Title
A novel polymorphism, E254K, in the 5-lipoxygenase gene
associated with bronchial asthma( 内容の要旨(Summary) )
Author(s)
白, 春英
Report No.(Doctoral
Degree)
博士（医学）甲 第740号
Issue Date
2008-03-25
Type
博士論文
Version
URL
http://hdl.handle.net/20.500.12099/23107
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氏名(本籍) 学位の種類 学位授与番号 学位授与日付 学位授与要件 学位論文題目 審 査 委 員 白 春 英(中華人民共和国) 博 士(医学) 甲第 740 号 平成 20 年 3 月 25 日 学位規則第4条第1項該当
A nove[polymorphism,E254K,in the5-1ipoxygenase gene associated with
bronchialasthma (主査)教授 近 藤 直 美 (副査)教授 高 見 剛 教授 浦 島 満 論文内容の要旨 小児気管支晴息をはじめとするアレルギー疾患の発症には,遺伝的要因と環境要因とが深くかかわっ ている｡申請者はこの遺伝的要因のうち,気道収縮を引き起こすメディェ一夕ー産生に関する酵素であ る5-1ipoxygenaseの遺伝子多型について検討した｡ 5-1ipoxygenase遺伝子のexon6に新たな多型 c.760G〉A(E254K)を見出した｡これは小児気管支喘息患者180人中11･人に見られ,150人のコントロ ールには見られなかった｡C.760G〉Aの頻度は,小児気管支喘息患者とコントロールの間に有意な違い が認められた(p=0.0007)｡5-1ipoxygenaseのc.760G〉A(E254K)は小児気管支喘息の病態と関連してい る可能性があると考えた｡次に,C.760G〉A(E254K)の気管支喘息の病態における役割を明らかにする目 的で尿中のLTE4排泄量と好中球からのLTB4産生量について検討した｡さらに,Realtime PCRによる messageの発現の程度を確認した｡最後に,5-1ipoxygenaseの蛋白立体構造モデルを構築し,C.760G〉A (E254E)が蛋白表面に位置することが確認された｡ 【研究対象および研究方法】 1)対象は,′ト児気管支喘息患者180名およびアレルギー症状を持たないコントロール150名である｡ 2)対象者の好中球よりDNAを抽出した｡ 3)抽出したDNAを用いて,Auto sequencerにて5-1ipoxygenase遺伝子の塩基配列を検討した｡ 4)小児気管支喘息患者とコントロールの尿中のLTE4の排泄量を比較検討した｡ 5)小児気管支喘息患者とコントロールの好中球をionomycinで刺激して,LTB4産生量を比較検討した｡ FicollTPaqueを用いて分離した好中球を10%胎児牛血清を含むRPMI1640の培養液にて2XlO6個/mlの 濃度に調製し,無刺激,またはionomycin(1FLM)にて刺激し37℃,5%炭酸ガス培養器で15min,30min培 養した｡培養上清中のLTB4をC18逆相カラムを用いて分画分取し,精製後ELISA(LTB4Immunoassay kit)を用いて測定した｡ 6)小児気管支喘息患者とコントロールのリンパ球からmRNAを抽出し,CDNAを合成して,RealtimePCR よる5-1ipoxygenaseのmRNA発現の程度を確認した｡ 7)5-1ipoxygenae蛋白立体構造モデルを作成し,新たに同定した多型の位置を確認した｡ 【研究結果】 1)5-1ipoxygenaseのコーディング領域の塩基配列を検討した｡これまでに報告されているExonl,2,13
のsilent mutation(c.21C〉T,C.270G〉A,C.1728A〉G)以外にexon6に新たなmissense mutation
(c.760G〉A(E254K))を同定した｡ 2)これまでに報告されているc.21C>T,C.270G>A,C.1728A>Gの3種類の多型におけるallele 頻度とgenotype頻度は,小児気管支喘息患者とアレルギー症状をもたないコントロールの間に有意な 違いは見られなかった｡C.760G〉A(E254K)の頻度は,小児気管支喘息患者180名中heterozygousが 10名,homozygousが1名,みられたが,アレルギー症状のみられないコントロール150名にはみられな かった｡A alleleの頻度は両者の間に有意差(p=0.0007)があった｡
-45-3)c.760G〉A(E254K)の小児気管支喘息の病態における役割を明らかにする目的で尿中のLTE4排泄量と 好中球からのLTB4産生量について検討した｡コントロールに比べて,小児気管支喘息患者では,LTE4 排泄量が増加していた｡しかし,C.760G〉A(E254K)の有無では,LTE4排泄量に明らかな違いは見ら れなかった｡ 好中球をionomycinで刺激して,O min,15min,30minのLTB4産生量を小児気管支喘息患者とコン トロールで検討した｡いずれも無刺激ではLTB4は産生されなかったが,15min,30minでLTB4産生 が確認された｡LTB4産生量は15minと30minで気管支喘息患者はコントロールに比べて,LTB4産生 量は増加傾向にあったが,C.760G〉A(E254K)の有無では有意差が見られなかった｡ 4)小児気管支喘息患者はコントロールに比べて,5-1ipoxygenaseのmRNAの発現は増強していた｡ c.760G〉A(E254K)のwild typeの小児気管支喘息患者はコントロールに比べて,5-1ipoxygenaseの mRNAの発現が2.6倍の増強であったのに対し,C.760G〉A(E254K)をもつ患者はコントロールに比べ て,mRNAの発現が3.1倍増強した｡ 5)5-1ipoxygenaseの蛋白立体構造モデルを構築し,C.760G〉A(E254K)は5-1ipoxygenase蛋白質の表 面にあることを確認した｡Eが負の電荷であるのに対しEは正の電荷となる｡蛋白表面に位置し,負 が正の電荷に変わることは,蛋白質自身の安定性や細胞内の他の蛋白との結合に影響を与える可能性 があると思われる｡ 【考察】 小児気管支喘息患者を対象に5-1ipoxygenaseの塩基配列を検討したところ,これまでに報告されてい るExonl,2,13のsilentmutation以外にexon6の中に新たなc.760G〉A(E254K)を見い出した｡C.760 G〉A(E254K)は小児気管支喘息患者とコントロールと比較するとA alleleの頻度は両者の間に有意差が あった｡気管支喘息患者はコントロールに比べて,尿中のLTE4の排泄量と好中球のLTB4産生量が増加 傾向にあった｡C.760G)A(E254K)の有無ではLTE4排泄量,LTB4産生量に有意差は見られなかった｡小 児気管支喘息患者はコントロールに比べて,5-1ipoxygenasemRNAの発現が増強していた｡さらに,C.760 G)A(E254K)は5-1ipoxygenase蛋白質の表面にあることを確認した｡表面に位置し,負が正の電荷に変 わることは,蛋白質自身の安定性や細胞内の他の蛋白との結合に影響を与える可能性があると思われる｡ 以上より,5-1ipoxygenase遺伝子に存在するc.760G〉A(E254K)は気管支喘息の病態と関連している 可能性があると考えた｡ 論文審査の結果の要旨 申請者 白春英は,小児気管支喘息の発症,増悪に関する遺伝的要因の病態解明を目的とし, 5-1ipoxygenase遺伝子の塩基配列を検討した｡Exon6の中に新規のc.760G〉A(E254K)多型を同定し, さらにこの多型は小児気管支喘息の病態と有意に関連していると考えられた｡この成果は小児科学なら びにアレルギー学の研究の進歩,発展に少なからず寄与するものと認められる｡ [主論文公表誌] Anovelpolymorphism,E254K,inthe5-lipoxygenasegeneassociatedwithbronchialasthma INTERNATIONALJOURNALOFMOLECULARMEDICINE21,139-144(2008).
