医薬品、検査薬に利用できる
標的膜タンパク質特異的ペプチドの
創製技術
産業技術総合研究所 バイオメディカル研究部門 研究部門付 久保泰 副部門長・グループリーダ 亀山仁彦 主任研究員 木村忠史研究背景
・創薬ターゲットの多くは、イオンチャネル、受容体、
トランスポータ等の膜タンパク質である。
・その多くは配列が類似するファミリーを形成し、
創薬ではそれらを識別できることが求められる。
・天然物（低分子化合物、ペプチド、糖など）には、
特異的に識別するものが存在。
・生理活性ペプチドの分子骨格を利用したランダ
ムペプチドライブラリー作製と膜タンパク質を標的
とする進化工学技術のノウハウを蓄積。
天然の生理活性物質に学ぶ
● 構造と活性相関や生理機能を探る分子ツールとして利用 bungarotoxin → ニコチン性アセチルコリン受容体 charybdotoxin → K+チャネル TTX, STX → Na+チャネル ● 治療薬や検査・診断薬、それらのシード化合物として利用 morphine, curare, atropine, etcconantokins, chrolotoxin, etc 天然は既に標的特異分子を
創り出すことに成功している
分泌腺・毒腺から新たな
Three-finger型ペプチドの進化系統樹 Nucleotide Substitutions (x100) 0 265.2 50 100 150 200 250 P01391 P01389 P25670 α-Bgt kappa BTx MicTx 7 P81783 P15818 MicTx 2 Q9YGI1 P29180 P29179 P01410 P17696 TXM2 TXM1 TXM3 MicTx 11 MicTx 3 MicTx 4 mLy-6Ab mLynx1 P81782 MicTx 5 MicTx 6 MicTx 1 MicTx 9 MicTx 8 P01443 P24778 MicTx 10 erabutoxin A P80548 P01427 P80958 P01414 P01413 P01403 Long α-neurotoxins Bungarus homologues Weak neurotoxins Synergic toxins Muscarinic toxins Lynx family Bucandin Cardiotoxins Short α-neurotoxins
L-type Ca2+ channel blocker
Platelet inhibitor Fasciculin nAChR mAChR cholinergic functions Ca2+ Ch protease
多様な標的を認識
a-Bgt MicTx1 MicTx2 MicTx3 MicTx4 MicTx5 MicTx6 MicTx7 MicTx8 MicTx9 MicTx10 MicTx11 MicTx12 mLynx1 Cardiotoxin 7 TMX1 TXM2 ErabutoxinB Toxin DaF 8
< Loop I > < Loop II > < Loop III >
Three Finger Peptide Library
10 20 30 40 50 60 70 80 --C---+---C+---C--+---+---C-+-C---+---CC----C----+---- IVCHTTATSP---ISAVTCPPG-ENLCYRKMWCDAFCSSRGKVVELGCAATCPSKKPY---EEVTCCSTDKCNPHPKQRPG
LECHVCAYNGDNCFKPMRCPAM-ATYCMTTRTYFT---PYRMKVRKSCVPSCFETVYDGYSKHASATSCCQYYLCNG LKCN-KLVPLF----YKTCPAG-KNLCYKM-FMMS---NKTVPVKRGCIDVCPKNSAL---VKYVCCNTDRCN LTCVTSKSIFG--ITTENCPDG-QNLCFKKWYYIV---PRYSDITWGCAATCPKPTNV---RETIRCCETDKCNE LTCVTTKSIGG--VTTEDCPAG-QNVCFKRWHYVT---PKNYDIIKGCAATCPKVDNN---DPIRCCGTDKCND RICFNHQSSQP--QTTKTCSPG-ESSCYHKQWSD----FRGTIIERGCG--CPTVKPG---IKLSCCESEVCNN MICYSHKTPQP--SATITCEEK---TCYKKSVRK----LPAIVAGRGCG--CPSKEML---VAIHCCRSDKCNE
進化の速い領域（=標的認識と親和性に関与）にランダム配列を導入
遺伝子情報 (genotype)と
タンパク質機能 (phenotype)を 一対一対応させる・・・進化工学
DNA/タンパク質ライブラリーからの試験管内分子進化
directed evolution in vitro
RNA DNA 選択 タンパク質合成 遺伝子の増幅 ● 進化工学‐1： 結合 ピューロマイシン リボゾーム・ディスプレイ StrepTag ● 進化工学‐２： 物理的に隔離 細胞・ファージ リポソーム エマルジョン DNA RNA タンパク質 DNA/RNA タンパク質
転写/mRNA 回収 PCR 増幅 翻 訳 ランダム配列 活性評価 ・解離定数 ・IC50 ・細胞アッセイ 選 択 この過程で標的分子や特性を 自由に設定することができる MicTx 3ペプチド (約 7 kDa) ３FペプチドcDNAライブラリー IL-6受容体を標的とするペプチドの指向的分子進化技術 IL-6受容体 （進化工学-１）
インターロイキン６受容体（IL-6R）標的ペプチドの評価 受容体結合活性 細胞増殖調節活性 Peptide IC50(mM) R10-13 R10-14 R10-15 R10-17 Stimulation 1.4 No inhibition No inhibition monoclonal Ab 0.67 Ligand/Peptide IC50(nM) R10-13 113 ± 7 R10-14 164 ± 9 R10-15 102 ± 13 IL6 80 ± 3 R10-17 No inhibition 選択ペプチド positive control (as an antagonist) 選択ペプチド positive control 拮抗的 拮抗的 拮抗的 非拮抗的 アンタゴニスト様活性 アゴニスト様活性 IL6と拮抗的・ 非拮抗的ペプ チドを取得 IL6受容体に アゴニスト あるいは アンタゴニスト として作用 （進化工学-１）
L1 L2 L3
3本指から1本指へ
活性のある3Fについて１本指（1F）毎の活性を調べた結果、L1（24アミノ酸）が 結合活性および生理活性を保持することが判明。 70アミノ酸から24アミノ酸へのダウンサイジングに成功 （進化工学-１）プラスミド 外膜 内膜 ペプチド 大腸菌の構造： 本発明における 膜タンパク質とペプチドの発現様態 Bacteria display Library 生理活性ペプチドcDNAにラン ダム配列を導入 Selection Amplification 選択されたcDNA配列情報を PCRにより増幅 標的分子と相互作用する ペプチドをタグを介して選択 ペリプラズム 膜タンパク質 ペプチド発現と標的分子の相 互作用空間としてperiplasm を利用
Intra Periplasm Secretion & Selection(PERISS)法
Randomize SS bond SS結合が維持できるようにCys残基を残し、ループ部分とC末端をランダム化 配列中の12アミノ酸残基をランダム化 2012種＝1015種 クモ毒ペプチドを鋳型としたランダムペプチドライブラリーの構築 DCLGFMRKCIPDNDKCCRPNLVCSRTHKWCKYVF 3 aa 4 aa 3 aa 2 aa （進化工学-２） GTx1-15
DNA library DNA-peptide library m2-peptide complex Amplification Selection Expression cDNA上の部分配列をランダム化 理論上約1015のバリエーション Magnetic beads ICK peptide cDNA ｍ２受容体を標的とするペプチドの指向的分子進化技術 peptide plasmid m2 receptor （進化工学-２）
★ m2受容体との結合親和性 ムスカリン性アセチルコリン受容体 標的ペプチドの評価 ★ ペプチドR6-Cのムスカリン受容体サブタイプ選択性 Inhibition (%) Conc. (nM) m1 subtype 6.0 438 m2 subtype 37.6 365 m3 subtype 10.4 438 m4 subtype 6.2 438
Peptide Inhibition (%) Conc. (mM)
R6-A1 54.6 6.0 R6-A2 46.0 5.4 R6-C 37.6 0.37 6サイクルの選択過程で、濃縮されてくるペプチドの種類と割合 Peptide A (25%), B (17%), C (13%), D (4%), E (4%), F (2%), ・・・・・ [3H]-NMSとの拮抗阻害 （進化工学-２）
PERISS法の特徴
①細胞膜に組込まれた膜タンパク質そのものを 用いてスクリーニングする。 ②大腸菌内膜上に提示できる様々なタンパク質 に適用できる。 ③様々なscaffoldのペプチドを鋳型として用いる ことが可能である。 ④大腸菌を扱う技術のみで実施できる。 ⑤安価である。 （進化工学-２）新技術の特徴・従来技術との比較
加速進化型ペプチドscaffoldを鋳型とした指向的進化技術の特長 （１） 低分子量： 抗体分子の50分の１以下 （４-７kDa） ・・・ 生産コスト （２） プロテアーゼ耐性： S-Sを含むコンパクトで堅固な三次構造 （３） 水溶性： 分泌性ペプチドが基本形で、また選択過程で可溶性ペプチドを選択 する （４） ターゲット分子及び評価系設定の高い自由度 標的がビースなどに固定化できればHTS化が可能 （５） 高い構造、化学特性、生理特性レパートリー ex. 10アミノ酸残基のランダム化では,理論上1013通りのバリエーション （６） １ｓｔスクリーニングを結合で評価する場合、正・負両生理特性を持つものが取 れる可能性
ex. Agonist/Antagonist、Blocker/Activator、Inhibitor/Stimulator
（７） scaffoldに多数の選択肢
天然のペプチドとその標的分子の組み合わせが参考になる場合がある
（８） 低抗原性
（進化工学-１ & ２）
「加速進化型」生理活性ペプチドのscaffoldを鋳型とした ペプチドライブラリーからの試験管内分子進化 公開中 ・特許出願 2006-140197 「スリーフィンガー様蛋白質ライブラリ」 ・特許出願 2007-030883 「IL-6受容体アゴニストもしくはアンタゴニスト活性を有するポリペプチド」 ・特許出願 2009-57114 「ポリペプチドライブラリーを調製する方法」 ・特許出願 2009-57211 「膜タンパク質を特異的に認識するポリペプチドの調製方法」 論文
・Directed evolution of a three-finger neurotoxin by using cDNA display yields antagonists as well as agonists of interleukin-6 receptor signaling. Molecular Brain (2011) 4: 2
・Characterization of voltage-dependent calcium channel blocking peptides from the venom of the tarantula Grammostola rosea. Toxicon (2011) 58: 265
・ Display of disulfide-rich proteins by cDNA display and disulfide shuffling assisted by protein disulfide isomerase. Analytical
Three-finger (3F) scaffold
in vitro evolution IL-6R 疾患マーカー
イオンチャネル soluble protein in vitro evolution muscarinic AChR イオンチャネル membrane protein (特許出願 2006年，2007年） (特許出願 2009年） ICK motif （進化工学-１ & ２）
創薬・検査薬 ・健康・疾患診断バイオマーカー検出 ・抗体医薬の代替 ・治療・診断薬開発のリード化合物 ・オーファンGPCRの脱オーファン化 ・薬剤とのコンジュゲイトによるＤＤＳ ・安全検査薬・キット （微生物・アレルゲン・毒素など特定成分の検出） ・家畜・養殖用の抗生物質の代替
想定される用途（１）
・医薬・検査薬・農薬 業界 ・バイオ研究用試薬 業界 ・農業・畜産・水産・食品 産業 （進化工学-１ & ２）バイオ研究用分子ツール・バイオマーカー ・標的タンパク質の 標識用タグ、マーカー 精製用のタグ、アフィニティー担体 ・生理特性、構造機能相関 解析の分子ツール ・生体情報の流れ・代謝パスの解析ツール ・三次元構造解析のツール
想定される用途（２）
（進化工学-１ & ２）想定される業界
受容体・イオンチャネル・トランスポーターなどの膜タン パク質を創薬ターゲットとする製薬企業 ペプチドからin silico創薬を目指す製薬企業 バイオマーカーなどによる臨床診断・検査の試薬・キッ トを開発する企業 生化学試薬・キット（ELISA、標識試薬、精製担体、イ メージング試薬など）を開発する企業 医薬品、食品、環境の安全性検査試薬・キットを開発 する企業 （進化工学-１ & ２）膜タンパク質・・・例えば、Gタンパク質共役受容体（GPCR）ヒトでは約1200種類（全遺伝子の約5%） 創薬ターゲットとして注目度が高い．リガンド不明の「オーファン受容体」も多数． タンパク質の構造は一部を除き解明されていない．そのため構造予測に基づく創薬が困難 750億ドル 世界の医薬品市場の10%強 （2007年） 大型医薬品市場上位10品目中、バイオ医薬品の件数 1品目 2000年 4品目 2007年 8品目 2014年予測 （METI バイオ・イノベーション研究会報告書2010年6月より）
