植物核膜の構造ならびに有糸分裂にともなう

博 士 （ 農 学 ） 木 村 祐 太

学 位 論 文 題 名

植物核膜の構造ならびに有糸分裂にともなう      ダイナミクスに関する研究

学位論文内容の要旨

細 胞 核 は 動 植 物 細 胞 に 共 通 す る 細 胞 小 器 官 で あ り ， 細 胞 質 と 核 質は 核膜 （nuclear envelope， 以 下NEと す る ） に よ っ て 隔 て ら れ る 。NEは ， 核 外 膜 と 核 内 膜 か ら な る 二 重 膜(nuclear membrane， 以 下NMと す る ） ， 核 膜 孔 複 合 体 お よ びNM支 持 構 造 で 構成 され る 。NEの基 本的 な役 割は 転写 と翻 訳の 独立 した 場を っくることにある 。NM は その ため の パリ ア― とし て機 能し ，NMを貫 通す る核 膜孔 複合 体が核一細胞質問 の選 択 的輸 送を 担 う。 体制 の発 達し た動 植物 細胞 のNEは． 有糸 分裂 の過程で崩壊し， 娘核 の 形成 とと も に再 形成 され る。 その 意義 は不 明で ある が； 櫛で は:'‑NE―の徽薊F前期 前 微小 管束 の 近く から 始ま るこ とか ら． 細胞 板形 成位 置と の関 連が示唆されてい る。

NEの 崩 壊 と 再 構 成 はNM内 在 タ ン パ ク 質．NM支 持 構造 を構 成す るタ ンノ くク 質お よび 細 胞骨 格の 相 互作 用に よる と考 えら れて いる が， 植物 のNE関連 タンパク質の研究 は緒 に つ い た ぱ か り で あ る 。 そ こ で 本 研 究で は， 植 物のNM支 持構 造に 関連 する と推 定さ れ るタ ンパ ク質をアミノ酸 配列上の特徴によって分類し，それぞれの群のタンパク 質に つ い て ， 有 糸 分 裂 に と も な う ダ イ ナ ミク スを 調 ぺる とと もに ，染 色体 およ びNMとの 相 互 作 用 の 可 能 性 を 検 討 し た 。 論 文 の 内 容 は 以 下 に 要 約 さ れ る 。

1NMCP遺 伝子 の検 索と 推定 され るア ミノ 酸 配列 の解 析

動 物 のNM支 持 構 造 （ 核 ラ ミ ナ ） は ラ ミ ンタ ンパ ク質 から なる 編目 状の 繊維 構 造で あ る が， 植物 に ラミン遺伝子はない。ー方植物では，有糸分裂間期細胞 の核表層に局在す る タ ン パ ク 質 と し て ニ ン ジ ンNMCPl (DcNMCPl)が 見 っ か っ て い る 。 デ ― 夕 ベ ― ス に 含 ま れ るDcNMCPlホモ ログ を検 索し たと ころ ，シ 口イ ヌナ ズナ ，イ ネ． ブ ドウ ， ポ プ ラ な ど で相 同遺 伝子 の存 在が 確認 され た。DcNMCPlは 。そ のア ミノ 酸配 列 から ， coiled‑coilか ら な る 中 央 のRod領 域 をHeadとRod領 域 が 挟 む 構 造 を と っ て い る と 推 定 さ れ て い る 。 そ こ で ， 検 索 さ れ た ホモ ログ （以 下NMCPと 称す る） の構 造 をア ミ ノ 酸 配 列 か ら推 定し たと ころ ，い ずれ も， ほぽ 同 じ長 さのRod領域 をも つタ ン パク 質 で あ る こ と が明 らか とな った 。Rod領域 以外 のア ミノ 酸配 列に 著し い変 異が 見 られ た の で ，CLUSTALWに よ る 系 統 解 析 を 行 っ た 。 そ の 結 果 ，NMCPは ， 長 さ の 比 較 的 斉 一 なTail領 域 と， 高度 に保 存さ れた 配列 をカ ルポ キシ 末端 にも つ群 と．アミノ酸配列 の 類似 したHead領 域と 総じ て短 く， 多様 な長 さのT．ail領 域を もつ 群に分類された。

前 者をNMCP1．後 者をNMCP2とし た。

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2NMCPの 細胞 内 局在 に機 能す るタ ンパ ク質 領域 の特 定

モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 を 使 っ た 先 行 研 究 に よ っ て ， 二 ン ジ ン のNMCP (DcNMCPlお よ びDcNMCP2)が ， ニ ン ジ ン 懸 濁 培 養 細 胞 の 核 表 層 に 局 在 す る こ と が 明 ら か に さ れ て い る 。 そ こ で ，NMCPl/NMCP2の 核 お よ ぴ 核 表 層 へ の 局 在 に 関 与 す る ポ リ ペ プ チ ド 領 域 を 特 定 し た 。 こ の 目 的 の た め に ，DcNMCPl/DcNMCP2の 全 長 お よ び 部 分 配 列 と EGFPと の 融 合 タ ン パ ク 質 を コ ー ド す るDNA断 片 をCaMW35Sプ ロ モ 一 夕 ― の 下 流 に挿 入し たプラスミドを作成し，パーデ ィクルデリパリー法を用いてセロリ葉柄および タマ ネギ 鱗茎表皮細胞に導入した。発現 したタンパク質の細胞内移行性を顕微鏡下で検 討 し た と こ ろ ，DcNMCPIのTail領 域 の ー 部 に 核 移 行 に 必 要 な機 能の ある こ とが わか っ た 。 こ の 部 位 に はPSORTに よ っ て 検 索 さ れ る 核 移 行 シ グ ナ ル(NLS)が 含 ま れ て い た 。 さ ら に 、 核 表 層 へ の 移 行 に はHead領 域 ，Rod領 域 の 一 部 お よ びTail領 域 のNLS 周 辺 の 配 列 が 必 要 で あ る こ と が 明 ら か と な っ た 。 次 い で ，DcNMCP2の局 在 性に つい て 調 べ た 。DcNMCP2‑EGFP融 合 タ ン パ ク 質 は 核 に 移 行 し た も の の ． 核 表 層 に は 局 在 し な か っ た 。Head領 域 を 除 去 し たDcNMCP2は 核 内 で 大 型 の 穎 粒 を 形 成 し た こ と か ら， この 領域に核内の何らかの構造と結 合する働きがあると推定された。セロりおよび タマ ネギ 細胞は同じ移行性を示したが， 長いポリベプチドを発現させた場合にセロリ細 胞で より 強い 螢光 強度 が得 られ た。

3有糸分裂にともなうNMCP1およびNMCP2のダイナミクス

NEタ ンパ ク質 に関 する これ まで の研 究に は ．歴 史的 な背 景からニンジンが多く 利用さ れて きた 。し かし ，NEタン パク 質の 局在 性 や有 糸分 裂時 の挙動を調べる上で， ゲノム サイ ズが小さいニンジン は不利である。そこで本研究では，より大きな核を持ち ．細胞 培 養 系 が 確 立 し て い る セ ロ リ 細 胞 の 利 用 を 試 み た 。 新 た に 同 定 し た セ ロ り の NMCPl(AgNMCPl） と NMCP2 (AgNMCP2)は 二 ： ン ジ ン の NMCP1とNMCP2と それ それ83％ およ び77％の 相同 性を 示し た 。ニ ンジ ンタ ンパク質を抗原とする 単クロ ー ン 抗 体CML01お よ ぴ CML‑10は そ れ そ れ AgNMCPlお よ ぴAgNMCP2と 反 応 した 。両者の交叉反応は 無視できる程度であった。そこで，セロリ培養細胞を用 い，螢 光 抗 体 法 に よ り ， 有 糸 分 裂 に と も な うAgNMCPlとAgNMCP2の 局 在 性 変 化 を 調 べ た。その結果，いずれのタンノヾク質も，有糸分裂間期では核の表層に局在していたが，

分 裂 前 期 か ら 中 期 に か け て のNMの崩 壊と と もに 急速 に分 散し た。 それ 以降 の挙 動は 両 者 で 大 き く 異 な っ た 。 分 散 し たAgNMCPlの 大 部 分 は 紡 錘体 付近 に分 布し ，両 極に 移動している染色体の表面に集積しはじめ，終期細胞では娘核の表面に局在した。―方，

AgNMCP2は 液 胞 を 除 く 分 裂 期 細 胞 質 全 域 に 広 く 分 散 し ， 分裂 終期 にな って から ，再 形成 されつっある核の表 面に集積しはじめた。共焦点および電子顕微鏡によって 得た画 像 の 解 析 か ら ． 分 裂 期 細 胞 質 中 に 分 散 し たAgNMCP2は 小 胞状 の構 造に 分布 して いる こ と ，NMは 小 胞 の 融 合 に よ っ て 再 生 さ れ る こ と ，NMはAgNMCP2が 核 表 層 に 集 積 するのとほぽ同じ時期に再生されることが明らか となった。

以 上 の 結 果 か ら ，NMCP1お よ びNMCP2はNMあ る い は 染 色 体 と 相 互 作 用 す る 構 造 タンノくク質であるこ とが示唆された。これらのタンパク質は，形態形成，環境応答やプ ロ グラ ム細 胞死 との 関連 など 核膜 の多 様な 機 能を 明ら かに する貴重なツールとして利 用することができると 考えられる。

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学位論文審査の要旨

学 位 論 文 題 名

植物核膜の構造ならびに有糸分裂にともなう      ダイナミクスに関する研究

細胞 質と 核質 を仕 切る核膜は，外膜と内膜からなるりン脂質の二重膜 ，核膜孔複合体お よび 核膜 支持 構造 で構成される。核膜と核膜孔複合体は，転写と翻訳 の場を隔離すると とも に， 核と 細胞 質との間の選択的な物質輸送に働く。一方，核膜支 持構造はりン脂質 の二 重膜 を保 持し ，核膜孔複合体を繋留する。加えて，核膜支持構造 は核内膜と染色体 との 相互 作用 に関 わっていると考えられている。体制の発達した動物 や植物の核膜は有 糸分 裂の 過程 で崩 壊し，娘核の形成にともなって再構成される。近年 ，動物では，核膜 構成 要素 のそ れそ れが 核膜 の崩 壊と 再 形成 とど のよ うに 関わ って いる のかが明らかに され つっ ある 。し かし，植物の核膜については，その崩壊と再構成の 仕組みを合めて多 くが 未解 決の もん だいとして残されている。核膜ダイナミクスの研究 は．核膜支持構造 夕ン パク 質の 役割 の解 明す るた めの1つの アプ ロ― チで ある 。

  提 出 さ れ た 論 文 は ， こ の よ う な 研 究 の背 景を ふま え， 植物 固有 の核 膜夕 ン パク 質 NMCP，核 膜（ リン 脂質 膜部 分） ，お よ ぴ染 色体 のダ イナ ミク スを 調べ ることにより・

有糸 分裂 にお ける 植物 核膜 の崩 壊・ 再 構成 の仕 組み を推 定し たも ので ある。論文は図 44， 表13を 合 む 総 ぺ ― ジ 数125の 和 文 論 文 で あ り ， 別 に 参 考 論 文1編 が 添 付 さ れ て いる 。論 文審 査の 内容 を以 下に 要約 す る。

1NMCP遺 伝 子の 検索 と推 定さ れる アミ ノ酸 配列 の解 析

有 糸 分 裂 間 期 細 胞 の 核 表 層 に 局 在 す る タ ン パ ク 質 と し て ニ ン ジ ンNMCP1 (DcNMCPl)お よ ぴ そ の ホ モ ロ グ が シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ と イ ネ で 報 告 さ れ て い る 。 DcNMCPlは ， 主 にcoiled‑coilか ら な る 中 央 のRod領 域 を 介 し てHeadとRod領 域が 挟む 構造 をと る。そのことから，植物における核膜支持構造の骨 格タンパク質であ る と 推 定 さ れて いる 。そ こで ，Rod領域 のア ミノ 酸配 列を 手が かり に， デ― 夕 ベー ス を 検 索 し た 。そ の結 果， ブド ウ， ポプ ラな ど8種 の植 物で 合計18の 相同 の遺 伝 子を 同     ー1238ー

清 則

澄

泰 真

田 田

岸

増 幸

山

授 授

授

教

教 教

准

査 査

査

主 副

副

定した。NMCP1ホモログ （以下NMCPと する）の 共通する性 質を調ぺ るため， それ らのホモログについてコンピュ―夕ープログラムによるアミノ酸配列の解析を行い，い ずれもほぽ同じ長さのcoiled‑coil領域を形成するタンノくク質であることを明らかにし た。さらに．同定されたNMCPについて，アミノ酸配列に基づぃた系統解析を行い・

NMCPは NMCP1と NMCP2の 2っ の 群 に 分 け る の が 適 当 で あ る と し た 。 2細胞内局在に機能するタンパク質領域の特定

NMCP1は分裂間 期細胞核の表層に局在することが免疫染色法によって明らかになっ ている。 そこで，NMCP1の核および核表層への局在に関与するポりペプチド領域を 特定した 。そのこ とを検討 するため ，DcNMCPlの全長お よぴ部分 配列をEGFPとの 融合タン パク質と して発現するベクタ―を作成し，一過性発現により生じたNMCP1 の細胞内移行性を螢光顕微鏡で観察した。材料としてセロリ葉柄およびタマネギ鱗茎表 皮組織を用い，パーディクルデリバリー法を用いてぺクタ―を導入した。それにより・

DcNMCPlに は 核 に移 行 する 機能 があるこ と，核の 表層への移 行には，Head，Rod の一部およびTai｜の―部を合む領域が必須であることを明らかにした。DcNMCP2に ついても核に移行することを確認している。

3有糸分裂にともなうNMCP1およぴNMCp2のダイナミクス

セロ リ 液 体培 養 細胞 を 利 用し， 有糸分裂 にともなうNMCP1およぴNMCP2の 局在性 変化を調べることにより，核膜（リン脂質膜）およぴ染色体との相互作用を検討した。

間期 核 で は核 の 表層 に 局 在して いたNMCP1とNMCP2は ，分裂前期 から中期 にかけ て．核膜 の崩壊と ともに，細胞質に分散した。分散したNMCP1は紡錘体付近に分布 し，その後，両極に移動している染色体の表面に集積した。―方．NMCP2は，小胞状 の構造となって分裂期細胞質の全域に分散し，分裂終期になって，再形成されつプある 核の 表 面 を覆 っ た。 以 上 の結果 からーNMCP1お よびNMCP2は，核 膜支持構 造夕ン パク賃として，それぞれ染色体およぴ核内膜と相互作用することによって核膜のダイナ ミクスに関わっていると結諭した。

  核膜支持構造のタンパク質組成に動植物で基本的な違いがあることがゲノム科学の 成果により明らかにされている。核は謎に包まれた細胞小器官であり，細胞の機能に直 接関係する構造として，その研究の重要性が指摘され始めている。提出された論文は，

植物における核膜の構造とそれを支えるタンパク質に関する研究分野におぃて，具体的 な自標を提示したという点で高く評価される。よって審査員ー同は，木村祐太が博士

（農学）の学位を受けるに十分な資格を有するものと認めた。

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