実 験 技 術
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(2) (117). 蛍光 顕微 鏡 を組 み合 わせ た原子 間力 顕微 鏡 の 開発 とそ の応用 ば な らず,設 計 が複 雑 にな る.第2の. 方 法 は円筒 ピエ. (カ ンチ レバ ー,半. 導 体 レ ー ザ ー,位. ゾの中空 部 に対 物 レンズ を挿 入 し,こ の円筒 ピエ ゾの. 載 っ て い る.B1は. 上部 を試 料 ステ ー ジ とす る方 法 で あ る.我 々 は後者 を. B4は,B1を. 採 用 した.100倍. で 直 進 す る ネ ジ で 支 え ら れ て い る.こ. の対 物 レ ンズ を挿 入す るた め に円 筒. ピエ ゾは太 く,XY方 れ で,XY方. 向 に はほ とん ど変位 しな い.そ. 貫 通 す る ネ ジ2本. に 対 す るAFMヘ. 向用 の 板 ピエ ゾ を別 に用 意 した.こ れ で. と ス テ ッパ ー モ ー タ ー. 上 の ス テ ン レ ス 球3個. を押 す(図2参. 移 動 す る.ま. た,B4に. コー ンゴ ムで常 に力 を加 えて,板 ピエ ゾが 引 いた と き. でAFMヘ. にB3を 押 し返す.B3は. こ の 移 動 で,探. そ の下 に あ る基 板B2上 に置 い. 動 か し,ス. ンチ レ バ ー を 移 動 す る.. 針 先 端 を 蛍 光 を 発 して い る 試 料 に ピ ン. たス テ ン レス球3個 の 上 に 載 って い る.B3の 面 に凹. ポ イ ン トア プ ロ ー チ で き る.散. 探 針 も蛍 光 顕 微 鏡 で 同 時 に 観 察 で き る.機. その凹 凸 に応 じて ステ ー ジが上 下 し,試 料 の凹 凸 を観. 略 は 以 上 で あ る が,ピ. 察 して い るの かB3の 凹 凸 を観 察 して い るの か判 らな. パ ー モ ー タ ー の 制 御,た. くな る.そ こ でB3に は鏡 面 研 磨 したサ フ ァイ ア板 を. 市 販AFM,カ. リング状 磁 石 を接着 し,そ の上 にステ ー ジ用の 中空 円. エ ゾ の ド ラ イ ブ 制 御,ス. テ ッ. わみ量 の デ ー ター転送 な どシ. ン チ レバ ー の 最 近 の 進 歩. 倒 立 型 蛍 光 顕 微 鏡 と 一 体 化 さ れ たAFMが,Digital Instruments,. B4が あ り,. B4上 に固定 した ス テ ンレス球3個 の上 にAFMヘ. 械部 分 の概. 愛 す る.. 盤 を固 定す る.そ の中 空部 に対 物 レンズが下 か ら顔 を 示 した よう に,更 に基板B1,. 乱 に よる迷 光 のた め か. ス テ ム 全 体 の 制 御 に 関 す る 部 分 は紙 数 の 制 限 の た め 割. 面 に接 着 した磁 石 に よ り,円 筒 ピエ. ゾは常 に下 に引 っ張 られて い る.円 筒 ピエ ゾ上 面 に も. 出す.図2に. 固定. テージを. 固 定 され た マ イ ク ロ メー ター. ッ ドを 動 か し,カ. 凸 が あ る と,B3を 押 して ス テー ジ を走査 した とき,. 採 用 した.B3上. でB1. で 支 え ら れ て い る.B1に. さ れ た マ イ ク ロ メ ー タ ー でB2を. ピエ ゾ の 反 対 側 か ら は シ リ. れ ら3本. ッ ドの 高 さ が 調 整 さ れ る.B2はB1. 円筒 ピエ ゾの 底部 に貼 り付 け た 中空 円 盤(基 板B3) 照).板. 置 セ ン サ ー)が. 蛍 光 顕 微 鏡 の 台 に 固 定 さ れ て い る.. ッド. した.オ る.カ. TopoMetrixか. ら よ う や く商 品 化 さ れ だ. リ ン パ ス 光 学 工 業 か ら も市 販 され る 予 定 で あ ン チ レ バ ー は マ イ ク ロ フ ァ ブ リ ケ ー シ ョ ン技 術. を 使 っ て 大 量 に 製 作 さ れ る よ う に な り,価 格 も以 前 よ りは 安 く品 質 も向 上 した.Park Nanoprobe,オ. Science Instruments,. リ ンパ ス 光 学 工 業 な ど が 製 作 し て い る.. シ リ コ ン製 レ バ ー は 高 価 で あ る が,先 下 で あ る.窒. 端 径 が10nm以. 化 シ リ コ ン製 レバ ー の 先 端 径 は こ れ よ り. や や 大 き い が,材. 質 が 硬 く安 定 し て い て 安 価 な た め,. 広 く使 わ れ て い る.TopoMetrixは 技 術 を使 っ たEBDチ. 針 状 カ ー ボ ン成 長. ッ プ と 称 す る もの を 最 近 商 品 化. した. AFMの AFMは が,こ. 応用 生 命科 学 の広 い分 野 で 様 々 な応 用 が可 能 だ こ で は我 々 の 興 味 を 中 心 に 述 べ る.. <蛋 白 質 の 形 状 観 察>Hansmaら2)の さ れ た い.現. 最 近 の 総 説 も参 照. 時点 で は空 間分解 能 は電 子顕 微鏡 の そ れ 々 に 近 づ き つ つ あ る.大. 気中の. 乾 燥 試 料 よ り液 中 試 料 の 方 が 観 察 し や す い.大. よ り僅 か に 劣 る が,徐. 気中で. は 試 料 表 面 に 水 の 膜 が あ り,そ. れ が 探 針 と強 い 吸 着 を. 起 こ し走 査 時 に 試 料 を 引 っ掻 く原 因 に な る.液. 図2.. 製 作 した蛍 光顕 微鏡 一体 型 原子 間力 顕微 鏡 の概 略 図. 中で は. 吸 着 は 観 察 さ れ な い.蛋. 白 質 は 通 常 へ き 開 した ば か り. の 雲 母 に 吸 着 させ る.雲. 母 は負 に 帯 電 して い る の で,. 蛋 白 質 に よ っ て は 吸 着 しな い 場 合 が あ る.そ. の と きは,. 洗 浄 カ バ ー ガ ラ ス も し くは 雲 母 を ア ミ ノ シ ラ ン か ポ リ リジ ンで コ ー トす る.こ の フ ィ ラ メ ン ト,HMM,筋. 29. れ ま で,ア. ク チ ン と ミオ シ ン. 原 繊 維 を 観 察 し た.ア. ク.
(3) 生 物 物. (118). 理. Vol. 35 No.3 (1995). チ ンフ ィ ラメ ン トで は,そ の らせ ん の35nm半 周 期 は. 最 近,1分. 観察 で きたが,個 々 の アクチ ン分 子 を識 別で きてい な. 相 補 的DNA鎖. い.HMMで. リカ で測 定 され た.. は双頭 構 造 が は っ き り観 察 され るが,2. 子 で はない が,ア ビジ ン ー ビオチ ン間4), 間の 結合 力5)がそ れ ぞ れ ドイ ツ とア メ. nmの 太 さのS2部 は観 察 で きて い ない.S2部 は基 板 に. <反応 に伴 う蛋 白 質 の応 答測 定>蛋 白質 の 形状 な どが. し っか り固定 されて い ない のか もしれ ない.1画. 酵 素 反応 な どで どの ように ダ イナ ミックに変 化す るか. 像取. 得 時 間 は現 在 数十 秒 か ら分 の オー ダーで あ る.現 状 で. をAFMで. は蛋 白質形 状 変化 を追 跡 で きな い.速 度 を律 速 す る因. 像 取得 時 間 は長 く現 時点 で は不 可能 で あ る.或 る固定. 捉 える こ とは興 味 深 い.し か しなが ら,画. 子 は カ ンチ レバ ー と ピエ ゾ の共振 周 波数 にあ る.共 振. 点で の 応答 を観 察す る こ とは可 能 で あ る.Hansmaら. 周 波数 を上 げて ビデ オ レー トに近づ け る開発 を既 に開. は リ ソチ ー ムが 基質 と反 応 して い る とき にその高 さに. 始 した.. 1nm程. <物性 マ ッピ ング>蛋 白質 の弾 性,電 位,官 能 基 な ど. 揺 ら ぎの由来 の解 釈 は難 しいが,蛋 白質1分 子 の活動. が 蛋 白質全 体 に どの ように分 布 し,そ れが蛋 白 質 の活. 状 態 を物 理 的 に捉 えた点 で興 味 深 い.こ の よ うな研 究. 動 時 に どの よ うに変化 す る か を追跡 す る こ とは,機 能. は今 後盛 ん に なる と予想 され る.我 々 の研 究 室で もミ. 発 現 機 構 の解 明 に重 要 で あ ろ う.AFMに. オ シ ンのATP分. よ る蛋 白質. 度 の揺 らぎが 起 こる こ とを見 つ け た6).そ の. 解 中の応 答 を検 出す る こ とを試 みて. の物性 マ ッ ピング は現在 の ところ ほ とん ど行 われ てい. い るが,位 置 セ ンサ ー ノ イズの た め現 時 点 では応 答 は. ない.ハ ーバ ー ド大 学 の グル ープ は,カ ンチ レバ ー探. 検 出 されて い ない.. 針 に官 能基 を結 合 させ,親 水・疎 水 基 を あ るパ タ ー ン. 終 わ りに. で基板 に結合 させ た と き,探 針 と基 板 との 間の 摩擦 力. 今 回 の開発 で は プ ログ ラム ソフ ト制作 にかな り時間. パ ター ンが基 板 に形 成 した官 能 基分 布 と一致 す るこ と. を費 や した.プ ログ ラム と設 計 図が あ れば,実 際 の製. を観 察 した3).蛋 白 質表 面 の官 能 基の 分布 も空 間分 解. 作 には1年 あれ ば十 分 であ ろ う.自 作 を考 えて お られ. 能 の 向上 と と もに いず れ観 察 され る よ うにな る と期 待. る方 には連絡 いた だけ れ ば,す べ ての資 料 を一部 有料. され る.電 位 分 布 につ いて は,我 々の研 究 室で ミオ シ. で差 し上 げ ます.AFMは. ン頭 部 につ いて 現在 測 定中 で あ る.. れ始 め た段 階で あ り,今 後利 用 者が 急速 に増 え様 々 な. <1分 子 捕捉 ・ 力 学 測定>探 針 先 端 にHMM. 生 命 科 学 に よ うや く利用 さ. 工夫 が導 入 され多 くの新 しい発 見が な され る もの と確. 1分 子 を捕. 捉 し,基 板 に固 定 され た アクチ ンフ ィラ メ ン トとその. 信 して い る.尚,我. HMMと. manら に よ り類 似 のAFMが. の結合 力,ATP分. 解 で発 生 す る滑 りの 力 を計. 測す るこ と を現 在 目指 して い る(図1挿. 入 図).HMM. 々 の装 置 完 成 よ り1年 早 くPut‑ 製作 され た7).. 執 筆 の機 会 を与 えて い ただ いた東 京大 学 医科学研 究. 1分 子 を探 針 に捕 捉 す る た め に,ま ずHMMのS2部. 所 の片 山栄作 先 生,生 命 工学 工 業技 術研 究所 の宮 本宏. を特 異 的 に ビオチ ン化 した.こ のHMMを. 先生 に感謝 致 します.. 基 板 に 配向. 固定 した ア クチ ンフ ィ ラメ ン トに結 合 させ,そ こに ス. 文. トレプ トア ビジ ンコー トした蛍 光性 ア ク リル ア ミ ド 1) 安藤敏 夫,中 野勝志(1994)走. ビーズ を付 け る.探 針 先端 の ビ オチ ン化 は次 の よ うに. 置 を使 って この 表 面 に探 針. させ た 後,ア ミノ基 反応 性 ビオチ ンを滴 ら した雲 母 に 接 触 させ しば らく放 置 後引 き離 し,水 で洗 浄 す る.こ う して ビオチ ン化 した探 針 を蛍 光 を発 してい る ビー ズ 方. を非 常 にゆ っ くり と走査 す る.こ の方 法 で,探 針 先端 に ビーズ1個 を捕捉 す る こ とに我 々 は成功 した.力 学 計測 は現 在 進行 中で あ る.こ の研究 で,蛍 光 顕微 鏡 と AFMを. 組 み合 わせ た 利 点 が十 分 に発揮 され た.今 後. AFMに. よ る蛋 白質‑蛋 白 質間 及 び蛋 白 質‑基 質 間 に. 版.. 2) Hansma, H.G., Hoh,J.H. (1994) Ann. Rev.Biaphys. Biomol. struct.,23, 115-139. 3) Frisbie, C.D., Rozsnyai,L.F., Noy, A., Wrighton, M. S., Lieber,C.M. (1994) Science,265, 2071-2074. 4) Florin. E.L., Moy, V.T., Gaub, H.E. (1994) Science, 264, 415-417. 5) Lee, G.U., Chrisey, L.A., Colton,R.J. (1994) Science, 266, 771-773. 6) Radmacher, M., Fritz, M., Hansma,H.G., Hansma, P. K. (1994) Science,265, 1577-1579. 7) Putman, C.A.J., van der Werf, K.O.,de Grooth, B.G., van Hulst, N.F., Segerink, F.B., Greve, J. (1992) Rev. Sci. Instrum.,63, 1914-1917.. をア プロ ーチ し,接 触 した ら直 に引 き離す.十 分 乾燥. に ピンポ イ ン トア プ ローチ させ,そ の 周辺1μm四. 査型 トンネル顕微鏡/. 原子 間力顕微 鏡技術集成,IV‑5章,TIC出. 行 な う.希 釈 ア ミノ シラ ン溶液 を雲 母 に滴 ら し,あ る 程 度乾 燥 させ る.AFM装. 献. 働 く力 の計 測が 広 く行 われ る よ うに な ると想像 され る.. 30.
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