長崎大学教育学部自然科学研究報告第27号243‑259 (1976) 243
Corn SeedからHemicellulase活性を有する細菌 の集積培養について
大宮満男・今里祥子・小川サチヨ・深掘知子
長崎大学教育学部家政科教室
Accumulating Culture of C S H Hydrolytic
Bacteria from Corn Seed
Mitsuo OOMIYA, Shoko IMAZATO, Sachiyo OGAWA, Tomoko FUKAHORI Department of Home Economics, Faculty of Education
Nagasaki University, Nagasaki
Abstract
The bacterium which produces hemicellulase‑the hydrolytic enzyme of corn seed hemicellulose‑had been isolated before in this laboratory.
Enrichment culture, which 2g corn seed, as seed and nutritional source, was added to 0.1M phosphate buffer pH8 10ml, incubated at 37℃, and adjusted the pH to
in every day.
The results showed non variations in pH and that viable cell count was approximately stable, and that after 98 days' Xylosazone was purified.
緒言
植物性食品は,保存しておくと,まずくなる。このひとつの原因としてhemicelluloseが分 解することが考えられるO著者らは,トウモロコシ種子を材料として,一連の研究を続けてい る。 Hemicellulose (CSH)を調製し(1)これを基質とする粗酵素hemicellulaseを得(2)こ の活性を有する菌分離(2)を行った。
今回は,この菌分離について再検討したので報告する。
実験方法
1.材料トウモロコシ種子
阿蘇産(昭和48年度)早玉種50K?より適宜使用した。
*長崎女子短期大学Nagasaki Women's Junior College, Nagasaki
244 大宮満男・今里祥子・小川サチョ＊・深堀知子 博
2．集積培養 a．pH調整
3………グリシンーHC1緩衝液
4，5………酢酸
〃
6，7，8…リン酸 〃
9，10………ホウ酸＋KCl−EC1緩衝液 pH試験器で調整した。 （東洋科学産業K．K．）
b．無菌水集積培養（3）
70％アルコールで表面のカビを除き，荒砕きしたトウモロコシ種子29を0．1M各pH無菌 水10祀に加え試験管中で培養し，初期よく振盈し，37℃で培養した。
この集菌液について，pH，生菌数，活性（3），フロ匂グルシン反応（4），還元糖を測定した。
5．測定法 a．pH測定
東洋汐紙製pH試験紙 b．生菌数測定 平面培養法による。
培養液1認を採り，pH7．4の無菌水で希釈し，10祀の基本培地（2）に寒天沫2彩を加えた 溶液に移し，再び37℃で2日間培養ののち，発生した集落を数え，生菌数とした。
c．還元糖測定
培養液1認を採りSomogyi−Nelson法（5）により定量し，キシロース当量で表現した。
4．酸の分離（6）
ぺ一パークロマトグラフィーによった。
試 料：集菌培養13日後の培養液を水蒸気蒸留し，揮発部と不揮発部に分けた。
沖紙：東洋汐紙No．50 方法：上昇法『
展 開：揮発部……1．5Nアンモニア飽和ブタノール
不揮発部…n一ブタノール：蟻酸：水（v／v）＝4：1．5：「1に混合した上層部 発 色：揮発部……ブロムフェノールブルー（50解／100認＋200η9クエン酸）
不揮発部…ブロムフェノールブルーのアルコール溶液で発色 5．CSHの分子量測定
セファロース4Bによるゲル汐過 カラム：2．64×45．0㎝
流 速：20祀／hr．
分 析：全糖量測定（フェノール硫酸法（8））
分画：5認
デキストランT500及びブルーデキストラン2000より検量線を求めた。
実験結果
1．分解菌の性質
第1表に菌学的性質を示した。グラム陽性の短桿で，炭素源として特にC SHを好む通性嫌 気性の菌である。
Corn Seed > Hemicellulase ' ; : I icD { t " iC1)V *C Table 1.
Bacteriological Property245
Form
Growth Culture
Physiology
Form Length
Motility
Gram Stainability Yeast Extract Glucose Galactose Xylose Arabinose
Hemicellulose(Corn Seed) Stab Culture
Gelatin Stab Acid Production
Gass Production (O‑F test) Voges‑Proskauer Test Starch Hydrolyzed Methylene Blue Reaction Indole not produced.
Hydrogen sulfide not produced.
Growth in a pH range of 6.0 to Catalase temperature 14‑37 C
l0.0
Small rods
2 . 0‑10 . Oll
with
+
rounded ends
Surface growth
+ + + + +
Pa pilate
Surface and Craterif orm
inner
‑ Oxidation
type)
++
2. pH 6) :fb
l < pcl) iCJ ; pH ) ; 4 } . 7 cD : ; . a. ;PH ) '‑' l '‑'‑‑･ U. ! C CI :U A*
Table 2. Variations in pH (allowed to stand) Starting pH
Corn Seed (g) Incubation time (days)
1 2 3 4 5
6
1
6.0 6.0 5.4 4.8 4.6
2
6.0 5.4 4.8 5.0 4.6
8
1
7.6 7.0 6.8 6.4 6.4
2
7.6 7,0 6.8 6.4 6.4
Demolded, coarse crushed cornwas cultured in a test tube with water. The pH test of medium everyday with pH test paper(TOyo)
tables)
seed was used. It 0.1M pasteurized was performed in (Ditto in other
246 大宮満男・今里祥子・小川サチヨ＊・深堀知子
第2表に示した通りで5日目まで低下している。b．1，pH低下のものについて毎日，始発pH：に調整したもの
『able5． Variations in pH（Adjuste（1）
Starting pH：
Incubation time（days）
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
7
7．0 6．4 6．4 6．4 6．4 6．4 6．6 6．6−6．8
6．8−7．0 6。8−7．0
8
7。O−7．2 7．6
7．6−7．8 7．6−7．8 7．8−8。0 8．0 7．8−8．0 7．8 8．0 8．0
9
8．2 8．2 9．2 8．2 8．2 8．4 8．6 8．4−8．8
8．4 8．6
10
8，6 8。4
8．6 9．2 9．0 9．4 9．0 8．8−9．2
8．4−9．0 9．2−10．0
8＊
6．7−7．2 7．2−8．0
7．2 6．8−7．2 6．8−7．2 6．8 6．8 6．8 6．8 6．8 The pH of medium was adjusted to the start respectively with the suitable buffer
solution（pH7−8phosphate，pH9−10boric acid十KCレNaOH）．In the experiment of pH8＊the pH was adjusted with following the way that deionized water by NaOH．
第3表に示した通りで，7日目以後ほぼ安定してきた。しかし，無イオン水をNaOHで 調整したものは，この様な事がみられずpHの低下が大きかった。
2．液量が少ないものについて，無イオン水で揃えた場合
Table4． Variations in pH（Adjusted）
Deionized water．
Starting pH
Incubation time（（1ays）
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
6
5．4 6．2 5．4 6．0 5．8
6．8 6．8 6．8 6．8
7
6．4 6．8 7．4 7．0 6．2
6．4 7．0 6．8 7．0
8
6．6 7。6 7．4 7．6 7．8
8．0 8。0 8．0 8．0
9
9．0 9．0 9．6 8．8 9．0
9．0
，9．0 9．0 9．0
10
10．0 10．0
9．6
10。0
10．0
10．0
10．0
10．0
10．0
It was made good the deficiency of medium with deionized water．
Com SeedからHemicellulase活性を有する細菌め集積培養について
247
第4表に示した通りで，5日目以後安定してきた。3．液量が少ないものについて緩衝液で揃えた場合
Table5． Variations in pH：（adjusted）
Buffer．
Starting pH Incubation time（days）
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
6
5．8 6．0 6．0
6．0 5。8 6．0 6．0 5．8 6．0
7
6．6 6．8 7．0
7．0 6．6 7．0 7』0 6．0 7．0
8
6．8 8．0 8．0
8。0 7．8 7．6 8．0 7．8 7．6
9
8．4 9．0 9．0
9．0 9．0 9．0 9．0 9．0 9．O
10
8．8
10．0 10．0 10．0 10．0 10．0
9．8
10．0 10．O It was made good the defiency of medium with buffer solution．
第5表に示した通りで，2日目以後安定している。
集積培養液は，自然のまま放置した場合，培養日数の経過とともにpHは低下するが，始発 pHに調整した場合は，6〜10日目でpH：の低下はなく，また無イオン水で，液量を揃えた場 合は5日ぐらいで，緩衝液で揃えた場合は，2日ぐらいで，ほとんど変化はなく，安定してき た。毎日pHを調整する場合，無イオン水をNaOHで調整するより，始発から緩衝液を用いた 方が，pH：の大きな低下がなく，集菌には適している。
5．生菌数
条件の相違による生菌数は次のとうりである。
a．始発pHのみ調整し，自然に放置した場合 1．培養2日目の生菌数 （第6表次頁）
第6表に示した通りで，始発pH6以下では，菌の分離はみられなかった。
2．振盤による生菌数の違い （第7表次頁）
第7表に示した通りで，振邊の効果がみられた。
3．始発pH6とpH8の場合 （第8表次頁）
第8表に示した通りで，しだいに菌数が低下している。
b．毎日始発pHに調整した場合 1．p｝18の場合（第9表次頁）
第9表に示した通りで，菌数の低下はみられない。
2．pH：6〜10の場合（第10表次頁） （第11表次頁）
第10，11表に実験例を示した。
始発pHのみ調整し，のち自然に放置した場合は，菌数がしだいに低下しているが，毎目，
2 48
; ‑: f A : i /J¥)Ilit s*. n Table 6. Viable Cell Count(104/mD Exam ple
Starting pH
3 4 6 7 8 9
l O
1
O O O O 836 220 O 1190
2
O O O O
1 39
1670 145 25
3
o O o O 776 480 2900 390
4
O O O O 176 70 O 434
5
O O O O 81 680 O 3600
6
o o o o 39 20 o 8
7
O O O O O 470 5 51
8
o O O O 6 340 48 o
9
O O O O 150 654 136
1 04 10
O O O O 2076 6840 27 4166
pH 3 pH 4‑5 pH 6 After 2
Table 7.
Glycine‑HCI buffer sol.
Acetate ･l : Phosphate 'l
days' culture.
Difference of.̲jViable Cell Count by
Shaking (10*/mDEvery
3 hr.
Every
2 hr.
30 sec.
Shaking
1590 1 830
260 40 1190
No shaking
670 620
1 40
10 10
That was cultured at pH 8.' shaking was performed by hand.
Table 8. Viable cell count (allowed to stand)
(104/ml) Starting pH
Corn Seed (g) Incubation
ti me
1 2 3 4 5
(days)
6
1
1 , 132
336 8,570 94 32
2
7 , 142 5 90 60
l 54
8
1
l I , 380 3 , 520 2 , 200
880
2
8 , 240
300
6 , 840 1 , 490
By the dilution plate culture , method. One ml ･of medium was used ; after diluting with pasteurized water (pH 7.4), then poured to the basal medium with 2 agar‑agar, cultured again, after 2 days colonies appeared was counted.
(Ditto in other. tables)
Corn
Seed ･ Hemicellulase 'I ; : ; l ia) iC 1) V C
Table 9. Viable Cell Count (Starting pH 8)(lO'/ml)
249
Example
Incubation time
2 3 4 5 6 7 8
(days)
1
80
4 , 090
3 , 720 1 , 680
3,810 770
1 , 430
2
20
4 , 540 6 , 270 2 , 250 4 , 180
880 10,620
4 , 740
3
150
9 , 020 10 , 040 1 6 , 730 l 3,300 4 , 870 1 1 , 520
13,350
4
8 , 880 4 , 190 2 , 825
Table 10.
Viable Cell Count (pH 6‑10)Example I . (10*/ml)
Starting pH Incubation time
l 2 3 4 5 6 7 8 9 10
(days)
6
240 1 ,810 3 , 020
76 429 48 181 1 75 2 , 220
7
4 , 250
200 370 81 426 60
27478 171
8
200 270 50 520 320
l , 730
510
1 , 240
227
9
350 220 O O 81
56 12 18 83
10
70
1 OO
250 42 22 4 2,014 71 38 Table 11.
Viable Cell Count (pH6‑10)Example 2 .
(10*/ml)Starting pH Incubation time
2 3 4 5 6 7 8 9 10
(days)
6
1 , 116 1 , 168 3
6 8 O 51 223 214
7
961 363 59 7 184 O 42 260 103
8
3,218 303
1 , 730
998 468 841 702
2 , 454 l , 536
9
1 2 , 570 3 , 488
2 781
2 , 165
290
1 , 085 2 , 632
10
8 8 454 568
1 , 394 1 , 487
349 27 283
i pH C l U A*i 2 A , i Ci C l } ; i U 5' , pH8 j I J;V . t‑*, 6 F : ; : fl IOmglC UC I g :2 : C1) *C Ut ･ cD ;=‑̲'
t ‑ t*‑ ), : f i . C L
=
i 2 g UC i )t*･･.250
4. ; t Ea.
( ; t E)
"^ pH 8 ) ilC J ; i bCD l
40
‑ o
o o
'H
X4J
l] ,
, J o
,o
f.
o
Fig. 1.
/ ‑ e ' x ,c
Decrease in Viscosity (Starting pH 5
Shakin No shakin'
8) If liC;T;Uf i i iU > t > : >./ .
b. ‑ ? i pH iC 1 U ‑ "=A ) L;
Table 12.
Decrease in ViscosityExample I .
:
Starting pH Incubation time (days)
2 3 4 5 6 7 8 9 10
6
41.7
63 . 5 48 . 4 47 . 2 38 . 7
33 . 8 42 . 2 42 . 2 39 . 8
7
28 . O 45 . 7 38 . 6 43 . 7 46 . o
34 . 5 33 . O 33 . 9 43 . 4
8
40 . 8
61.8
46 . O 58 . 5 47 . 1
46 . 3
51.2
47 . 1 44 . 4
9
26 . O
18.8
20 . 4 26 . 9
0.0 13.9
29 . O
21.5
10
31 . 5
18.4
26 . 4 25 . 9 20 . 9
4.9
22 . 7
13.9 14.4
Enzyme activity assay.One ml of enzyme solution (cultured medium) at 37 C was added to 10ml of substrate in an Ostwald viscosimeter (0.2 CSH, buffered with M/10 phosphate, pH 5.7) ; and then was reacted for 30 minutes in a thermostat. After reacting the time (t2) of fall down of liquid was measured at 37 C in a constant temperature water bath. The time (to) of buffer only and the time (tl) Qf buffer with substr te were also measured in the same way.
Enzyme activity ( ) was calculated at the following expression : ti‑t2
tl ‑to X 100
Com SeedからHemicellulase活性を有する細菌の集積培養について
251 Table15． Decrease in Viscosity
Example2．
彩
Starting pH
Incubation time（days）
1 2 3 4 5 6 7 8 9
6
51。0 31．6
32．5 32．5 36．5 23．0 24．6
7
56．O
46．1 38．1 32．9 32．5 32．0
8
40．0 26．8
34．9 28．7 35．1 36．9 23．3
9
25．0 27．9
23．0 30．0 26．3 25．8 11．9
10
27．0 11。2
18．5 19．8 26．8 18．6 20．6
第12，13表に実験例を示した。pH6，7，8は，ほぼ同じくらいの活性を示すが，
ぐらいでも低下はみられなかった。
比較的8が高く，また培養目数10日
5．糖の分解状況 a C S Hの分子量
パ
bO
）
の
＞
120100 95
80
60
●
O
Dextra買丁500
ComSeed Hemicellulose
Blue Dextra丘 2000
105 5x1057．3x1052x106 Molecular Weight
Fig．2． Molecular Weight of Com Seed Hemicellulose
Molecular weight was estimated by Andrew s gel filtration．
Blue−dextran2000（M．W．2，000，000）and Dextran T500（M．
used．for the standard materials．
Ve：Elution weight（g）．
In this extriment，
W．500，000）wer6
252 大宮満男・今里祥子・小川サチョ＊・深堀知子
第2図に示した通り73万前後であった。b。トウモロコシ種子HemiceIluloseの主要構成糖である，キシロース，アラビノースの低 次元，縮合物の存在が考えられる。これを確認するため，培養液の溶解部分を採取して，
フロログルシン反応，及び還元糖量を測定した。
・第14，15表にフロログルシン反応を調べた実験例を示した。また第16表は還元糖量を示した。
Table14．Phloroglucinol Test（Example1．）
Starting pH
Incubation time（days）
1
2 ．
3 4 5 6 7 8 910
Blank
6
昇 十 柵 十
±
十
± 十 士
十
7
十 十 帯
十卜
±
十 千
± 十
十ト
8
十
モ 柵
±
±
十 十 十 十
十
9
冊 冊 柵
十
十
升 卦 十 卦
10
冊 柵 帯 冊
十
普
十
甘
十
升 For the testing of pentose，the sample was purchased from the soluted part of
medium．Table15．Phloro91ucinol Test（Example2．）
StStarting PH
Incubation time（days）
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
6
十 十 十
骨
十 十
± 十
±
7
十 十
朴 普 卦
十 十 丑
十
8
土 十 十
十 十 十 9 十 十 十
9
砦
±
±
十 十 十 十 十
10
砦 卦
十
十
±
±
± 十 十
TabIe16． Reducing Sugar
（Xyloseμ9／m1）
Starting pH
Incubation time（days）
1 2 3 4 5 6 7 8 9
10
6
351．0 159．4 283．4
289．8 170．7 85．3 80．5 52，5 45，1
7
563．5 164．2 241．5
431．5 280．1 164．2 70．8 125．6 108．5
8
241．5 45．1 85。7 225．4
74．1 70．8 151。9
43．1 51．2
9
479．8 72．5 83．7 74．1 53．1 53．1 41．8 37．0 44．1
10
499．1 252．8 161．0
80．5 68．9 62．8
52．5・
48．3
48．3
The amount of reducing sugar was興deterfnined by Somogyi−Nelso血ys method and
represente（1as re（1ucing sugars equivalent to xylose．
Corn Seed > Hemicellulase if : : ; l j ) { ; j }C1)V+C 253
6. ; a)b}Volat j le
Sample
X
acid
Acetic
X
acid LacticX
acidNon‑volatile acid
X
0.85 ̲.̲,O 84
Succini
X
X O . 14
OXO ' 02 cacid Sample Flg. 3. Paper Chromatograph of Organic Acid.
Paperchromatography was carried out by the ascending method using Toyo Roshi No. 50 as the paper and I . 5 N ammonia saturated butanol as the solvent for the volatile part of the acid, the upper part of a mixture of n‑butanol : formic acid : water (4:1.5:1 V/V) as it for the unvolatile part. Detection of spots was made by spraying bromophenol blue solution (50m /100n,e+200m citric acid) for the former and bromophenol blue alcoholic solution for the latter, on the sample.
254 大宮満男・今里祥子・小川サチヨ＊・深堀知子
酢酸とコハク酸が検出された。7．トウモロコシ種子細胞膜溶解実験
a．始発pH8を保つよう毎日調整し，pH：の変動がなくなり，菌数がほぼ最高に達したと考 えられた8日目に，1本は対照として80℃，5分間加熱処理し，1本は試料としてpH：6に 調整した。処理後10日に1度の割合で振盗し，培養を続けた。その結果，96日目の状態を第 4図に示す。
Fig．4． After96days cultured．
Com seed cell membrane degradation experiment．For the development of the results obtaine（1until now，two samples was culture（1for8days and within the culturing the pH of the medium was adjuste（1to pH8and as it may be that the
counts of bacterium reached to maximum and then one of them treated to heat at80℃
for5minutes for the blank．Another one was cultured as before but the pH of mediume was depressed to6（near the optimum pH：of the CSH hemicellulase pH5．7）．In the
mean while the vibration of a sample was added once per ten days．Photographrepresents the apPearance after96days．
Right，sample；1eft，blank．
また，両者の糖量，フロログルシン反応の結果を第17表に示した。
Table17． After96days cultured，Reducing sugar and Phloro91ucinol test
Sample Blank
Reducing sugar（xyloseμg／m1）
4，830．0
627．9
Phloroglucinol test 冊
±
Com SeedからH：emIcellulase活性を有する細菌の集積培養について
255
b 98日目の試験培地2祀ずつを採取し，キシロサゾン生成（9）を行った。その結果，試料 に生成可能であった。
性質
色 ：黄色
形：針状結晶（第5図に示す）
融点測定：160℃ 黒化
183℃ 溶融
Fig．5， Xylosazone
考 察
1． トウモロコシ種子よりHemicellulase活性を有する細菌の集積培養におけるpHの影響は 大きく，活性の立場から，実験条件のもとでは，始発pH6〜8が適当であり，pHの変動の 小さい方が菌数は揃っていた。各pH間の生菌数については，5彩危険率で有意差検定の結 果，差のない事が分った。また，活性では，pH6〜8とpH9〜10との間で有意差が認めら
れた。
2．集積培養液及び，細胞膜溶解実験より，Hemicellulaseの作用は大であることが明らかに
なった。
3． C S Hの分子量は，セファロース4Bによるゲル汐過により73万前後であった。
総 括
これまでどうり， トウモロコシ種子よりHemicellulase活性を有する菌を分離するには，
0．1Mリン酸緩衝液，pH8を10泥試験管にとり，種源，栄養源としてトウモロコシ種子29の みを入れ，恒温に保ち，その初期よく振邊し，37℃で培養し，始発pHに調整することにより，
安定した菌の分離が可能となった。
256 大宮満男・今里祥子・小川サチョ＊・深堀知子
また，Hemicelluloseひいては，，種子を安全に保存するには，種子を酸性にすべきだと考え
ている。
本研究の分子量測定実験には，卒論学生，安藤順子，森田久子の諸嬢が協力した。記して感
謝する。
参 考 文献
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