血 球 ミ ト コ ン ド リ ア の 細 胞 化 学 的 研 究
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(2) 1898. 酒. 井. 晃. は30分 で 充 分 で あ り種 々 な 後 染 色,ア 材 料 材 料 と し て は 人,家 髄,リ. ンパ 節,末. と 方 法. 兎,ラ. 梢 血,腹. ル コール 脱水 ,. キ シ ロ ー ル 透 徹 バ ル サ ム 封 入 も 可 能 で あ る.な お何. ッ ト.マ. ウ スな どの骨. 水 細 胞 な ど を 用 い た,人. れ の 場 合 に もsubstrate 液 を 除 い て 同 量 のphosphate. の 骨 髄 及 び リ ンパ 節 は 手 術 的 摘 出 又 は 切 除 材 料 及 び. を 用 い た.他. 死 後 時 間 の 短 い 剖 検 材 料 か ら得 た.家. に 一 部 は 凍 結(‑20℃,. 兎,マ. ウスの. 骨 髄 は 断 頭 失 血 死 せ しめ た もの か ら採 取 し た.末 血 は 人 及 び 家 兎 で は耳 よ り ラ ッ ト,マ. 梢. ウ スで は 尾 静. 脈 よ り 得 た.酵. 素 反 応 は そ れ ら の 塗 抹,ス. 未 乾 燥 標 本,細. 胞 浮 遊 液,組. タ ン プ,. 織 小 片 につ いて 行 つ た. controlと. してsuccinate. bufferを. 加 え た もの. 方 固 在 基 質 反 応 を 除 去 又 は 減 ず る ため 10分)処. 理 を 行 つ た もの. に つ い て 同 様 の 反 応 を 行 い そ の 結 果 を 上 記 の方 法 に よ つ て 得 た 結 果 と比 較 した.そ. の 他 反 応 の特 異 性 を. 検 す る た め に 一 部 加 熱(80℃, 10分)或 nate. (10‑2M),. cyanide. (10‑3M),. はmalo antimycin. A. .コハ ク酸 脱 水 素 酵 素 系 の 反 応 は コハ ク酸 ソ ー ダ を 基. (0.1〜100γ)な. 質 と し,ネ. た も の に つ い て も検 討 した.塗. 抹 及 び 捺 印 標 本 で反. 未 だ 血 球 に は 応 用 さ れ た こ との な い 二 ト ロ ネ オ テ ト. 応 し た も の は 反 応 後 直 ち に,乾. 燥 後 フ ォル マ リン蒸. ラ ゾ リ ウ ム塩14)及. 気 固 定(2〜12時. 間)又. は そ の ま ま10%フ. ン固 定(1〜2時. 間)後. 無 染 色 の ま ま 又 は 後染 色 後. オ テ トラ ゾ リウ ム 塩 の 他,最. ム 塩15)な. 近 合 成 され. び ニ ト ロ ブ リュ ー テ ト ラ ゾ リ ウ. ど を 水 素 受 容 体 と して 用 い た.即. ち反 応. ど の 酵 素 活 性 阻 害 剤 を 添 加12) 13)し. ォル マ リ. 液 の 組 成 は ネ オ テ トラ ゾ リウ ム 塩 の 場 合 は0.2Mコ. 主 に グ リセ リ ン浸 及 び ポ リ ビ ニ ー ル ア ル コー ル で封. ハ ク 酸 ソ ー ダ 液, 0.2%. 入 し,又. 水 溶 液, 0.1M燐. Neotetrazolium. 酸 緩 衝 液(pH. chloride. 7.6)の. に 混 じ た 液 又 は 緩 衝 液 の か わ り に1M.. 各 々 を等 量 の. 細 胞 浮 游 液 及 び 組 織 小 片 で 反 応 せ しめ た も の は反. 同 量 を 加 え た も の を 用 い た12)16).反 応 は 血 液 と基 質. 応 後 直 ち に 塗 抹 又 は ス タ ン プ 標 本 と して 同様 処 理 し. 混 液 を 混 合 し て37℃. た.組. で1〜2時. Sucrose液. 一 部 は チ ェー デ ル油 又 は脱水 透徹 後バルサ. ム で 封 入 し検 鏡 した.. 間 施 行 し た.な. お. 織 小 片 の 一 部 は ネ オ テ トラ ゾ リウ ム 塩 及 び ニ. 反 応 を 定 量 的 に 行 う た め に 基 質 混 液 と 細 胞 数 とを 一. トロ ネ オ テ トラ ゾ リ ウ ム 塩 処 理 の 場 合 は10%フ. 定 の 比 率 に 保 つ よ う に 心 掛 け た12) 16).ニ ト ロ ネ オ テ. マ リ ン固 定 後Carbowax包. ト ラ ゾ リ ウ ム 塩 はB.. Pearson氏. か ら供 与 され た も. の で 大 体 そ の 組 織 化 学 的 原 法14)に 球 に 応 用 した.即. ちNitroneo‑tetrazolium. (Nitro‑NT)のN, 10mg. N‑dimethyl. 15ml),. phosphate. 準 じ て そ れ を血. 0.1M. buffer. Sodium. (pH. 7.6)三. chloride. formamide溶 succinate液,. 液 0.1M. 者 等 容 混液を用い. 埋 切 片,ニ. ォル. トロ ブ リュ. ー テ ト ラ ゾ リ ウ ム 塩 処 理 の 場 合 は パ ラ フ ィ ン切 片 と し て 観 察 し た.後. 染 色 はgiemsa染. 色では酵素反応. 顆 粒 と ア ヅ ー ル 顆 粒 と の 鑑 別 が 困 難 とな るの で Safranin. O又. はhematoxylin‑eosinで. た も の を 参 考 と し た.赤. 芽 球,網. 軽 く後染 し. 赤 血 球 及 び 赤 血球. は主 と して顕 微 分 光 装 置 を用 いて4,060Aに 於ける す. た. Nitro‑NTは thyl. 水 に や や 溶 け 難 い が, N, N‑dime. formamldeは. もNitro‑NTを. 酵 素 反応 に 影 響 を与 えな い で 而 溶 解 す る.反. 応 はNeotetrazolium. の 場 合 と 同 様 に して37℃. で30分 〜1時. で30分 〜1時. で1〜2時. た.二 man氏. 間 或 は25℃. phate. buffer. Nitro‑blue sodium. (pH. 7.6)三. M. Selig. 0.1M. ち反 応 chloride ph0s. 者 等 容 混 液 を 用 い た.. 反 応 は前 二 者 の 場 合 と同様 血 液 と この 混 液 を 混合 し て 行 つ た, Nitro‑blue. tetrazoliumは. 微 細 で針 状 結 晶 を 作 らず 更 に脂 質 に. も 溶 け ず 脂 溶 性 溶 媒 に も溶 け な い.従. 的 観 察 を 併 用 した.そ. の 他 本 反 応 が 従 来 の 諸種 ミ ト. コ ン ド リア 染 色 よ り優 れ か つ 特 異 的 で あ る ことを証 明 す る た め にJanus緑 色, Sudan. black. 超 生 体 染 色, Altmann氏. BやNile. 標 本 と 比 較 観 察 し た.又. blueに. 本 反 応 陽 性 顆 粒 と血 球 内諸. 種 顆 粒 と の 関 係 を 調 べ る た め にMay‑Giemsa染 及 びNeutral. red超. 染. よ る脂 質 染 色. 色. 生 体 染 色 標 本 と比 較 した.. 組織内浸透性. が 強 く反 応 が 極 め て 鋭 敏 で 而 も 反 応 生 成 物 た る diformazanは. 吸 収 に よつ て観 察. 本 反 応 が ミ ト コ ン ド リア に 一 致 して 出 現す. 固 定 塗 抹 標 本 及 び 超 薄 切 片 標 本 に つ い て 電 子 顕 微鏡. tetrazolium. succinate液,. し た.又. 間 反 応 せ しめ. 準 じ て そ れ を 血 球 に 応 用 し た.即. 液 と し て は0.1%. テ トラ ゾ リウ ム の 還 元 生 成 物)の. オ. る こ と を 証 明 す る た め に 溶 血 未 固 定 及 び オ ス ミウム. か ら供 与 さ れ た も の で 大 体 そ の 組 織 化 学 的. 水 溶 液, 0.2M. 於 け るdiformazan(ネ. 間 或 は25℃. トロ ブ リ ュー テ トラ ゾ リウ ム 塩 はA.. 原 法15)に. ヘ ム の 吸 収 と5,200Aに. つて反応時間. 成. 績. 反 応 の 特 殊 性 並 に 局 在 性 に 関 す る観 察 と吟味: 反 応 は 何 れ のditetrazolium塩. を 用 い た場 合に も.
(3) 血 球 ミ トコ ン ド リアの 細 胞化 学 的 研 究 成熟 赤 血 球 を除 く全 血 球 の 細 胞 質 内 に そ の 酵 素 活 性. のdiformazanは. 1899 脂 溶 性 溶 媒 で抽 出 出来 な い の で活. の 強弱 に 応 じて 鮮 明 な 球 形 顆 粒 乃 至 桿 状 体 と して 出. 性 度 の 測定 が 出来 な い.然. 現 す る.反 応 生 成 物diformazanはneo‑tetrazolium. S‑V効. 塩 及 びnitro‑neotetrazolium塩. 顕微 分光 測 光 装 置 を用 いて1ケ づつ の細 胞 に つ い て. tetrazolium塩. で は 濃 紫 色, nitroblue. で は 深 青 色 で あ る.核. は 全 く反 応 陰. 果 に よ る誤 差)を. の活 性 を測 定 す る事 が 出 来 る.酵 素 反 応 の 特 異性 に. 性 で あ る.反 応 は 血 球 の ミ トコ ン ド リア に 一 致 し に. つい て は80℃,. て 出 現 す る.反 応 の 鋭 敏 度 はnitro‑blue. マ ロ ン酸 ソー ダ(10‑2M)添. tetrzolium. >nitro‑neotetraaolium>neotetrazoliumの 低 下 し 組 織 内 浸 透 性 はnitro‑blue neotetrazolium>nitro‑neotetrazoliumの. 順 序で. し 或 程 度 の 誤 差(特 に 覚 悟 す れ ば何 れの 場 合 も. 10分 処 理 で反 応 は完 全 に 陰性 化 し 加 に よつ て僅 か の 固在. 基 質 反応 を除 く基 質特 異的 反 応 は殆 ん ど完全 に阻害 され る.最 も問 題 とな るの は固 在 基 質反 応 で あ るが. tetrazolium> 順 に弱 く. これ は極 めて 軽度 な の で反 応 時 間 を短 縮 す る こ とに. な るが 塗 抹 或 は 細 胞 浮 游 液 で の 反 応 の 場 合 は 何 れ も. よつ て或 は凍 結 処 理 に よつ て 殆 ん ど陰性 化 し得 る.. 速 か に 浸 透 す る.反. 応 顆 粒 の 性 状 はnitro‑blue. 然 し固 在 基 質反 応 は反 応 条 件 が適 当 な場 合 は殆 ん ど. 最 も微 細 で 次 でnitro‑neotetrazolium,. ミ トコ ン ドリアの固 在 脱 水 素 酵 素 系 に よつ て ミ トコ. tetrazoliumが. neotetrazoliumの. 順 で あ る.反. 応条 件 と時 間が 適 当. ン ド リア に一 致 して 出現 す るの で ミ トコ ン ド リアの. であ れ ば 何 れ の 場 合 に も ミ ト コ ン ド リア に 一 致 して. 特 異 的細 胞 化学 的 検 出 に は支 障 はな い.た だ コハ ク. 反応 が 出現 す る が 反 応 時 間 が 長 す ぎ る と 顆 粒 が 互 に. 酸脱 水 素 酵 素活 性 の 特 異 的検 出乃 至 特 異 的活 性 度 の. 融 合 粗 大 化 す る 傾 向 が あ る.特. 測 定 を 目的 とす る場 合 に は上 記 処 理 に よつ て固 在 基. にneotetrazolium. で は反 応 顆 粒 が や や 粗 大 で 屡 々diformazanの 晶 を生 ず る,然. 結. し新 鮮 細 胞 で は 細 胞 外 に 反 応 顆 粒 の. 生 ず る こ と は 殆 ん ど な い. neotetrazolium及 nitro‑neotetrazoliumのdifromazanに. び. は この よ う. 質 反 応 を除 く必 要 が あ る.又 本 反 応 標 本 は長 期 保 存 に耐 え る. 赤 血球 系細 胞 の 反 応 と成 熟 に伴 う変 化: 赤 血球 系で は明 か に幼 若 赤 芽 球 ほ ど ミ トコン ド リ. な 傾 向 は な い が 之 等 は 脂 質 に 溶 け易 く或 程 度 二 次 的. アが 多 く活 性 も強 い.屡 々検 出 され る分 裂 中 の赤 芽. に脂 質 の 共 染 を 伴 う.特. 球 や二 核 性 赤 芽 球 に も多数 の ミ トコ ン ド リア を認 め. に そ れ ら のditetrazolium. 塩 が 不 純 でmonotetrazolium塩. を 含 有す る場合 は. 強 い活 性 が 現 わ れ る.成 熟 に従 つ てhemeの. 吸収 が. 反 応 生 成 物 は 脂 質 に 溶 け 易 く又 結 晶 を 作 り易 い.又. 増 す と逆 に ミ トコ ン ドリアの 数 や 活性 が 減 ず る.更. 凍 結 細 胞 や 凍 結 切 片 で は そ の 傾 向 が 強 く遊 離 浮 游 細. に脱 核 後 の 網 赤 血球 に も先 に示 した如 く少 数 の ミ ト. 胞 で は そ の 傾 向 が 少 い 合 然 し脂 質 の 二 次 的 染 色 像 は. コ ン ドリアが 存在 し本 酵 素活 性 が認 め られ る.成 熟. そ の 色 が 淡 い の で 一 般 に 容 易 に 区 別 出 来 る . nitro. 赤 血 球 に至 る と ミ トコン ド リアが 消 失 し本 酵 素 活 性. blue tetrazolium塩. 脂 質 に も脂 溶. も消 失 す る.な お 同一 細 胞 内 の ミ トコ ン ド リア に も. 性 溶 媒 に も溶 け な い の で 細 胞 化 学 的 に 優 れ て い る が. そ の大 小活 性 の 強弱 が 認 め られ る.こ れ らの反 応 が. のdiformazanは. 反 応 が 極 め て 鋭 敏 な た め に ミ ト コ ン ド リア に 一 致 し. ミ トコ ン ドリアの み に特 異 的 に 出現 す る こ とを調 べ. た コハ ク酸 脱 水 素 酵 素 反 応 の 他 に 固 在 還 元 系 に よ る. るた め に 後染 色 しな い標 本 につ い て 顕微 分 光装 置 を. 反 応 が 出 現 し易 い,又. 用 い て 反 応 顆 粒 の 観 察 を 行 つ た.先. 反 応 中 細胞 構造 が幾 分破 壊 す. す. る傾 向 が あ る.好 気 的 条 件 下 に 於 て 特 に 赤 血 球 が 多. で 観 察 す る とhemeの. 数 混在 す る場 合 はneotetrazoliumで. 認 め ら れ 白 血 球 系 細 胞 は 全 然hemeの. は 著 し く反 応. の低 下 を来 す か ら末 梢 血 の 塗 抹 標 本 で は 観 察 困 難 で あ るがnitro‑blue. tetrazoliumは. そ れ ら の条 件 に. よつ て 反 応 の 減 弱 を 来 す こ と 少 く未 梢 血 の 塗 抹 或 は 浮 游 液 の 状 態 で充 分 反 応 を 出 現 せ しめ る こ とが 出 来 る. aeotetrazolium塩 塩 のdiformazanは (同 量 混 液)で. 及 びnitro‑neotetrazolium 脂 溶 性 溶 媒 就 中ether‑acetone. 容易 に 抽 出 し得 る ので 一定 量の 細 胞. hemeの. 線. 強 い吸 収 が 赤 血 球 系 細胞 内 に. 細 胞 質 内 にdiformazan顆 る(第13図).. ず4,060Aの. 吸 収 がな い が. 粒 の 弱 い 吸 収 が 認 あ られ 吸 収 を示 す 赤 芽 球 の 細胞 質 内. に も 同 様 顆 粒 の 弱 い 吸 収 が 認 め られ(第14図),更 に脱 核 後 の 網 赤 血球 内 に も同 様 顆 粒 の 吸 収 を認 め る (第15図).こ. れ はneo‑tetrazoliumのdiformazan. は5,200Aに. 極 大 吸 収 を もつ が4,060A附. む. 収 を もつ た あで あ る.こ れ をdiformazanの. 近 に も吸 極大吸. を用いて反応 を行 い その 抽 出液 を用 い て比 色定 量 を. 収 波長 で観 察 す る とhemeの. 行 う事 に よ つ て 化 学 的 に 酵 素 活 性 度 の 測 定12) 16)を. 網 赤血 球 内 に強 いdiformazan顆. 行 い得 る利 点 が あ る が,. れ る.こ の顆 粒 の分 布 と性状 は後 に示 す電 顕 像 に於. nitro‑blue. tetrazolium塩. 吸 収 は 消 え て赤 芽 球 や 粒 の 吸収 が 認 め ら.
(4) 1900. 酒. け る ミ トコ ン ド リ ア の 像 と全 く一 致 す る.第16図. 同様5,2OOAに. 井. は. 於 け る白血 球 の反 応顆 粒 の吸 収 像 で. 晃. ド リア に 強 い 親 和 性 を 示 さ ず17). そ してJanus緑. あ る. 次 に東 に これ を確 認 す るた め に酵 素 反 応 を 施 行 し た網 赤 血球 を0.8%の 生 理 的食 塩 水 に2.5%の. 割合 に. ,脂 質 の 共 染 を伴 い. そ の 染 色機 構 は 確 実 で な く而 も速 か に 脱 色 され る. で 染 ら な い網 赤 血 球 の ミ トコン ド. リア も本 反 応 で は 鮮 明 に 検 出 出 来 る. Altmann氏 染 色 或 はSudan. black. Bな. ど に よ る脂 質 染色 で は. フ ォル マ リンを溶 か した 液 で溶 血 固 定9) 10) 11)し電 子. ミ トコ ン ド リア 以 外 の 物 質 の 共 染 を 伴 い 又nile blue. 顕 微 鏡 的 に観 察 す る とdiformazan顆. そ の 他 の 色 素 に よ る超 生 体 染 色 で は小 胞 体 が凝 集 し. 粒 の 分 布 と同. 様 に ミ トコ ン ドリアの存 在 す る こ とが わ か る.勿 論. て ミ トコ ン ド リア と 共 染 す る17).然. 電 顕 像 でdiformazan自. は 更 に 好 中 性,好. 先 に示 したdiformazan顆. 身 の 吸収 は認 め られ な いが 粒 が これ らの 電 顕像 に 於. Azur顆. 粒,中. 酸 性,好. るに 本 酵 素反 応. 塩 基 性,偽. 性 紅 顆 粒, Golgi装. 好 酸 性顆 粒,. 置 な ど と も関 係. け る ミ トコ ン ド リア に一 致 して現 われ た とい う こと. が な くて ミ ト コ ン ド リア に 特 異 的 で あ る.徒 つ て 本. は 疑 い の余 地 が ない.こ. 反 応 は 血 球 ミ ト コ ン ド リア の 細 胞 化 学 的 特 殊染 色法. の こ とは 後編(第4編)に. 於 け る超 薄 切 片 に よ る血 球 ミ トコ ン ドリア の 細胞 化. と して 賞 揚 さ れ る.こ. 学 的電 子 顕 微 鏡 的観 察 に よつ て決 定 的 に確 証 され る.. 布 及 び その 本 酵 素活 性 の 強弱 は血 球 の呼吸機能状聾. 従 来 網 赤血 球 は種 々 な超 生体 色 素 に よつ て 観 察 され. を 反映 す る もの で あつ て 蛋 白合成 の 旺盛な幼若細胞. て 来 たが之 等 はERを. で は そ の 活 性 が 高 い.そ. 染 め る も の で ミ トコ ン ドリ. れ ら ミ トコ ン ド リア の数,分. の 呼 吸 に よつ て 産 生 され た. ア を染 め る もので な い事 が 明 らか に され た17) 18) 21) 22).. エ ナ ジ ー は 血 球 の 分 化 乃 至 成 熟 に 必 要 な 物 質 の 合成. 然 し本 法 に よれば 網 赤血 球 の ミ トコン ド リアが 細 胞. に 利 用 さ れ る も の と 考 え られ る.. 化 学 的 に証 明 され る. Janus緑. に染 らな くて も充 分. な酵 素 活性 のあ る事 が明 かに され た.. ミ トコ ン ド リア の 形 態 と 機 能 に 関 す る初 期 の研 究 は 専 ら光 学 顕 微 鏡 に よ つ て な さ れ た.即 ちAltmann. 白血球 系細 胞 の反 応 と成 熟 に 伴 う変 化. (1890)10)が. 本 酵 素 反 応 に よつ て 調 べ た 各種 血 球 内 に 於 け る ミ. 見 出 しbioblastenと. 細 胞 の 生 命 に 極 め て 大 切 な顆 粒 と して. トコ ン ド リア とそ の酵 素 活 性 の 分 布 は第17図 に示 す. drioSome. 如 くで あ る.即 ち一般 に比 較 的 幼 若 な血 球 に は ミ ト. da)23)と. コン ド リア の数 も多 く酵 素 活 性 も高 い.成 熟 に従 つ. 細 胞 学 的 染 色,例. て ミ トコン ド リアの 数 も減少 し活 性 も低 下 してゆ く .骨 髄 性 幼 若 白血 球就 中骨髄 芽 細 胞 で は細 胞 質 全体 に. 1890)10), acyanol. 名 付 け て 以 来 そ れ がchon. (Benda‑Meves)或. はmitchopdria. (Ben. 称 せ ら れ る よ う に な つ た が 古 くか ら幾 多 の. Janus. え ばAniline‑fuchsin green. (Michaelis,. (Hetheringtqon,. 1936)11),そ. (Altmann, 1899)1).. Pin. の 他 の 酸 化還. ほぼ 平 等 に 散在 し核 陥 凹部 の あ る もの で は 多少 その. 元 色 素 な ど に よ つ て 観 察 さ れ て き た.中 で も血球 に. 部 に多 い.前 骨髄 細 胞 以 後成 熟 顆 粒 の 出 現 す る段 階. つ い て はJanus. にな る と好 中性,好 酸 性,好 塩 基 性 細 胞共 に や や反. コ ン ド リア の 特 殊 染 色 法(Cowary,. 応 顆粒 は不 規 則 な 分 布 を示 す,成 熟 に従 つて 核 の 形. て 最 も広 く利 用 さ れ て 来 た.そ. の 変 化,成 熟 顆 粒 の 増 加 と共 に ミ トコ ン ドリアの 数. は 可 成 り詳 し く調 べ ら れ ミ トコ ン ド リア の 有 す る酸. も減少 し散 在 性 とな る.単 球 系 で は 一般 に活 性 が 強. 素 呼 吸(Kinsberg, 1912)25),チ. greenに. よ る超 生 体 染 色9)が ミ ト 1924)24)と し. の 染 色機 構 に つ いて. ト ク ロ ー ム 系呼 吸. い.細 網 細胞 で は細 胞 質全 体 に散 在 性 に 多数 出現 し. 酵 素 に よ つ て 糸 粒 体 に 入 つ た 色 素 の み 酸 化 型 とな り. 塗 抹 細 胞 で は ミ トコ ン ド リア は核 の 上 に も重 つ て 現. 着 色 し他 の 部 で は 還 元 さ れ て 色 を 失 うた め に 認め ら. わ れ る.リ ンパ球 系 細胞 で は特 に核 陥 凹 部 に 集 つ た. れ な い と 説 明 さ れ た(Lazarow. 巨大 桿 状 の ミ トコ ン ドリアに 一致 して強 く現 わ れ る. 1950,. 傾 向が あ る.巨 核 球 は最 も ミ トコ ン ドリアの 数 が 多. 粒 を 電 顕 下 に と ら え た.本. く活 性 も強 い.全 体 的 に 瀰 漫性 に散 在 し塗 抹 に よ つ. 1953)26).然. and Cooperstein,. し妹 尾 等 は特 殊 の 方 法 で この顆 色 素 に ミ たコ ン ドリアを. 特 異 的 に 染 色 す る も の で あ りそ の 他 の 細胞 質 にはそ. て ミ トコ ン ドリア が 移動 し難 く核 の 上 に も陥 凹部 内. の 還 元 型 す ら存 在 しな い 事 が 明 か に さ れた.然. に も周辺 部 に も散 在 して現 われ る.. 方 又 こ れ で 染 ら な い ミ トコ ン ド リア も存 在 す る事が. し一. 明 らか に さ れ た.最 近 妹尾 等 は超 生染 色素の固定法 考. 案. 従 来 ミ トコン ド リア の特 色 染 色 法 と して 愛 用 され て 来 たJanus緑. は必 ず し も全 て の血 球 の ミ トコ ン. を 記 載 し27), Janus緑. で染 め られ た ミトコンドリア. を ヘ マ トキ シ リン染 色 標本 で 観察 す る ことを可能に した が之 に よつ て 染 らな い ミ トコン ドリア の検出は.
(5) 血 球 ミ トコ ン ドリアの細 胞 化 学 的研 究. 位 相 差 顕 微 鏡 に よ る 以 外 は 不 可 能 で あ る.之. に反 し. ミ トコ ン ド リ ア に 特 異 な 酵 素 活 性 を 細 胞 化 学 的 に 染. 1901. ク 酸 を 基 質 と し た 場 合 に 於 け る生 体 組織 乃至 細 胞 に よ るditetrazolium塩. め る方 法 は理 論 的 に 最 も確 実 に ミ トコ ン ド リア を 検. 関 し, nito‑blue. 出 す る方 法 で あ る,. dehydrogenaseのstepに. コハ ク 酸 脱 水 素 酵 素29)はThunberg がMethylen. blauを. (1909)28). 水 素 受 容 体 と して本 酵 素活 性. 度 の 測 定 に 応 用 して 以 来,主. と してhomogenateに. 約50%共. 軛 し, neo‑tetrazoliuipはsuccinic. o xidaseに. (1934)30),. あ り(Batelli. Claude. (1941)31),. (1946)32), Schneider. und and. Hogeboom. (1950)33)等. dehydrogenaseのstepに50%,. 至C1のstep乃. 研 究 が 進 め ら れ て 来 た が 本 酵 素 は 組 織 構 造 に 強 く結. の 後 主 と し てBemley. 殆 ん ど全 てsuccinic. 共 軛 し, nitro‑neotetra. cyt. b乃. drogenaseに. 1910)29),そ. tetrazoliumは. zoliumはsuccinic. ついて細胞 内構 成 要素 と無 関係 に純生 化 学 的方 法 で. びつ い たdesmoenzymeで. 還 元 反 応 の 共 軛stepに. 約15%,. 至 そ れ よ り高 位 のstepに. cyt. b或 はc1に. 約50%の. Stern,. る こ とが 証 明 さ れ て い る12)13).即 etrazolium還. al.. に よ つ て コハ ク. ち こ の 場 合neon. 元 反 応 はsuccinoaidase. nitro‑neotetrazolium還 dehydrogenase. cyt. c. 割 に共 軛 して還 元 反 応 が 現わ れ. Hoerr et. dehy. 約35%,. system,. 元 反 応 は 主 にanccinic. system,. nitro‑blue. tetraaolium還. 酸 脱 水 素 酵 素 は ミ トコ ン ド リア に 限 局 し て 存 在 し終. 元 反 応 はsuccinic. 末 電 子 伝 達 系 の 一 つ と して 細 胞 の 呼 吸 に 重 要 な 役 割. で あ る12) 13).従 つ て こ れ らの 試 薬 を 用 い,コ. を果 して い る こ と がhomogenization法. に よつ て 明. ソ ー ダ を 基 質 と して 本 酵 素 乃 至 酵 素 系 の 反 応 に よ つ. の よ うな方 法 は 細胞 内 構成 要 素 の 移. て 血 球 ミ ト コ ン ド リア の 細 胞 化 学 的 検 出 と 同 時 に そ. か に さ れ た.こ. 動 を 余 儀 な くさ れ る の で,そ. の成 績 を そ の ま ま細 胞. の 形 態 と機 能 に 関 係 づ け る こ と は 危 険 で あ る.. blauを. 1935)94)そ. 用 い て 始 め ら れ た が(Semenoff,. の 主 な 発 達 はtetrazolium. に用 い ら れ たTPT. ハ ク酸. の活 性 の 強弱 を調 べ る こと に よつ て 正常 の 分 化 や成. 態 を 知 る こ と が 出 来 る. 赤 血 球 系 に 於 け る観 察 も 白 血 球 系 に 於 け る 観 察 も. group化. 物 の 組 織 化 学 へ の 導 入 に よ る もの で あ る.然. 性 に よ る反応. 熟 或 は 病 的 変 化 に 伴 う血 球 ミ トコ ン ド リ ア の 機 能 状. 一 方 コハ ク 酸 脱 水 素 酵 素 の 組 織 化 学 的 研 究 は 最 初 methylen. dehydrogenase活. 合. し最 初. (2, 3, 5‑triphenyl‑tetrazolium. 分 化 と共 に そ の 酵 素 活 性 の 性 格 が 変 化 す る よ うな こ と は な か つ た が 量 的 に は 可 成 著 明 な 変 化 を 示 し一 般 に 未 熟 な 細 胞 ほ ど酵 素 活 性 が 強 く現 わ れ る.恐. らく. chloride)35)‑39)の 還 元 生 成 物 は 粗 大 結 晶 を 作 り易 く. 細 胞 の 分 裂 に 伴 う 蛋 白 そ の 他 の 物 質 の 合 成 に 対 して. 組織 化 学 的 に満 足 す べ き 像 が 得 ら れ な い.こ. 必要 と され るエ ネル ギー 供給 の 場 と しての ミ トコン. うな 短 所 はRutenberg. and. Seligman. Seligman. et al, (1951)42)等 のblue. の 利 用,. Aatopol. (1950)44),. Sheton. neotetrazolium塩 よ るINTの. et and. のよ. (1950)41),. ド リ ア の 機 能 を 示 す も の で あ ろ う.赤. tetrazolium塩. al. (1949)43), Schneider. はHb合. Wachatein (1952)45)ら. に よ る 方 法 又Pearsonら46)等. 血球 系 細 胞 で. 成 の 進 行 と 共 に ミ トコ ン ド リア の 数 が 減 少. し又 そ の 活 性 が 低 下 して く る が 脱 核 後 の ミ ト コ ン ド の. リ ア も 著 明 な 陽 性 反 応 を 呈 す る点 か ら見 て,又. に. 時 期 に 旺 盛 なHb合. 使用 等 に よ り諸種 脱 水 素 酵素 の 組織 化. この. 成 の 起 る点 か ら 見 て そ の 活 性 が. ヘ モ グ ロ ビ ンの 合 成 に 関 係 して い る こ と は 明 か で あ. 学 的 証 明 法 が 改 善 され 従 来 の 方 法 に 於 け る 多 くの 欠. る.即. 点 が 除 か れ た.然. 胞 に 与 え られ る エ ネ ル ギ ー は 主 と し て 分 裂 の た め に. し そ れ らの 多 くは 組 織 化 学 的 観 察. の た め で あ つ て 反 応 が ミ トコ ン ド リ ア に 限 局 す る か ど うか を 知 る た め に は 反 応 は 未 だ 粗 大 に 過 ぎ る . 著 者 は小 田 の 援 助 を 得 て 上 記 の 如 くditetrazolium. ち 未 分 化 状 態 で は ミ トコ ン ド リア に よ つ て 細. 又 分 化 の 段 階 で は そ れ はHbの と は 明 か で あ る.然 ATPの. 合 成 に 向 け られ る こ. し産 生 さ れ る エ ネ ル ギ ー は 常 に. 形 で蓄 え られ るとす れば 酵 素 の種 類 の 変化. 塩 を用 い て の コハ ク酸 脱 水 素 酵 素 反 応 を 改 良 して 之. を 必 要 と す る こ と な く,そ の 量 的 増 減 に よ つ て そ の. が は つ き り血 球 の ミ トコ ン ド リア に 一 致 して 出 現 す. 必 要 量 が 調 節 さ れ る も の と考 え て よ い で あ ろ う.白. る こ とを 光 学 顕 微 鏡 的 に ほ ぼ 確 実 に し 得 た .血. 血 球 系 に 於 て も 分 化 と 共 に 数 と反 応 の 強 度 を 減 じ る. 球の. コハ ク酸 脱 水 素 酵 素 に 関 す る研 究 報 告 は 極 め て 少 な くWachstein. et al.(1950)44)そ. が あ るが12)13),ミ. の他 の 簡単 な 記 載. トコ ン ド リ ア と の 関 係 に 於 て 詳 述. が 赤 血 球 の 場 合 と 異 り,最 性 は 認 あ ら れ る,赤 Hbを. 後 の 分 化 段 階 まで そ の活. 血球 の 場 合 は 成熟 す う と完全 な. も つ 袋 と化 し そ の エ ネ ル ギ ー 代 謝 は 解 糖 系 の. して い る もの は な か つ た .之 等 は 著 者 が 小 田.等 と. 酵 素 に よつ て 与 え られ て い るが 白血球 の 場 合 は その. 報 告 し た 如 く 電 顕 的 に も証 明 せ ら れ る13).又. 高 度 の 運 動 の た め の エ ネ ル ギ ー補 給 の た めの 支 え に. コハ.
(6) 1902. 酒. 井. ミ トコン ドリア が活 動 して い るの で あ ろ う.即 ち分. 晃. で あ る. 1). 化 に伴 う細胞 内 の エ ネル ギ ー代 謝 は その 方 向 に 於 て 変 換 を 起 す が‑細 胞 蛋 白合 成 へ の方 向 か ら特 殊物 質 の 合 成 又 は運 動 の方 向 へ‑ミ. 本 酵 素反 応 は 血 球の ミ トコン ドリアに一致 し. て特 異 的 に 出現 す る. 2). トコ ン ドリアか ら与 え. 三 種ditetrazolium塩. に よ る本 酵素系反応の. られ るエ ネル ギー は その 必 要 に応 じて 量 的 に 調製 さ. 条 件 と方 法 を吟 味 し,血 球 ミ トコン ドリアの細胞化. れ 質 的 な変 化 は ない とい う こと であ る.. 学 的検 出 に適 した条 件 と方 法 を定 め た. 3). 結. 論. 本 酵 素 の 細胞 化 学 的反 応 は成 熟赤血 球を除 く. 全 血 球 に 陽性 に 出現 す る.各 種 血 球 に於て は本酵素. 従来 の 血 液学 分野 に於 て 血球 ミ トコ ン ドリアの染 色法 と して広 く利 用 され てい るJanus緑. 染 色法 は. 反 応 は成 熟分 化 に 伴 つ て酵 素活 性 の 程度 と陽性顆粒 の 数 を減 少 す る. 4). 全 て の ミ トコン ドリア を正 確 に 検 出す る事 が 出来 な いの で細 胞化 学 的 に ミ トコン ド リア にの み 存 在す る. 網 赤 血 球 ミ トコン ド リアを本 酵 素反応 によつ. て特 異 的 に細 胞化 学 的 に検 出 した. 5). 酵 素 系(呼 吸 酵 素 就 中 コハ ク酸 脱水 素 系)の 反 応 を. 本 酵 素 反 応 は血 球 ミ トコ ン ドリアの 検出 と同. 利 用 して ミ トコ ン ドリアを特 異 的 に 検 出 す るこ とを. 時 に 各種 血球 の形 態 と機 能 の相 関性 を知 る上 に於て. 企 図 し従 来 の 方法 を改 善 し吟味 して ミ トコ ン ドリア. 極 あて 貴 重 な利 用 価値 を有 す る.. に ほぼ確 実 に 現 わ れ る呈 色反 応 を考 案 した.こ の 方 法 を利 用 して血 球 の種 類 と分 化 成熟 に伴 う形 態 と機 能 との 相 関性 を追 究 した.酵 素 反応 は コハ ク酸 を基 質 と し,水 素 受 容 体 と してneotetrazolium塩 最 近合 成 され たnitroneotetrazolium塩 blue tetrazolium塩. の他,. 擱 筆 す るに 当 り終始 御 懇 篤 な る御指導 と御校閲を 賜 つ た 恩 師 妹尾 左 知 丸教 授 並 に小 田琢 三助教授に深 甚 な る感 謝 の 意 を表 し ます.. 及 びnitro. を 用い た.そ の 結 果 は 次 の 如 く. 文 1) Chevremont, 30,. 175,. S., et Federic,. Rendusi. de l'. et Frederic,. Asociation. J.:. Comptes. des Anatomistes. 145,. 1245,. et. la Societe 5) Federic,. Federic,. J.:. Comptes. de la SocietB de Biologie. rendus 51,. Comptes. des Anatomistes. 50,. 島 倉 亭 次 郎:細. des. 185,. seances. de. ational. 15). Nachlas,. rendus de l' Association. K.:. Makino,. S.:. 9). Michaelis,. 1, 1953.. Proceedings. •` 575,. of. Symposium 8,. Arch.. the. 126,. Chromosoma L.:. 201,. mikro.. 212, Anat.. 55,. 558. R.:. ihre. Beziehungen. Co.,. 145,. 1890.. et. al.:. Elemental-Organismen und zu. den. Zellen,. 153. Med.. 1958;. B.:. J.. Okayama 13,. Histochem.. 12,. 31•`44,. 193. 1959.. Cytochem.. 6,. 1958. M. C.. M.,. S.,. Tsou,. and. K.. C.,. Seligman,. Cytochem.. 5,. Souza, A.. E.. M.:. 420•`436,. De,. J.. His. 1957.. 山 医 学 会 雑 誌,. 70, 123〜125,. 1958. 妹 尾 左 知 丸 ・吉 沢 浩 洋 ・中 本 孝 ・小 河 博 之 ・羽. 18). Seno,. 19). Brunner,. 20) Leipzig,. Acts,. 205•`215,. S,. Veit. et. al.:. A.. Exper. Die. 11,. 本 血 液 学 雑 誌, 20, 31〜. 318,1957.. 1956.. 1956.. Tech.. 胞 化 学 シ ン ポ ジ ウ ム, 8, 157〜172,. 場 喬 一 ・小 田 琢 三:日. Intern. 229,. Stain. 小 田 琢 三 ・関 周 司 ・柴 田 高 志 ・酒 井 晃 ・岡 崎博 明:岡. 1899.. Altmann,. T.. tochem.. 16). C.:. 1958.. Cheng,. 胞 化 学 シ ン ポ ジ ウ ム, 5,. Genetics. 8). 10). Pearson,. .17). Shimakura,. Oda.. 14). 1957.. 1956. 7). 小 田 琢 三:細. 112•`121,. Comptes. de Biologie J.:. D.. 1936.. •` 204,. 1951.. J,:. Hetherington,. 173〜189, 13). M.. des seances. 4) Federic,. 12). 38,. 1951.. rendus. 11). •` 154,. S.,. 3) Chevremont,. 6). Acts, Anat.. 1957.. 2) Chevremont,. 19,. J... 献. Cell. Brunner,. JR. Res.. A.. Experimentia, 21). Seno,. S.:. Acta.. 10,. JR. 12,. Acta.. and. and 255, Path.. Haemat.. 21,. Vallejo-Freire, 55•`62,. 1958. A.:. 1956.. Vallejo-Freire,. A.:. 1956. Jap.. T,. Suppl.. 741,.
(7) 血 球 ミ トコン ド リアの 細 胞化 学 的研 究. 1957. 22). 305•`309,. Seno,. S.:. 351, 23). Acta.. Haem.. Jap.. d.. Physiol.. 21. (2),. 35). Suppl.,. 1958.. Benda,. Verh.. Gee.. 36). 1899,. 376•`383. 24). E.. Chicago. Press,. Kinsburg,. 26). Lazarow,. A.. 99,. Seno,. F.. 34). 37). Rec.. Cooperstein, 1,. 6,. 39•`52,. 1912.. S. J.:. 234•`241,. J.. 38). His. 1953;. 39). 1950. K.,. and. Maki,. T., 21,. and. Nakamoto,. 332•`336,. Arch.. Stern,. R.. R.. and. Clande,. 40). 1958.. Physiol.. L.:. Cold. Hogeboom, D.:. Hoerr,. G. J.. Schneider,. 41). 22,. Biochem.. 11,. 10,. 969•`975,. N.. Spring. Z.. 30,. 42). L... Anat.. Rec.. H.,. Harber. Symp.. F.. A.,. Chem.. C.,. and. 165,. and. E... J.. 1946.. G. H.: Nat.. Kun. and. f.. Seligman,. 明 に 現 れ て い る.腹. eosinで. 図. W.,. Glaubach,. Trans.. New. Pearson,. Seligman, 1950.. A. M.:. S.. York. M.:. Proc.. 306•`308,. 46). and. Science,. and. Acad.. Goldman,. Sci.,. 112,. 156•`. 1949.. Wachstein,. Schelton,. R., 113•`121,. 1951.. Soc.. Exper.. Biol.. Med.. 1950. E.. 61•`82,. and. Schneider,. W.:. Anat.. Rec.. 1952. B.. and 2,. 説. Defendi,. V.:. 248•`257,. J.. Histochem.. 1954.. 明 は マ ウ スの 骨髄 細 胞. は ウ サ ギの 生 の 骨髄 小 組 織 片 を 反 4図 は ウ サ ギ の 末 梢 血 をpolyvinyl は 後 染 色 せ ず 第4図. は. 弱 く後 染 色 し た も の で あ る . を 用 い て 反 応 させ た も の で あ る.第5, の 中 央2ケ. の 好 中 球 と 単 球 を 拡 大 した も の で あ る.酔. 6図 は ラ ッ トの 吉 田. は 好 中球 と単 球 他 は 吉 田 肉 腫. 素 反 応 は ミ 卜コ ン ド リ ア に 一 致 し て 鮮. 水 或 は 滲 出 液 中 の 活 発 に 運 動 す る 白 血 球 に は 一 般 に 活 性 の亢 進 が 見 ら れ る.第7, て 反 応 及 び 小 組 織 片 で 反 応 後 塗 抹(第8図)し. は ラ ッ トの 骨 髄 小 組 織 片 を 反 応 さ せ 塗 抹 后hematoxylin‑eosinで. はneotetrazolium塩. 軽 く後 染 色 し た もの で. に よ る 反 応 で あ る.第10〜11図. は マ ウスの 骨 髄 の 小 組織 片 を 反応 さ は 手 術 的 に 摘 出 され た 人の リ. ン パ腺 の 小 組 織 片 を 反 応 后 ス タ ン プ し メ タ ノー ル で 瞬 間 的 に 固 定 后hematoxylin‑eosinで も の で あ る. は 本 文 中 に 記 載 し た.. た もの で. は 成 熟 赤 血 球 で 反 応 顆 粒 が な い.. せ ス タ ン プ して 後 染 色 し な い 標 本 で 第11図 は 巨 核 球 の 反 応 で あ る.第12図. 第13〜17図. 109,. 144•`146,. Rutenburg,. を 用 い て 反 応 さ せ た も の で あ る.第1図. 左 は網 赤 血 球 の ミ トコ ン ド リ ア に 於 け る 反 応,右 第10〜12図. Woch.. 207,. 109,. 10,. and. 317•`320,. 弱 く後 染 色 し た もの で あ る.第3,. 8図 は マ ウ スの 骨 髄 の 血 球 を 塗 抹(第7図)し あ る.第9図. Straus,. 22,. はnitra‑neotetrazolium塩. は 第5図. 299,. Klin.. Path.,. Gofstein,. Res.. A. M.. Antopol,. 肉 腫腹 水 を 細 胞 浮 游 液 で 反 応 后 塗 抹 後 染 色 し な い 標 本 で 第5図 細 胞 で 第6図. and. E.:. Science,. 加 え て 遠 沈 し て 集 め た 白 血 球 を 塗 抹 し 反 応 せ し め た も の で 第3図. 第5〜9図. D.. V.. exper.. Abood. Cancer. を 浮 游 液 で 反 応 させ 塗 抹 后 後 染 色 し な い 好 中 球 の 標 本 で あ る,第2図. eosinで. 60,. 1948.. Liittichau,. A. M.,. M.:. 112,. Inst.. Zellforsch.. はnitro‑bluetetrazolium塩. hematogylin. N.. 113,. Arch.. Rutenburg,. 45). Cancer.. Cancer. 附. alcoholを. Ges.,. 1949. V.:. Cytochem. Zcitschr.. 応 后 塗 抹 しhematoaylin. bot.. Cheronis,. uud. 734,. Becker,. 73,. 1950. W.. chem.. 1941. dent.. 108,. W.. 160,. Hotchkiss,. 615•`629,. Hogeboom,. 1950.. H.,. Science.. Doerr,. Quart. 44). Claude,. 1•`22,. 第1〜4図. 43). 1941.. Biol. W.. Res.. Semenoff,. Straus,. L.:. 263•`270,. deut.. 1949.. 1934.. A.: 9,. 949, Ber.. Ber.. 1942.. 113,. 449•`455,. 941,. D.:. 1949.. Jap. Skand.. Jerchel,. G.:. 27,. Biol.. u.. 77,. E.:. 1910.. Biol.. 33). R.. Lakon,. A.. Bensley,. R.. and. T.:. Batelli,. 60,. 32). Univ.. 1909.. 172,. 31). Anat.. Haem.. Thunberg, 430,. 30). F... Haba,. Acta.. Cytology. 1924.. 321•`322,. S.,. T.:. 29). General Chicago,. Cytochem.. Bull.. 28). V.:. B.. tochem.. 27). Kuhn,. 434,. Cowary,. 25). 1935.. Ges.. C.:. 1903. 後 染 色 した.
(8) 1904. 酒. Cytochemical Part. Studies 1.. 井. on the. Cytochemical. Dehydrogenase. 晃. Mitochondria. of Blood. Study. Succinic. System. on the. of Blood. Cells. Cells. By Akira. SAKAI. Department of Pathology, Okayama University Medical School, Okayama, Japan (Director: Prof. Satimaru SENO) In the field of hematology the supravital staining by Janus green has been used extensi. vely for counting of the number of mitochondria of leucocytes. But it has been clarified that all the mitochondria can not be stained by this method. With the purpose to establish a method to stain all mitochondria the author has scrutinized the histochemical method for the respiratory system, especially the succinic dehydrogenase system, lodaliiing solely in mitochondria and devised the color reaction to appear coinciding fairly exactly at the site of mitochondria improving the past method. For the enzyme reactions sodium succinate was used as the substrate and neotetrazolium chloride, nitro-neotetrazolium chloride or nitiro-blue tetrazolium chloride as the hyrogen acceptor. In this paper by the applicatiou of this method the author stuied the correlation between the site and intensity of the reaction in each cell species with reference to the differentiation and maturation. The results are as follows: 1. The cytochemical reaction of this enzyme appears positive in all blood cells with exception of mature erythrocytes. This enzyme reaction decreases its intensity along with the maturation and differentiation of cells.2 . The enzyme reaction appears specifically coinciding with the site of mitochondria in cells including reticulocytes. 3. This enzyme teaction is extremely useful for counting the nnumber of mitochondria in blood cells as well as for ascertaining their enzymatic activity..
(9) 血 球 ミ トコ ン ド リア の細 胞 化 学 的研 究 酒. 井. 論. 文. 附. 図. 1905.
(10) 1906. 酒. 酒. 井. 井. 論. 晃. 文. 附. 図.
(11) 血 球 ミ トコン ド リア の細 胞 化学 的研 究 酒. 井. 論. 文. 附. 図. 1907.
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