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論文審査の結果の要旨
氏名：本 間 悠 里
博士の専攻分野の名称：博士（理学）
論文題名： Identification and functional analysis of a phosphatase gene, PTPMT1, expressed highly in corpora allata of Bombyx mori
（カイコガアラタ体で高発現する脱リン酸化酵素遺伝子PTPMT1の同定と機能解析）
審査委員：（主 査）日本大学教授 澤 田 博 司
（副 査）日本大学准教授 外 川 徹
（副 査）日本大学教授 間 瀬 啓 介
（副 査）京都大学教授 大 門 高 明
動物は孵化・誕生後に成長し，あるタイミングで生殖成熟を迎える。この生殖成熟のタイミングの制御 は動物の適応度に直接関わり，生存戦略において極めて重要である。昆虫は，孵化後に何回か脱皮を繰り 返して成長し，あるタイミングで変態し生殖可能な成虫になる。このような脱皮と変態は主に２つの脂溶 性ホルモン，すなわち脱皮ホルモン (エクジステロイド) と幼若ホルモン (juvenile hormone, JH) によって 制御されている。若齢の幼虫においてはJHが高濃度に維持され，エクジステロイドの刺激により幼虫から 幼虫への脱皮を繰り返す。終齢幼虫になると体液中のJH濃度が急激に減少し，その後のエクジステロイド の刺激により変態を伴う脱皮が誘導される。そのため，JHは幼虫脱皮を繰り返す成長段階から生殖段階へ と転換させる，鍵となる因子である。JHは主にアラタ体と呼ばれる内分泌器官で合成される。JHの生合成 経路は大部分が明らかになっているが，触媒酵素がはっきりしていない生合成反応が一部残されている。
本研究は，新規JH生合成酵素の同定を目標として，まずカイコガのアラタ体で高レベルかつ優先的に発現 している遺伝子の探索を行い，得られたPTPMT1遺伝子についてカイコガとコクヌストモドキを用いて分 子生物学的，発生遺伝学的に機能解析を行なった。本論文は，研究により得られた知見をまとめたもので あり，序章と総括を含めた以下の全６章からなる。
序章では，昆虫の後胚発生の内分泌制御を概説し，アラタ体におけるJH生合成経路に関する既知の知見 を詳細に説明している。その上で，解決すべき問題点とその生物学的意義を明確にし，新規JH生合成酵素 遺伝子の同定という本研究の目的を示している。
第１章では，既存のアラタ体由来のESTライブラリーとDNAマイクロアレイによる組織間遺伝子発現 比較のデータを用いた，カイコガのアラタ体で高レベルかつ他の組織より優先的に発現している遺伝子の 探索について述べている。既知のJH 生合成酵素遺伝子はアラタ体で高レベルかつ優先的に発現している。
そのため，未同定のJH生合成酵素遺伝子も同様の特徴をもつと考えられる。探索の結果，protein tyrosine phosphatase, mitochondrial 1 (PTPMT1) の遺伝子と新規な酸化還元酵素の遺伝子の２つが得られた。PTPMT1 はタンパク質チロシン残基脱リン酸化酵素スーパーファミリーのメンバーであるが，JH前駆体のような脂 質も基質とすることが知られている。JH生合成経路において触媒酵素がはっきりしない反応の１つは，フ ァルネシル二リン酸の脱リン酸化反応であり，この反応とPTPMT1の関連についても言及されている。
第２章では，カイコガを用いて行ったPTPMT1の機能解析について述べている。PTPMT1遺伝子の機能 は，近年，脊椎動物において明らかにされつつあり，ミトコンドリアの機能維持において重要であること が示されている。また，このミトコンドリアにおける機能のためにはタンパク質上にある移行シグナルを 介したミトコンドリアへの移行が必須である。しかしながら，PTPMT1 のホルモン生合成における役割な らびに無脊椎動物における機能に関する知見はない。そこで，PTPMT1 遺伝子のカイコガにおける機能を 明らかにするためにTALENを用いたゲノム編集を行い，PTPMT1欠失カイコガを作出した。PTPMT1突然 変異対立遺伝子が２つ得られ，１つは，翻訳開始点直後でフレームシフトが起こっておりnull 突然変異体 だと考えられる。もう１つは，ミトコンドリア移行シグナルのみに欠損があり，他の機能ドメインは維持 されていた。そのため，この対立遺伝子から合成されたタンパク質は，ミトコンドリアには移行されない ものの酵素活性は保持していると思われる。これら２つの対立遺伝子のホモ接合体は，ともに胚性致死で
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あった。致死した胚の発生は孵化直前まで進んでおり，形態形成は正常に行われていると考えられた。
PTPMT1欠失カイコガの胚期におけるJH応答性遺伝子であるKr-h1発現を調べたところ，発現量が著しく 減少していた。そのため，体液中のJH量が減少していることが示唆された。JHの欠損は一般的に早熟変 態を引き起こす。そこで，PTPMT1 欠失カイコガの後胚発生を調べるために，胚を低温で発生させること で孵化個体を得た。孵化したPTPMT1欠失カイコガ幼虫の成長を観察したところ，深刻な発育不全ならび に若齢期における致死が観察されたが，早熟変態は観察されなかった。脊椎動物においては，PTPMT1 は ミトコンドリアの機能維持にはたらき，その欠損はミトコンドリア機能不全による胚性あるいは幼生の早 い段階における致死を引き起こす。PTPMT1 欠失カイコガ胚におけるミトコンドリア遺伝子の発現を調べ たところ，発現量が減少しており，ミトコンドリアの機能不全が示唆された。ミトコンドリア移行シグナ ルのみを欠損したPTPMT1をもつカイコガにおいても，null突然変異体と同様の致死性を示すこと，また PTPMT1 の欠失によってミトコンドリアの機能不全が引き起こされることから，PTPMT1 はカイコガにお いても脊椎動物と同様のミトコンドリアの機能維持に必須な役割を持つと考えられる。
第３章では，コクヌストモドキを用いたRNA干渉法によるPTPMT1の機能解析の結果について論じてい る。コクヌストモドキ幼虫でPTPMT1の機能を減衰させたところ，早熟変態は観察されず，脱皮回数の増 加を伴う幼虫期間の延長が観察された。PTPMT1 の機能を減衰させた個体と対照実験個体の同じ齢におけ る頭幅を測定したところ，PTPMT1 機能減衰個体において有意に頭幅が短縮していた。これは発育不全を 示しており，脱皮回数の増加ならびに幼虫期間の延長は，幼虫の発育不全により体サイズが変態開始の閾 値に達するタイミングが遅延したためだと考えられた。したがって，コクヌストモドキにおける PTPMT1 の機能減衰によるこれらの影響も，PTPMT1 欠失カイコガと同様にミトコンドリアの機能不全が原因であ り，コクヌストモドキにおいてもPTPMT1はミトコンドリアの機能維持に重要な機能をもつと推測された。
第４章では，新たに見出されたPTPMT1のスプライシングアイソフォームについて論じている。JH生合 成が盛んなカイコガ４齢２日目のアラタ体におけるPTPMT1のmRNAの構造を解析したところ，２つのス プライシングアイソフォームの存在が確認された。片方のアイソフォームは脊椎動物からは報告されてい ない新規のものであった。この新規アイソフォームはコクヌストモドキからも見出され，昆虫においては 保存されていることが示唆された。カイコガにおいて各アイソフォームの発現パターンを解析したところ，
新規アイソフォームは側心体-アラタ体優先的に発現しており，またアラタ体の JH 生合成活性の変動に従 った発現変動を示した。それに対し，もう１つのアイソフォームはどの組織でも発現が認められたが，特 に精巣において強い発現が見られた。これらのことから昆虫においてPTPMT1は各アイソフォームで機能 分担しており，アラタ体における主な機能は新規アイソフォームが担っている可能性が示唆された。
最後の章は総括である。本研究ではJH生合成酵素遺伝子の新規な候補遺伝子を２つ同定した。そのうち
PTPMT1 に注目しカイコガおよびコクヌストモドキを用いて機能解析を行なった。その結果，両種におい
てPTPMT1は脊椎動物で示されている知見と同様にミトコンドリアの機能維持に必須な役割をもつことが 明らかになった。PTPMT1機能欠損個体において，JH欠損個体に特徴的な早熟変態は観察されなかったが，
JH応答性遺伝子の発現は減少しており，PTPMT1のアラタ体における発現パターンからもPTPMT1がJH 生合成に重要なはたらきをもつことが強く示唆される。機能欠失個体が早熟変態を示さなかったのは，ミ トコンドリアの機能不全により早熟変態が観察される前に致死したためだと論じている。さらに，PTPMT1 の新規スプライシングアイソフォームを同定し，各アイソフォームが機能分担している可能性を示した。
そして，各アイソフォームに注目した解析を進めることで，JH生合成への関与も含めた各アイソフォーム 特異的な機能の解明が可能であろうと提言している。
以上のように，本論文ではJH生合成酵素遺伝子の新規候補を２つ同定し，そのうちの１つであるPTPMT1 の機能解析を行った。本遺伝子がJH生合成酵素遺伝子であることを明確には示すことができなかったもの の，脊椎動物における知見と同様にミトコンドリアの機能維持に極めて重要な役割をもつことを無脊椎動 物で初めて示した。さらに，PTPMT1 の新規アイソフォームを見出し，アイソフォームにより機能分担し ている可能性も示しており高く評価できる。
よって本論文は，博士（理学）の学位を授与されるに値するものと認められる。
以 上 令 和 ３年 １月 ７日
