目次 1 事業で用いた分析法 実験方法 試料 試薬 ) ソルビン酸標準品 ) その他の試薬 装置及び器具 定量方法 ) 抽出 ) HPLC による測定 )

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平成 28 年度愛玩動物用飼料の分析法検討等委託事業に関する調査報告書

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目次

1 事業で用いた分析法 ... 3

2 実験方法 ... 3

2.1 試料 ... 3

2.2 試薬 ... 5

1) ソルビン酸標準品 ... 5

2) その他の試薬 ... 5

2.3 装置及び器具 ... 5

2.4 定量方法 ... 5

1) 抽出 ... 5

2) HPLC による測定 ... 5

3) 計算 ... 6

3 結果 ... 7

3.1 検量線... 7

3.2 妨害物質の検討 ... 8

3.3 添加回収試験 ... 11

3.4 定量限界及び検出限界 ... 15

3

1 事業で用いた分析法

「愛玩動物用飼料等の検査法」

（平成 21 年 9 月 1 日付け 21 消技第 1764 号（独立行政法人農林水産

消費安全技術センター理事長通知）

）第 7 章「5 ソルビン酸」を用いた。

2 実験方法

2.1 試料

以下の 8 分類の市販のペットフード 10 製品をそれぞれ 1mm の網ふるいを通過するまで粉砕して

用いた。ただし、粉ミルクについては、粉砕処理をせずにそのまま用いた。

また、それぞれに表示された原材料を表 1 に示した。

（ア）犬用成型ジャーキー

（イ）猫用成型ジャーキー

（ウ）素材乾燥ジャーキーハードタイプ

（鶏ササミを主な原料とし、水分含量が 10～15％のもの）

（エ）素材乾燥ジャーキーソフトタイプ

（鶏ササミを主な原料とし、水分含量が 25％程度のもの）

（オ）素材乾燥ジャーキーソフトタイプ

（鶏ササミ以外を主な原料とし、水分含量が 25％程度のもの）

（カ）素材乾燥ジャーキーソフトタイプ

（鶏ササミ及び上記オの原料以外を主な原料とし、水分含量が 25％程度のもの）

（キ）ビスケット類

（ク）粉ミルク

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表 1 ペットフードの製品タイプと原材料リスト

製品の種類

犬・猫用

の別

原材料

（ア）－①犬用成型ジャーキー 犬用

鶏肉、でん粉類、ショ糖、大豆たん白、食塩、ソルビトール、プロピレ

ングリコール、ポリリン酸 Na、ビタミン D、着色料（黄 4、赤 106）

（ア）－②犬用成型ジャーキー 犬用

鶏肉（胸肉、ささみ）、コーンスターチ、ソルビトール、グリセリン、

pH 調整剤、プロピレングリコール、ミネラル類（ナトリウム）、リン

酸塩（Na）、酸化防止剤（ビタミン C）、発色剤（亜硝酸ナトリウム）、

調味料、食用色素（赤 102、黄 5）

（イ）猫用成型ジャーキー

猫用

鶏肉、大豆粉、食物繊維、コーンスターチ、小麦でん粉、たんぱく加水

分解物、酵母エキス、デキストリン、食塩、粉末卵白、ソルビトール、

グリセリン、トレハロース、水酸化カルシウム、タウリン、酸化防止剤

（ビタミン E）

（ウ）素材乾燥ジャーキー

ハードタイプ

（鶏ササミを主な原料

とし、水分含量が 10～

15％のもの）

犬用

鶏ささみ

（エ）－①素材乾燥ジャーキー

ソフトタイプ

（鶏ササミを主な原料

とし、水分含量が 25％

程度のもの）

犬用

鶏ささみ、ソルビトール、食塩、でん粉、水あめ、粉末卵白、植物油、

グリセリン、プロピレングリコール、酸化防止剤（亜硫酸 Na、エリソ

ルビン酸 Na、BHA）、リン酸塩 Na、調味料、保存料、水酸化 Ca、発色

剤（亜硫酸 Na）、増粘多糖類（アラビアガム、グァーガム）、エタノ

ール、クエン酸

（エ）－②素材乾燥ジャーキー

ソフトタイプ

（鶏ササミを主な原料

とし、水分含量が 25％

程度のもの）

犬用

・

猫用

鶏（ささみ）

（オ）素材乾燥ジャーキー

ソフトタイプ

（鶏ササミ以外を主な

原料とし、水分含量が

25％程度のもの）

犬用

牛肉

（カ）素材乾燥ジャーキー

ソフトタイプ

（鶏ササミ及び上記オ

の原料以外を主な原料

とし、水分含量が 25％

程度のもの）

犬用

・

猫用

たら、D-ソルビトール

（キ）ビスケット類

犬用

小麦粉、蔗糖、全卵、難消化性デキストリン（食物繊維）、動物性脂肪、

乳製品、バター、食塩、膨張剤、ミルクオリゴ糖、ユッカ抽出物

（ク）粉ミルク

犬用

乳たん白質、動物性脂肪、脱脂粉乳、植物性油脂、卵黄粉末、ミルクオ

リゴ糖、乾燥酵母、pH 調整剤、乳化剤、L-アルギニン、L-シスチン、

DHA、ビタミン類（A,D,E,B1,B2,パントテン酸,ナイアシン,B6,葉酸,カ

ロテン,B12,C,コリン）、ミネラル類

（Ca,P,K,Na,Cl,Mg,Fe,Cu,Mn,Zn,I,Se）、ヌクレオチド、香料（ミルク

クリーム）

5

2.2 試薬

1) 標準品

ソルビン酸標準品は表 2 の関東化学㈱製を用いた。

表 2 ソルビン酸標準品

物質名

分子式

CAS 番号

メーカー

純度

ソルビン酸

C

6

H

8

O

2

110-44-1

関東化学

100.0％

ソルビン酸標準品 500 mg を正確に量って 25 mL の全量フラスコに入れ、メタノールを加えて

溶かし、更に標線まで同溶媒を加えてソルビン酸標準原液を調製した（この液 1 mL はソルビン

酸として 20 mg を含有する。）。

使用に際して、ソルビン酸標準原液の一定量をメタノールで正確に希釈し、1 mL 中にソルビ

ン酸として 0.05 ～50 µg を含有する数点のソルビン酸標準液を調製した。

2) その他の試薬

メタノール

5 mmol/L クエン酸溶液；クエン酸一水和物 0.7 g 及びクエン酸三ナトリウム二水和物 0.6 g

を水に溶かして 1,000 mL とした。

※メタノールは関東化学㈱製の高速液体クロマトグラフ用を用いた。クエン酸一水和物、クエ

ン酸三ナトリウム二水和物は和光純薬工業㈱製の特級を用いた。

2.3 装置及び器具

1) 高速液体クロマトグラフ（以下「HPLC」という。）：LC-10AVP（UV) 島津製作所製

2) 振とう機：TAITEC SR-2DW タイテック製

3)

ロータリーエバポレーター：EYELA MUC-2100 東京理科器械製

4)

遠心分離機：TOMY EX-136 トミー精工製

5)

メンブランフィルター：GL サイエンス社製 PTFE 13φ0.45µm

6)

粉砕機：ZM-100 Retsch 製（1mm スクリーン、回転数 14000rpm）

7) ガスクロマトグラフ質量分析計：HP6890series MS5973 アジレントテクノロジー社製

2.4 定量方法

1) 抽出

分析試料 10.0 g を量って 200 mL の共栓三角フラスコに入れ、メタノール 100 mL を加え、15

分間振り混ぜて抽出する。抽出液を約 10 mL の共栓遠心沈殿管に入れ、2,000×g で 10 分間遠心

分離する。上澄み液の一定量をメタノールで正確に 10 倍希釈し、メンブランフィルター（孔径

0.45 µm 以下）でろ過し、HPLC に供する試料溶液とした。

2) HPLC による測定

試料溶液及び各ソルビン酸標準液各 10 µL を HPLC に注入し、表 3 の測定条件に従ってクロマ

トグラムを得た。

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表 3 ソルビン酸分析の HPLC 条件

検出器

紫外吸光光度検出器（測定波長：260 nm）

カラム

L-column L-C18 （内径 4.6 nm、長さ 150 nm、粒径 5 µm）

溶離液

5 mmol/L クエン酸溶液－アセトニトリル－メタノール（7+2+1）

流速

1.0 mL/min

カラム槽温度

40℃

3) 計算

得られたクロマトグラムからソルビン酸のピーク高さ及びピーク面積を求めて検量線を作成

し、試料中のソルビン酸量を算出した。定量法の概要を Scheme 1 に示した。

試料 10.0 g （200 mL 共栓三角フラスコ）

←メタノール 100 mL

振とう 15 min

抽出液 約 10 mL（共栓遠心沈殿管）

遠心分離 10 min

上澄み一定量をメタノールで 10 倍希釈

メンブランフィルターでろ過

試料溶液

HPLC

Scheme 1 愛玩動物用飼料中のソルビン酸定量法フローシート

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表 4 各種ペットフードのソルビン酸の回収率及び繰返し精度（ピーク面積法）

ペットフード の種類 添加濃度/ ［ mg/ kg］ ソルビン酸 定量値 / ［ mg/ kg］ 回収率 / [％] 定量値 / ［ mg/ kg］ 回収率 / [％] 定量値 / ［ mg/ kg］ 回収率 / [％] 定量値 / ［ mg/ kg］ 回収率 / [％] 定量値 / ［ mg/ kg］ 回収率 / [％] 1 回目 1 8 6 7 9 3 .4 1 9 3 2 9 6 .6 1 8 6 7 9 3 .4 1 9 6 4 9 8 .2 1 9 3 8 9 6 .9 2 回目 1 9 2 5 9 6 .3 1 9 7 4 9 8 .7 1 8 9 7 9 4 .9 1 9 2 2 9 6 .1 1 9 6 7 9 8 .3 3 回目 1 9 2 5 9 6 .3 1 9 6 9 9 8 .5 1 9 1 0 9 5 .5 1 9 8 2 9 9 .1 1 8 9 4 9 4 .7 4 回目 1 9 1 3 9 5 .7 1 9 2 2 9 6 .1 1 9 1 2 9 5 .6 1 9 3 4 9 6 .7 1 9 1 0 9 5 .5 5 回目 1 8 8 7 9 4 .3 1 9 8 8 9 9 .4 1 9 2 2 9 6 .1 1 9 6 1 9 8 .1 1 9 6 0 9 8 .0 平均値 1 9 0 3 9 5 .2 1 9 5 7 9 7 .9 1 9 0 2 9 5 .1 1 9 5 2 9 7 .6 1 9 3 4 9 6 .7 繰返し精度/ RSDr% 1 .3 4 1 .4 5 1 .1 1 1 .2 4 1 .6 2 ペットフード の種類 添加濃度/ ［ mg/ kg］ ソルビン酸 定量値 / ［ mg/ kg］ 回収率 / [％] 定量値 / ［ mg/ kg］ 回収率 / [％] 定量値 / ［ mg/ kg］ 回収率 / [％] 定量値 / ［ mg/ kg］ 回収率 / [％] 定量値 / ［ mg/ kg］ 回収率 / [％] 1 回目 1 8 .6 4 9 3 .2 1 9 .4 8 9 7 .4 1 8 .3 3 9 1 .7 1 8 .7 3 9 3 .7 1 8 .9 9 9 5 .0 2 回目 1 9 .3 6 9 6 .8 1 9 .2 3 9 6 .1 1 8 .9 2 9 4 .6 1 9 .3 8 9 6 .9 1 8 .3 6 9 1 .8 3 回目 1 9 .3 9 9 7 .0 1 9 .1 2 9 5 .6 1 9 .2 0 9 6 .0 1 9 .0 9 9 5 .5 1 8 .6 7 9 3 .4 4 回目 1 9 .4 5 9 7 .3 1 9 .3 7 9 6 .9 1 9 .1 0 9 5 .5 1 8 .6 5 9 3 .3 1 9 .2 5 9 6 .3 5 回目 1 8 .8 3 9 4 .2 1 8 .8 7 9 4 .4 1 8 .6 9 9 3 .4 1 9 .2 1 9 6 .1 1 8 .8 4 9 4 .2 平均値 1 9 .1 4 9 5 .7 1 9 .2 1 9 6 .1 1 8 .8 5 9 4 .2 1 9 .0 1 9 5 .1 1 8 .8 2 9 4 .1 繰返し精度/ RSDr% 1 .9 4 1 .2 2 1 .8 4 1 .6 4 1 .7 8 2 ,0 0 0 2 ,0 0 0 2 ,0 0 0 2 ,0 0 0 2 ,0 0 0 ア- ② ウ カ キ ク 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 ア- ② ウ カ キ ク

表 5 各種ペットフードのソルビン酸の回収率及び繰返し精度（ピーク高さ法）

ペットフード の種類 添加濃度/ ［ mg/ kg］ ソルビン酸 定量値 / ［ mg/ kg］ 回収率 / [％] 定量値 / ［ mg/ kg］ 回収率 / [％] 定量値 / ［ mg/ kg］ 回収率 / [％] 定量値 / ［ mg/ kg］ 回収率 / [％] 定量値 / ［ mg/ kg］ 回収率 / [％] 1 回目 1 8 6 7 9 3 .4 1 8 9 7 9 4 .8 1 8 3 9 9 2 .0 1 9 2 2 9 6 .1 1 9 3 9 9 7 .0 2 回目 1 9 1 4 9 5 .7 1 9 2 7 9 6 .3 1 8 6 7 9 3 .4 1 9 0 6 9 5 .3 1 9 6 2 9 8 .1 3 回目 1 9 1 2 9 5 .6 1 9 1 8 9 5 .9 1 8 8 5 9 4 .3 1 9 6 1 9 8 .0 1 9 0 1 9 5 .1 4 回目 1 9 0 1 9 5 .0 1 8 7 9 9 3 .9 1 8 9 7 9 4 .8 1 9 0 4 9 5 .2 1 9 0 7 9 5 .4 5 回目 1 8 7 7 9 3 .9 1 9 2 7 9 6 .4 1 8 9 6 9 4 .8 1 9 2 3 9 6 .1 1 9 5 8 9 7 .9 平均値 1 8 9 4 9 4 .7 1 9 1 0 9 5 .5 1 8 7 7 9 3 .8 1 9 2 3 9 6 .2 1 9 3 4 9 6 .7 繰返し精度/ RSDr% 1 .1 1 1 .1 1 1 .2 8 1 .1 9 1 .4 5 ペットフード の種類 添加濃度/ ［ mg/ kg］ ソルビン酸 定量値 / ［ mg/ kg］ 回収率 / [％] 定量値 / ［ mg/ kg］ 回収率 / [％] 定量値 / ［ mg/ kg］ 回収率 / [％] 定量値 / ［ mg/ kg］ 回収率 / [％] 定量値 / ［ mg/ kg］ 回収率 / [％] 1 回目 1 8 .7 2 9 3 .6 1 9 .3 4 9 6 .7 1 8 .2 4 9 1 .2 1 9 .0 1 9 5 .0 1 8 .8 4 9 4 .2 2 回目 1 9 .1 2 9 5 .6 1 9 .1 8 9 5 .9 1 8 .9 0 9 4 .5 1 9 .4 2 9 7 .1 1 8 .6 8 9 3 .4 3 回目 1 9 .3 6 9 6 .8 1 9 .1 4 9 5 .7 1 9 .3 1 9 6 .5 1 9 .2 0 9 6 .0 1 8 .9 0 9 4 .5 4 回目 1 9 .4 0 9 7 .0 1 9 .1 5 9 5 .7 1 8 .9 1 9 4 .6 1 9 .0 5 9 5 .3 1 9 .3 4 9 6 .7 5 回目 1 9 .1 7 9 5 .8 1 9 .2 3 9 6 .2 1 9 .0 6 9 5 .3 1 9 .3 2 9 6 .6 1 9 .0 4 9 5 .2 平均値 1 9 .1 5 9 5 .8 1 9 .2 1 9 6 .0 1 8 .8 8 9 4 .4 1 9 .2 0 9 6 .0 1 8 .9 6 9 4 .8 繰返し精度/ RSDr% 1 .4 2 0 .4 4 2 .0 9 0 .9 1 1 .3 3 ア- ② ウ カ キ ク 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 ア- ② ウ カ キ ク 2 ,0 0 0 2 ,0 0 0 2 ,0 0 0 2 ,0 0 0 2 ,0 0 0

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3.4 定量限界及び検出限界

5 製品それぞれについて、定量限界濃度 10 mg/kg 相当量で 5 点の添加回収試験を実施したとこ

ろ、検査法通知第 11 章「3（4）の定量限界及び検出限界」の条件を満たしていることを確認した

（表 6、7）。また、クロマトグラムの一例を図 7-1 から 7-6 に示した。

表 6 各種ペットフードのソルビン酸の回収率及び繰返し精度（ピーク面積法）

ペットフード の種類 添加濃度/ ［ mg/ kg］ ソルビン酸 定量値 / ［ mg/ kg］ 回収率 / [％] 定量値 / ［ mg/ kg］ 回収率 / [％] 定量値 / ［ mg/ kg］ 回収率 / [％] 定量値 / ［ mg/ kg］ 回収率 / [％] 定量値 / ［ mg/ kg］ 回収率 / [％] 1 回目 9 .2 6 9 2 .6 9 .3 9 9 3 .9 9 .8 0 9 8 .0 9 .6 2 9 6 .2 9 .1 1 9 1 .1 2 回目 9 .2 4 9 2 .4 9 .7 6 9 7 .6 9 .2 8 9 2 .8 9 .9 3 9 9 .3 9 .5 1 9 5 .1 3 回目 9 .0 7 9 0 .7 9 .6 8 9 6 .8 9 .2 6 9 2 .6 9 .6 2 9 6 .2 9 .4 6 9 4 .6 4 回目 9 .5 8 9 5 .8 9 .8 7 9 8 .7 9 .3 0 9 3 .0 9 .5 8 9 5 .8 9 .2 5 9 2 .5 5 回目 9 .3 1 9 3 .1 9 .4 3 9 4 .3 9 .2 2 9 2 .2 9 .5 0 9 5 .0 9 .4 0 9 4 .0 平均値 9 .2 9 9 2 .9 9 .6 3 9 6 .3 9 .3 7 9 3 .7 9 .6 5 9 6 .5 9 .3 5 9 3 .5 標準偏差 0 .1 8 2 8 0 .2 0 9 5 0 .2 4 0 8 0 .1 6 6 0 0 .1 6 1 3 繰返し精度/ RSDr% 1 .9 7 2 .1 8 2 .5 7 1 .7 2 1 .7 3 S/ N ≧1 0 ≧1 0 ≧1 0 ≧1 0 ≧1 0 t値 0 .2 9 1 0 .3 3 3 0 .3 8 3 0 .2 6 4 0 .2 5 7 標準偏差×t値×2 0 .1 0 6 0 .1 4 0 0 .1 8 4 0 .0 8 8 0 .0 8 3 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 ア- ② ウ カ キ ク

表 7 各種ペットフードのソルビン酸の回収率及び繰返し精度（ピーク高さ法）

ペットフード の種類 添加濃度/ ［ mg/ kg］ ソルビン酸 定量値 / ［ mg/ kg］ 回収率 / [％] 定量値 / ［ mg/ kg］ 回収率 / [％] 定量値 / ［ mg/ kg］ 回収率 / [％] 定量値 / ［ mg/ kg］ 回収率 / [％] 定量値 / ［ mg/ kg］ 回収率 / [％] 1 回目 9 .3 7 9 3 .7 9 .5 8 9 5 .8 9 .5 0 9 5 .0 9 .8 5 9 8 .5 8 .9 5 8 9 .5 2 回目 9 .3 8 9 3 .8 9 .9 2 9 9 .2 9 .3 2 9 3 .2 9 .7 8 9 7 .8 8 .9 8 8 9 .8 3 回目 9 .3 0 9 3 .0 9 .8 1 9 8 .1 9 .0 2 9 0 .2 9 .7 7 9 7 .7 9 .5 6 9 5 .6 4 回目 9 .5 4 9 5 .4 9 .8 7 9 8 .7 9 .0 8 9 0 .8 9 .4 1 9 4 .1 9 .1 0 9 1 .0 5 回目 9 .4 5 9 4 .5 9 .6 7 9 6 .7 9 .2 8 9 2 .8 9 .7 0 9 7 .0 9 .2 4 9 2 .4 平均値 9 .4 1 9 4 .1 9 .7 7 9 7 .7 9 .2 4 9 2 .4 9 .7 0 9 7 .0 9 .1 7 9 1 .7 標準偏差 0 .0 8 9 5 0 .1 3 9 2 0 .1 9 0 3 0 .1 6 9 9 0 .2 4 9 1 繰返し精度/ RSDr% 0 .9 5 1 .4 2 2 .0 6 1 .7 5 2 .7 2 S/ N ≧1 0 ≧1 0 ≧1 0 ≧1 0 ≧1 0 t値 0 .1 4 2 0 .2 2 1 0 .3 0 3 0 .2 7 0 0 .3 9 6 標準偏差×t値×2 0 .0 2 5 0 .0 6 2 0 .1 1 5 0 .0 9 2 0 .1 9 8 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 ア- ② ウ カ キ ク