 微 小 環 境 酸 性 化 に ど の 程 度 寄 与 し て い る か ， 放 出 さ れ た 乳 酸 が 知 覚 神 経 や 周 囲 微 小 環 境 に お い て ど の よ う に ふ る ま う の か を 検 討 す る 必 要 が あ る と 考 え ら れ た 。
