ゲル濾過法によるクロレラタンパク質の分画について

昭 和43年12月(1968) 5

ゲ ルろ 過 法 に よ る ク ロ レ ラ タ ン パ ク 質

の 分 画 に つ い て

亀

井 光

子*

Studies

on Fractionation

of Proteins

of

Chlorella

ellipsoidea

by Gel

Filtration

Mitsuko Kamei 1.は じ め に デ キ ス トラ ンの 架 橋 重 合 体 で あ る セ フ ァデ ッ ク スは IJ 1959年,ス エ ー デ ン のPorath, Flodinに よ っ て 初 め て"ゲ ル 涼 過 法"(gel filtration)と し て 応 用 さ れ た 。 以 来 こ の"分 子 節"(molecular sievii_g)効 果 が 分 析 や 調 製 の 一 手 段 と し て 生 化 学 的 研 究 分 野 で 広 く利 用 され て 来 た 。 た ま た ま 国 内 留 学 の 際,京 都 大 学 農 学 部 食 品 工 学 科 栄 養 化 学 研 究 室 に お い て,セ フ ァ デ ヅ ク ス に よ る ク ロ レ ラ 分 離 タ ン パ ク質 の 分 画 を 試 み た の で2,3の 実 験 例 を 報 告 す る 。 皿.実 験 X2-4) 最 初 に 次 の(皿 一1∼H-m)一 般 操 作 を 行 な っ た 。 II-1.ゲ ル の 選 定 市 販 品 セ フ ァ デ ッ ク ス はG-10∼G-200*1ま で10種 以 上 も あ る が,研 究 目 的1TL.適 し た も の を 選 び 出 さ ね ば な ら な い 。 ゲ ル 選 定 の 基 準 は ゲ ル に 試 料 を 添 加 し た 場 合 の 固 定 相 と,移 動 相 に 対 す るKd(分 配 係 数)に 差 の あ る も の を 選 ぶ の が 望 ま し い と さ れ て い る 。 本 実 験 で は,試 料 の タ ン パ ク 質 の 分 子 量 が 不 明 で あ る の で, Sephadex G・25(fine), G-100, G-150の3種 を 選 ん で,予 備 的 試 験 を 行 な っ た 。 皿一H.ゲ ル の 前 処 理 Sephadex G-25 (fine), G-100, G-150の3種 を * 本 学 生 物 化 学 研 究 室 *1,最 近,Sephadex G・200で は 分 画 出 来 な か っ た 高 分 子 量 範 囲 の 物 質 の 分 画 用 と し て"Sepharose" が 出 て い る 。 各 々 ビ ー カ ー に 取 り,十 分 量 の 蒸 溜 水 を 加 え て ガ ラス 樺 また は マ グネ チ ッ ク ス タ ー ラー で 撹 絆 し放 置 後 上 澄 を デ カ ンテ ー シ ョ ン す る。 こ の 操 作 を 数 回 く り 返 え す 。 膨 潤 に はG-25(fine)が 数 時 間, G-100及 びG-150は48時 間 以 上 を 要 す る。 膨 潤 後 実 験)'T1...使用 す る緩 衝 液 でbuffer changeを 行 う,G-150はG-25(fine), G-100に 比 較 して 気 泡 が 出 来 や す く必 要 に 応 じて ビー カ ー中 の ゲル を よ くか き ま ぜ 気 泡 を 除 去 した 。 皿一 皿.ゲ ル の 充dl カ ラ ムはPharmacia社 製1.5×30㎝,2.5×45㎝, 1.5×90㎝ の3種 を 用 い た 。 最 初 に カ ラ ムを 垂 直 に 固 定 す る 。(そ の簡 単 な 点 検 法 と して 錘 りの つ い た ひ も を た ら して み る と よ い 。)次 にこカ ラ ムの 下 端 を 閉 じ カ ラ ムの 約%∼%程 度 の 緩 衝 液 を 入 れ,前 処理 した ゲ ル を 稀 釈 して 粘 度 を低 下 させ ス ポ イ ド又 は 注射 器 で 少量 つ つ 加 え る 。 この 場 合G-100が 比 較 的 均 一 に充 填 しや す い の に 対 して,G-25(fine)は 沈 着 が 早 く不 均 一 に な りや す い か ら ガ ラス 棒 で 撹 搾 しつ つ 充 填 す る 。G-150は 気泡 が 出来 や す く また 軽 い の で ゲル表 面 を水 平 に 保 つ の に 細 心 の 注 意 を 要 し た 。 流 速 は試 料 を 流 出 す る場 合 と 同 じ条 件 に 保 つ の が 望 ま し く図1に 示 す よ うに,流 出管 の 高 さ及 び 緩 衝 液 の 高 さを 調 節 す る こ とで 圧 力 を 適 度 に保 つ 。 流 速 が 大 きす ぎ る と分 離 能 を 低 下 させ,ゲ ル ベ ッ ドを圧 縮 しか え っ て流 速 の低 下 を まね くお そ れ が あ る。G-100の 場 合 ポ ン プで 一 定 の 圧 力 を 加 え た が 流 速 が 低 下 した の で,自 然 流 出 の状 態 で 下 端 の コ ック の 開 閉 と緩 衝 液 の上 下 で 流 速 を調 節 し た 。 ゲル の充 填 を 終 了 した カ ラ ムは,こ れ を 安 定 させ る た め カ ラ ム容 積 の5∼10倍 の 緩 衝 液 を 流 出 させ る。

6 一 図1 圧 力の調整 法 皿 一IV.試 の 添 加 試 料 を 添 加 す る 前 に 高 分 子 のBlue dextran 2000(M・ W.200万;Pharmacia社 製)を 用 い て ゲ ル の 均 一 性 を 検 討 し た 。

Sephadex G・100(Pharmacia社 製, UpPsala) Column size:45 x 2.5cm

Eluant:0.1M borate-NaOH-2M urea buffer solution, pH 10 図2 Blue dextranの 溶 出 (6) *1.Biuret法 に よ っ て 定 量 し た 。 食 物 学 会 誌 ・第22号 Flow rate:12m1/hr. Tube volume:5m1 ゲル 上 面 の緩 衝 液 を 静 か に 取 り,2∼3瞬 の 残 った緩 衝 液 は 下 端 よ り 流 下 させ ゲル が 空 気 に ふ れ る 直 前 で Blue dextan O.5m!を ゲ ル の 表 面 が み だ れ な い 様 に 加 え る。Blue dextranが ゲ ル に 吸 収 され た ら直 ち に 少 量 の緩 衝 液 で カ ラ ム内 部 に 付 着 し て い るの を 洗 う。 こ の操 作 を 数 回 く りか え した 後 緩 衝 液 を 加 え て溶 出 し, フ ラ ク シ ョ ン コ レク タ ーで 分 取 しな が らLKB 4701A UV cordで260mμ に お け る 吸 光 度 を 測 定 した 。 そ の 結 果 着 色 帯 は 狭 い 幅 で 均 一 に 流 下 し,そ の 溶 出 曲線 が 図2.に 示 す よ うな 正 規 分 布 を 示 した の で,カ ラ ムに ゲ ル が 均 一 に 充 填 され て い る とみ な し次 の 条 件¥}L.従って 試 料 を 添 加 した 。 (5) ㈹ 常 法 に 従 っ てArnonのA5と 炭 素 源 と し て グ ル コ ー ス0 .2°oを 加 え たMyer培 地 で,培 養 器 表 面 で の 光10kluxの 連 続 照 射 の 下 で,エ ア ー コ ン プ レ ッ サ ー よ り02を 送 り な が らChlorella ellipsoideaを96時 間 培 養 した 。 こ の よ うに し て え た 藻 体 か ら タ ン パ ク 質 の 試 料 を つ ぎ の 処 置 に よ っ て と り 出 し た 。 Chlorella(fresh paste)

‐soaked in 10 volume of 8M urea solution (24hr.30°C) ‐cent「ifuged(8000r _{.p.m.×30min.}}

i

i

Precipitate

Supernatant

i S

ample

こ の 様 に し て 得 た 標 品 は タ ン パ ク 質 含 量 が1。1mg/ m!*1と 低 い た めpolyethylene glycol X6000で 濃 縮 後 緩 衝 液 で 溶 析 し た,ゲ ル 演 過 は 次 の 条 件 で 行 な っ た 。 Sephadex G・100(Pharmacia社 製, Uppsala)

Column size:1,5x30cm

Sample:2m`(Protein 4.2mg/mの

Eluant:0.1M borate-NaOH-2M urea buffer solution, pH 10 Flow rate:12m〃hr. Tube volume:5m! 溶 媒 と し て は 最 初6Mま た は4M尿 素 緩 衝 液 を 用 い た が 流 速 が お そ く分 画 出 来 な か っ た 。つ ぎ にご,2M尿 素 を 含 む 緩 衝 液 で 溶 出 し,280m,u及 び500mｵで の 吸 光 度 測 定 を 行 な っ た が,な お,分 画 不 充 分 で 測 定 値 が 低 く,誤 差 の 範 囲 を 出 な か っ た 。 そ こ で,カ ラ ム を 大 き く し, Sephadex G-100 Column size:2.5x45cm

昭 和43年12月(1968)

Sample:3.5m!

Eluant:0.1 M borate-NaOH-2M urea buffer solution, pH 10 Flow rate:12m〃hr. Tube volume:5m! で 溶 出 し 図3.に 示 す 結 果 を 得 た 。 こ の 値 も前 者 と 同 じ く測 定 値 が 誤 差 の 範 囲 を 出 な か っ た の で,Sample 量1∼5ml,流 速8∼25m〃hr.の 諸 条 件 で 同 様 に 溶 出 を 試 み た が い ず れ も不 成 功 で あ っ た 。 こ の 原 因 は 溶 (1」) 媒 の 性 質 及 びSampleが か な り高粘 度 のた め 拡 散 が お さえ られ,移 動 相 と固 定 相 と の交 換 が さ また げ られ 分 離 効 果 が 低 下 した もの と考 え られ る 。 7 得 ら れ た 試 料 は 次 に 示 す2つ の 条 件 で 溶 出 し た 。 (1) Sephadex G-150 Column size :1.5x150cm Sample:1ml(11,5mg protein/ml) Eluant glycine-NaOH-2M urea buffer solution, pH10,ｵ=0.1 Flow rate:10m〃hr. Tube volume:5m!

(2)

Sephadex G-25(fine (13) Column size _{1 .5x90cm} Sample:1m!(20rng protein/mの

Eluant glycire-NaOH-2M urea buffer solution , 図3 Sephadex G・100に よ る ク ロ レ ラ分 離 タ ン パ ク質 の 分 画 gH10,ｵ=0,1 Flow rate:10rn〃hr _. Tube volume:5m! Sephadex G-150を 用 い た ゲ ル 沮 過 で は 図4.に 示 し た よ うに,ク ロ レ ラ分 離 タ ン パ ク 質 は 少 な く と も2つ の 分 子 量 的 に 異 る 成 分 に 分 画 さ れ た 。Sephadex G-25 (fine)の 場 合 もG-150と 同 様 に2つ に 分 画 さ れ た(図5)。 同 条 件 で 行 な っ たBlue dextranの 実 験 よ り,FractiOn 1は 相 当 高 分 子 の タ ン パ ク 質 と推 定 さ れ る 。Fraction 2は500mｵ に よ る タ ン パ ク 質 定 量 値 が 低 い の に 比 較 し て,260mμ に か な り強 い 吸 収 が 見 られ 一 ⑧ 実 験 ㈹ の結 果 に も とづ き,溶 媒 を か え,次 の様 な ロリ 調 製 を試 み た 。 Freeze-dried Chlorella ヒ コ のリノ た ことか ら核酸 関連物 質 を含む もの と考 え られ る。 図4 Sephadex G・150に よ る ク ロ レ ラ分 離 タ ン パ ク質 の 分 画

~—soaked in 10 volume of mixed solvent (methanol 4 : hexane 3) —centrifuged Decolorized Cells tate Supernatant Precipitate —dissolved ---dialyzed Sample

—soaked in 20 volume of 8M urea solution (72hr. 30°C) —stirred

—centrifuged _{(8000r .p.m. x 30min.)} Supernatant

—dialyzed against running tap water

(24hr.) —added 1N-CH3COOH to make pH4 . 0.

centrifuged (10, 000r.p.m. x 50min.)

in buffer solution against buffer solution

一 8 一

図5 Sephadex G・25(fine)に よ る ク ロ レ ラ 分 離 タ ン パ ク 質 の 分 画 280mｵ

...500mｵ

一 一 一 260mｵ(A:Blue dextran, B:Riboflavin

食 物 学 会 誌 ・第22号 度 のSampleを 得 る よ うに 試 料 を 調 製 す る。 (6)Sampleの 添 加 量 は 一 般 に ゲ ル 容 量 の1/10以 下 が 好 ま しい と され て い る 。 し か し分 離 タ ン パ ク質 は粘 性 を 有 す る場 合 が あ り,ゲ 』ル 容 量 の1/100以下 が 妥 当で, Sample添 加 時 に ゲ ル の上 面1(m以 内 のSample容 量 な らば 高 粘 度 で な い 限 り分 離 可 能 と考 え る。 ⑦ 溶 媒 のpH,μ を考 慮 し,少 量 の 電 解 質 を 含 む 溶 媒 で 溶 出 す るの が よい 。 予 備 実 験 の 段 階 で,一 般 操 作 法 の 習 得 と共 に試 料 の 性 質 を 知 り,各 々 の実 験 目的 に 最 も適 したSampleの 調 製 法 と溶 媒 を 選 定 す る こ とが ゲル 沸 過 法 に よ る分 画 の成 否 を 決 め る要 因 で は な いか と考 え る 。 本 研 究 に あ た り,御 懇 篤 な 御 指 導 を 賜 わ りま した 京 都 大 学 農 学 部 満 田久 輝 教 授 を は じめ 河Gr:安 本 両 博 士 な らび に 同 研 究 室 の 方 々に 深 く感 謝 い た します 。 また 研 修 費 を御 援 助下 さい ま した 私 学 研 修 福 祉 会,京 都 女 子 学 園 育 友 会 な らび に 維 持 会 に お 礼 申 し上 げ ます 。

文 献

皿一V.ゲ ル の 回収 使 用 後 の ゲル は 回 収 し0.1N・HCI,0.1N-NaOH等 で 洗 い,蒸 溜 水 で 充 分 洗 浄 す る。 湿 潤 状 態 に 保 存 す る場 合 は トル エ ン,フ ェ ノ ール な どを 流 して お く。 乾 燥 保 存 す る場 合 は 蒸 溜 水 で 洗 海 後 ブ フ ナ ーの ロー ト上 で 吸 引 沮 過 しな が ら50%エ タ ノー ル,90%エ タ ノー ル で 洗 い600Cで 加 熱 乾 燥 す る。 皿.お わ り に 以 上 の 実 験 結 果 よ りSephadexを 用 い た ゲ ル 浜 過 法 で 分 離 効 果 を あ げ るに は,次 の 点 を 考 慮 す べ き で は な い か と考 え る。 (1)実 験 目的 に 適 した ゲ ル 及 び カ ラ ムの 選 定 。 (2)カ ラ ムは 垂 直 に 立 て,ゲ ルは 均 一 に 充 填 しゲ ル 内 Y'気 泡 が 発 生 し な い よ うに す る。 この た め に は ゲ ル の 膨 潤 時 と カ ラ ム に充 填 して か ら の温 度 差 を 少 な く保 つ こ と及 び 充 填 前 に 脱 気 し,充 填 時 に ガ ラ ス棒 で撹 拝 す る等 の操 作 が 必 要 で あ る。 (3)ゲ ル上 面 を 水 平 に 保 ち,Sampleは ピペ ッ トで 静 か に 均 一 に 注 入 す る。Sample内 の 気 泡 は 必 要 に 応 じ て 脱 気 す る 。 (4)流 下 速 度 は カ ラ ムの 内径 の大 小 に よ つて 異 るが は や す ぎ な い方 が よい 。 (11-1fi) (5)Sample濃 度 は 高 くて も 分 離 効 果 を 妨 げ な い が,粘 度 は 分 離 効 果 に 大 き な 影 響 を 及 す の で 低 粘 (1) J.Porath, P.Flodill:Nttture,183,1657(1959). (2) J.Porath:Liochim.β ゴoρ乃ys. Acta,39,193

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