博 士 （ 医 学 ） 酒 井 俊 彦
学 4tL 論 文 題 名
Effects of combined administration of transforming growth factor‑Bl and epidermal growth factor on properties of the in situ frozen anterior cruciate ligament in rabbits
(transforming growth factor‑Bl およびepidermal growth factor の 混 合 投 与 が凍 結 処 理 家 兎 膝 前 十 字靱 帯の 特性 に与 える効 果）
学位論文内容の要旨
【目的】
自家腱を用いた膝前十字靭帯(ACL)再建術後，移植腱の線維芽 細胞は壊死し，外因性細 胞が侵入してくるが，移植腱の強度は移植後低下し，術後1年経っても正常の強度には至ら ないことが知られている．この移植腱の強度の劣化を抑制するため，または劣化した移植腱 の強度の回復を速めるためには，いまだ多くの研究の必要性が強調されている．そのーっと レて成長因子が移植腱に与える効果には大きな注目が集まっているが，その移植腱に対する 生体内での効果の報告は皆無である ．本研究の目的はACL再建モ デルとして確立している in situで凍結処理した家兎ACLを用いて，transforming growth factor Bl (TGF‑BI）および epidermal growth factor (EGF)の混合投与が凍結処理ACLのカ学的および構造特性に与える 効果を明らかにすることである．
【方法】
雌成熟日本白色家兎(3.3土0．3kg) 142羽を使用した．
研究1：ACLの 断 面積 ，水 分含 有量，組 織学的観察およびACL前内側 線維束のカ学的特性 雌 成熟日 本白色家兎112羽を使用した ．右ACLに対して，下記の方 法で凍結処理→解凍 操作を行い線維芽細胞を完全に死滅 させた後，28羽ずっ以下の4群に分けた．GroupIには この凍結処理のみ行なった． Group IIには，フィプリン糊（化血研，熊本）0．2mlを凍結処 理ACL周 囲 に 投 与 し た ．Group IIIに はTGF‑B1 4ngお よ びEGFlOOng（R＆DSystems， Minneapolis，MN)をフィプリン糊0．2mlと混合し凍結処理ACL周 囲に投与した，Group IV にはTGF‑B1 2ygおよ びEGF50ptgをフィ プリン糊0．2mlと混合し凍結処理ACL周囲に投与 し た． 各群14羽 ずっ をそ れぞ れ6週 およ び12週後 に屠 殺し ，7羽 を断 面積 およ びACL前 内側線維束のカ学的特性の計測に，5羽を水分含有量の計測に，2羽を組織学的観察に供し た． 左側は すべて正常controlとし，そ のうちの14羽を無作為に選びcontrol群とした．
研究2：ACLの構造特性およびcollagen fibrilの直径の分布
研究1の結果に基づいて，残りの家兎30羽を10羽ずっGroupI，II，IIIの3群に分けた．
GroupI，II，IIIはそれぞれ研究1と 同じ処置を行った．12週後に屠殺し，5羽をACLの構造 特 性 の 計 測 に ， 5羽 を 電 子 顕 微 鏡 を 用 い た 微 細 構 造 の 観 察 に 供 し た ．
手術はpentobarbital静脈麻酔下に膝関節を切開し，独自に開発した液体窒素プロープを用 いて 家兎 の右ACLの みをin situで1分 間凍 結処 理し，その後25℃の生理食塩 水を1分間 関節内に流しACLを解凍した．この操作を3回繰り返し，線維芽細胞を完全に死滅させた．
Group IIに は フ ィ プ リ ン 糊O．2mlを ，Group III，IVにはTGF‑B1お よびEGFをフ ィ プリ ン糊 0．2mlと 混合 し， 凍結 処理ACL周囲 に 投与 した ，断 面積 はvideo dimension analyzer（浜松フ ォ ト ニ ク ス 社 製 ，HTV‑C 1170)を 用bゝ て 光 学 的 に 非 接 触測 定し た ．研 究1では ，そ の後ACL の 後 外 側 線 維 束 を 切 除 し た ， 引 っ 張 り 試 験 に お い て は 大 腿 骨 ーACL前 内 側 線 維 束 ―脛 骨複 合 体 を 内 旋90度 ， 屈 曲45度 の 肢 位 で 万 能 試 験 機 （ オ リ エ ン テ ッ ク 社 製 ，PTM‑250W)に と り っ け ，37℃ 生 理 食 塩 水 中 に お い て ，preconditioningの 後 ，20mm/minの 速 度 で 複 合 体 を 破断 さ せた ．腱 実質 部 の歪 みの 計測 はvideo dimension analVzerを 用い た． こ れら の結 果 か ら応 力 一歪 み曲 線を 作 成し ，力 学的 特性 に 関す るハ ラメ 一夕 を 求め た． 水分 含 有量 の計 測 はACLの 湿重 量 を測 定した後，lyophilizer (SAV‑333P，Sansho Co）で96時間乾燥させた後，
乾 重量 を 計測 し， 湿重 量と の 差か ら求 めた ． 組織 学的 観察 はH‑E染 色で ，collagen f'ibrilの 直 径 の 分 布 は 電 子 顕 微 鏡 を 用い て行 っ た． 統計 学的 解 析に は， 研究1で は多 重比 較 を考 慮し た 二 元 配 置 分 散 分 析 法(two‑Way ANOVA)とStudent st‑testを ，研 究2では 多重 比 較を 考慮 した一 元配置分散分析法(one‑way ANOVA)を用いた，
【結果 】
研 究1：＠ 断面 積 ： two‑waY ANOVAに おい て期 間（p 0．001）．群 問（p 0．035)ともに有意 差 を 認 め た ． 12週 に お い て は6週 よ り も 有 意 に 高 値 を 示し ，Group IIIは 他の3群 より も有 意 の 低 値 を 示 し た ．C ACL前 内 側線 維束 のtensile strength：two‑xvay ANOVAに お いて 期間
（p 0．003)，群 間（p−―0．002)とも に有意差を認めた．12週に おいては6週よりも有意に低 値 を 示 し ，Group IIIは 他 の3群 より も 有意 の高 値を 示 した ．◎ 水分 含有 量 ：two‑way ANOVA に おい て 期間(p=0．049)， 群 間（p− ―0．015)と もに 有意 差を 認 めた ，12週においては6週よ り も有 意 に高 値を 示し ，Group IIIはGroupIに 比べ て有 意 の低 値を 示し た．＠組織学的観察：
GroupI，IIお よ びIVに お い ては ，6週で は実 質 表層 のみ に円 形の 核 を持 った 細胞 の 浸入 を認 め る も の の 中 心 部 の 大 部 分 に は 細 胞 は ほ と ん ど 認 め ず ，12週で は 中心 部に も同 様 の細 胞が 散 在 し て い た ． 一 方 ，Group IIIで は12週 に お い て 他 の3群 より も 多く の細 胞が 中 心部 に侵 入して いた，
研究2： stiffness： GroupI，II，III，およびcontrol群でそれぞれ154土27N/mm，148土46N/mm， 141土18N/mm，148土41N/mm， で あ り ， 統 計 学 的 に 有 意 差 は 認 め な か っ た ． ◎ 微 細 構 造 の 観 察 ：collagen fibrilの 直 径 の 分 布 は ， 正 常ACLで は144‑192nmにpeakを 持 っ たunimodal patternを 示 し た ．GroupIで は96‑144nmにpeakを 持 っ たunimodalpattemを 示 し ，GroupII もほぽ 同様の分布であった．一方 ，GroupIIIでは48‐96nmにlargepeak，144‐192nmにsmallpcak を持っ たbimodalpattemを示した．
【考察 】
凍 結 処 理 し た 家 兎ACLは ，12週 に お い て そ の 前 内 側 線 維 束 の カ 学 的 特 性 は 正 常ACLに 比 ぺ て有 意 に低 下し ，断 面 積と 水分 含有 量は 有 意に 増加 して いた ． 一方 ，lowdoseのTGF．B1 お よ びEGFの 投 与 は ， 凍 結 処 理 に よ る こ れ ら の 変 化 を 有 意 に 抑 制 す る こ と が 示 さ れた ．ま た ， こ れ ら 成 長 因 子 の 投 与 はcollagenfibrilの 直 径 の 分 布 に も 影 響 を 及 ぼ し て い た ． TGF‐Blお よびEGFは滑 膜 ，血 腫， 脂肪 ，血 管 など に由 来す る関 節 内の 細胞 に影 響 を与 え，
そ の 影 響 を 受 け た 細 胞 がACLの 実 質 内 に 侵 入 し ， 断 面 積 ， 水 分 含 有 量 お よ び カ 学 的特 性を 変 化 さ せ た の か も し れ な い ． 本 研 究 で はGroupmの 中 心 部 の 細 胞 数 は ，GroupIお よ びIIの 細 胞 数 よ り も 多 か っ た ． こ の こ と か ら も ，ACLの 実 質 内 に 侵 入 す る 細 胞 の 遊 走 が 成長 因子 に よ っ て 増 強 さ れ ， そ の 細 胞 がconagcnの 合 成 を 変 化 さ せ た 可 能 性 が 考 え ら れ る ． TGF−B1お よ びEGFの 投 与 に よ っ て カ 学 的 特 性 が 変 化 した 機序 と して は， 第一 に ，以 前報 告 さ れ て い る よ う にTGF・B1が 線維 芽細 胞か ら 作ら れるconagenaseの活 性を 抑え る こと によ っ て ， 凍 結 処 理ACLの カ 学 的 特 性 の 低 下 を 抑 制 し た こ と が 考 え ら れ る ． 第 二 に 考 えら れる こ と は ，TGF―B1は 線 維 芽 細 胞 のconagenお よ びnoncollagenousprotemの合 成能 を 増強 させ る の で， 凍 結処 理ACLのproteoglycan−collagennetworkに影 響を 与 えた 可能 性で あ る． 第三 に はTGF‐B1お よ びEGFがc011agenのcross‐linkに 影 響 を 与 え た 可 能 性 が 考 え ら れ る ， highdoscのTGF．Blお よ びEGFの 投 与 は 凍 結 処 理ACLの り モ デ リ ン グ に 影 響 を 与 え な か
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った．これは，すでに知られているように，成長因子の効果は用量依存性であることからと 考えられる，
今回の研 究は， 凍結処理ACLモ デルと実際のACL再建モデルの違いなど，今後のさらな る研究が必要な面が多々あるが，ACL再建術のbasic scienceに関しての重要な情報を与え たと考えている，
学位論文審査の要旨
学 'ftL 論文題名
Effects of combined administration of transforming growth factor‑Bl and epidermal growth factor on properties of the in situ frozen anterior cruciate ligament in rabbits
(transformmggrOWthfaCtor ‐B1 およびepidermalgrOWthfaCtor の 混合投与が凍結処理家兎膝前十字靱帯の特性に与える効果）
近 年 ， 組 織の 局 所 治 癒 を 制 御す る 因 子 と し て 成長 因 子 が 注 目 さ れ てい る が ， 血vivoで の 移 植 自家 腱 に 対 す る 成長 因 子 の 効 果を み た 研 究 は こ れま で な か っ た ． 申請 者 は 膝 前 十 字 靭 帯（A（ 恥再建 モデ ルとし て確 立して いる 血s洫で 凍結 処理1，た家 兎ACLを用い て， 曲n蚯）mling錚0wm血cめrB1卩・GF・‐81）およびcp甜enml野owm血d・0r（Eくめの混合 投与 が凍 結処理ACLのカ 学的 および 構造 特性に 与え る効果 を調 べた．
雌 成熟 日 本 白 色 家 兎 （3．3土0．3坩142羽 を 使 用 し た， 研 究1で は ， 家 兎112羽 を 使用 し ， 右ACLに 対 し て凍 結 処 理 イ 蝌 東 操 作 を 行 い 線 維 芽 細 胞 を 完 全 に 死 滅 さ せ た後 ，28羽 ず つ以 下 の4群 に 分 け た ，GmupIに は こ の 凍 結 処理 の み 行 な った ．G伽puに は ， フ ィブ リ ン 糊0．21mを 凍結 処理A（L周囲 に投ご 与し た，GmupmにはTくユF・‐B14ngおよ びH預1頒klgを フ ィ ブ リン 糊0．加1と 混合 し 凍 結 処 理ACL周 囲に 投 与 し た ．GmupIVには 田3F堪14 gおよ びE（〕F 5（ 弘lgを フィ ブ リ ン 糊0．21nlと 混 合 し 凍 結 処 理ACL周 囲 に 投 与 し た ．各 群14羽 ず っを そ れ ぞ れ6週 お よ び12週 後 に 屠 殺 し ， 断 面 積 ，ACL前 内伽 腺 維 東 の カ 学 釣 特性 ， 水 分 含 有 量 の計 測 と 細 織 学 鹸 観察 に 供 し た ． 左 側 はす べ て 正 常coIltml群 と し た ．断 面 積 はudeodimer面on孤 小 ＆卿を 用い て光学 的に 非韜萌 虫演4定した ．力 学的特 性は 大腿骨
― ・Aaー 前 内 側 線 維 東 ―脛 骨 複 合 体 を 内 旋90度 ， 屈 曲45度 の 肢 位 で 万能 試験 磯にと りっ け，静 的引 つ張り 破断 試験 を 行 っ た ． 研 究2で は ， 家 兎30羽 を 使 用 し ，10羽 ず つQoupI，u，mの3群 に 分 け た．G鰍lpI，n，mは そ れぞ れ 研 究1と 同 じ 処 置 を 行 っ た ．12週 後 に 屠 殺 し ，ACLの 構 造 特性 の 計 測 と 電 子 顕微 鏡 を 用 い た 微 細 構造 の 観 察 に 供 し た． 構造 特性の 計測 は大腿 骨， ―全A（ ユ′ 脛骨複 合体 を万能 試験 機にと りっ け，静 的引 つ張り秘曲帚ま験を行った，微 細 構 造 の 観 察 はconag印 馴1の 直 径 の 分 布 を 調 べ た ， そ の 結 果 ，GmupI，nお よ びWに お い て は 断 面 積 と 水 分 含 有 量 は 経 時 的 に 有 意 の 増 加 を 示 し ，ACL前 内 側 線 維 束 の 引 つ 張 り強 度 は 経 時 的 に 有意 の 低 下 を 示 し た ．一 方 ， G歟 ユpmは 他の3群 より も 断 面 積 は 有 意の 低 値 を 示 し ， 引 つ張 り 強 度 は 有 意 の高 値 を 示 し 虎， 水分 含有量 は（ 加upI に 比 べ て 有 意 の 低f直 を 示Lア た ． 組 織 学的 に はGroupI，uお よ びWに お い て は ，6週 で は実 質 表 層 の み に 円形 の 核 を 持 っ た 細胞 の 浸 入 を 認 め るも の の 中 ´C澗jの 大 部 分 に は 細 胞は ほ と んど 認めず ，12週 では 中心部 にも 同様の 細胞 が 散 在 し てい た ． 一 方 ，Gmupmで は12週 にお い て 他 の3群 よ り も 多 くの 細胞 が中 ´己丶 部に 侵入し てい た，構 造特 性 は 各 群 間 に 有 意 識 詔 め な カ ゝ っ た ．c0也 塘eIl伍 ）mの 直 径 の 分 布 は， 正 常ACLで は144―192nmにpeakを 持 っ た unimoda】pa地m，GmllpIお よ びuで は96―144：nmにpeakを 持 っ たllr血I10dmpatぬnを 示 し た が ，Gmupmで は
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