博 士 （ 歯 学 ） 演 平 須 美 子
学位論文題名
ComprehenslVeDeteCtionofHumanPapi110maVlruS inBuCCalCanCerC011eCtedinBangladeSh （バングラデシュにおいて採取した頬粘膜がん対する ヒ ト パ ピ ロ ー マ ウ イ ル ス の 網 羅 的 検 出 ）
学 位論文内容の要旨
【緒言】
ヒ トパ ピ ロー マ ウイ ル ス（HPV） は 、約8000塩基 対 か らな る 環状DNA ウ イ ル スで 、現在ま で100種 類以上の型 が報告され ている。HPVは種々の 上皮性病変の原因ウイルスとされているが、なかでも90％以上の子宮頚がん においてHPVが検出されている。
HPVは 、 初 期 遺 伝 子 で あ り 非 構 造 ウ イ ル ス 遺 伝 子 のEl、E2、E4、E 5、E6、E7と 後 期 遺 伝 子 で あ り 構 造 遺 伝 子 のLl，L2を 持 つ 。E6、E 7は、主要ながん遺伝子であり形質転換能を有する。E6タンパクと細胞内タ ン パクのE6APが結 合した複合体はユビキチンライゲースとして働き、がん 抑 制 遺 伝子 で あるp53を ユビ キ チン 化 し 分解 する。またE7タンパクはRb ファミリータンパクと結合し転写因子E2Fを放出することにより、細胞遺伝 子 の 転 写 を 活 性 化 さ せ 、DNA合 成 の 誘 導や 細 胞周 期 を 正に 制 御す る 。 疫学的、分子生物学的研究から、HPV感染と口腔のがん化の関連性が示さ れ て い るが 、 それ ぞ れの 報 告に よ りHPV感染 率は0％から100％までの幅 がある。報告された検出結果のうち、高増幅回数のPCRを行ったものにおけ るHPV検出率が高くなる傾向が認められる。また現段階では、上皮細胞のが ん化にどれだけの数のHPVウイルス粒子が必要かは明らかになってはいない。
【材料と方法】
試料として使用したDNA：
正常な頬粘膜組織（日本人：28例、バングラデシュ人：55例）、頬粘膜が ん 組 織（ バ ン グ ラ デ シ ュ 人 ：21例） は 、 バ ン グ ラデシ ュのBIRDEM病院 及び、北海道大学病院で患者のインフオームドコンセントの下で生検または擦 過により採取した。組織試料をプロテアーゼK（20ルg/ml）で処理後、フェノ ール・クロロフオルム抽出とエタノール沈殿によルゲノムDNAを精製し、出 発材料とした。
PCR法：
26種 類 のHPV全 長 プ ラ ス ミ ド 、2種 のHPVプ ラ ス ミ ド を 混 合 した 試 料 、 ま た は 、 正 常 頬 粘 膜 試 料 か ら 抽 出 し た DNAを 鋳 型 と し て 、 コンセンサスプライマーであるpU一1M（51‐TGTCAAAAACCGTTGTGTCC−3｜）、
pU−31B（5｜−TGCTAATTCGGTGCTACCTG−3｜）、pU‑2R（51−GAGCTGTCGCTTAA TTGCTC− 3｜ ） を 使 用 し たPCRを 行 っ た 。 各 PCRは Dynazyme（F INNZYMES社 、 フ ィ ン ラ ン ド ） を 用 い て 、94℃30秒 、52℃30秒 、 72℃30秒 で の 増 幅 を30サ イ ク ル行 な っ た 。 こ れ らPCR産 物 を精 製 し た 後 、Av an、Ac cIを 用 い16時 間 の制 限 酵 素 処 理 を行い アガ ロー ス電気 泳動にてHPV型を検討した。
DNAアレイ法：
25種類（HPV‐6、11、16、17、18、20、21、31、33、 34、35、39、40、42、45、47、51、52、53、54、56、
58、59、61型 ） のHPV型 を ク ロ スハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン なし に 検 出 することが可能な新規のDNAアレイ法（ジェネティックラボ、日本）を用い、
プロトコールに従って頬粘膜がん試料より抽出したDNAの解析を行をった。
【 結果 】
コ ンセ ンサ スプラ イマ ーの 特異性 と感 度：
コ ンセンサスプライマーを用い、26種の全長HPVプラスミドを鋳型とした PCRを 行 っ た 結 果 、26種 の HPVの う ち HPV―16、 18、 31、 33、 35、39、 40、45、52、56、 58型 が 検 出 可 能 で あ っ た 。 そ の 後 、
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同様のPCRを2種類のプラスミドを混合した試料を鋳型として行なったが、
アガロースゲル電気泳動上では2つのバンドを区別することは困難であった。
し か し 、.AvaH、Ac cIを 用 い た 制 限 酵 素 処 理 を 行 う とPCR産 物 のHP Vの 型判別 が可 能で あった 。ま たこ のPCR法 によ り、1細 胞中1コ ピー のH PVゲノムを検出可能であり、このコンセンサスプライマーセットを用いてH PV感染をスクリーニングできると考えられた。
正常口腔粘膜と悪性部位でのHPV検出：
試 料 は す べ てGAPDHに 対 するPCRによ って 実験 材料 として 適切 であ るこ とを確認した上で、pU−lM/pU−2Rプライマーを用いたPCRにより解析した。
PCRの 結 果 、 日 本 人 正 常 粘 膜28例 中2例 で 、HPV―11、16型 が そ れ ぞ れ確 認された。しかし、バングラデシュ人の正常粘膜55例からは、HPV DNAは検出されなかった。バングラデシュ人の頬粘膜がん症例21例にっい てPCRを 行 な っ た がHPV DNAは 検 出 さ れ ず 、DNAア レ イ 法 を 用 い た 解析によっても、HPVは検出されなかった。
【考察】
喫煙、アルコール摂取と同様、近年HPVもまた口腔がんの主要なりスクフ ァクターであるという報告がなされている。しかし、口腔領域でのHPV陽性 率の報告にはかなりの幅がある。我々の以前の研究では、口腔扁平上皮がん症 例 の25％ か ら30％ に お い てHPV感 染 が 認 め ら れ た 。43％の 口 腔 が ん症 例 に お い て 、p53の 点 突 然変 異 が み ら れ た が 、HPV感 染とp53点 突 然変 異が同時に存在するものは稀であった。このことは、HPV感染が口腔がんの 独 立 し た り ス ク フ ァ ク タ ー で あ る こ と を 示 唆 し て い る 。 バングラデシュでは、頬粘膜部扁平上皮がんは、最も頻繁に生じる悪性新生 物 であ るが 、betel―quidが誘 発因 子の ーっで はな いか と考 えられ る。
betel−quidはがん抑制遺伝子を変異させることの可能な化学的遺伝毒性物質 を 含 ん で お り 、Chibaら は、betel−quidの摂 取がp53のエ クソ ン5に特 異的な変異をもたらすと報告している。このような遺伝子の変異がバングラデ シ ュ で の 頬 粘 膜 部 悪 性 腫 瘍 に も 生 じ て い る 可 能 性 は 高 い 。
100種 類以上 のHPV型があ るこ とを 考えると、今回検討した症例におけ るHPV感染の可能性を除外することは出来ない。しかしながら、我カの用い たコンセンサスプライマーセットを使用したPCRでは頻繁に感染が確認され るHPV型 を 高 感 度 で 検 出 で き 、ま たDNAアレイ 法で は、25種類 の異 なる 型のHPVを同時に検出することが可能であることを考慮すると、バングラデ シュにおいてはHPV感染が頬粘膜がんのりスクファクターとなる可能性は低 いのではないかと考えられる。
Antons sonらは、バングラデシュにおいて採取した額部の試料に対し45 サイ ク ル のPCRを 行 う こ と に より 、全 試料 中の68％か ら皮 膚型 のHPVを 検出したと報告をしている。しかし我々は35サイクル以上で高いバックグラ ウンドを検出した。また、高感度な方法によってのみ検出可能となるような低 コピー数のHPVが、ヒト上皮細胞をがん化することが可能とは考えにくい。
我々 はま た、 バン グラデ シュ と日 本の正 常口 腔粘 膜に おけるHPV DNA 検出 をPCR法 で 行 な っ た 。 そ の結 果 、 日 本 人28例 中2例 の みが 、HPV陽 性であ り、 バン グラ デシュ 人55例か らはHPV DNAが検出 され なか った。
この結果はHPV感染率には、地理的な差異があることを示唆している可能性 がある。頬粘膜におけるHPV感染には、文化や生活習慣の違いが影響を及ば している可能性も考えられるが、口腔領域へのHPV感染経路は未だ明らかで はなく、今回認められた2国間におけるHPV感染率の差異が生じる原因の解 明 に は 個 人 的 な 問 診 を 含 め た 詳 細 な 解 析 が 必 要 と 考 え ら れ る 。
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学 位 論 文 審 査 の 要 旨 主査
副査 副査 副査
教授 教授 教授 助教授
中 村 太 保 柴田健一郎 向 後 隆 男 安 田 元 昭
学 位 論 文 題名
..Comprehensive Detection of Human Papillomavirus in Buccal Cancer Collected in Bangladesh
（ バ ン グ ラ デ シ ュ に お い て 採 取 し た 頬 粘 膜 が ん 対 す る ヒ ト パ ピ ロ ー マ ウ イ ル ス の 網 羅 的 検 出 ）
審 査 は 柴 田 、 向 後 、 安 田 お よ び 中 村 審 査 委 員 全 員 が 出 席 の も と に 、ま ずは 論 文提 出者 に 対 し て 提 出 論 文 の 内 容 の 要 旨 を 説 明 さ せ 、 提 出 論 文 の 内 容 に 関 す る審 査委 員 の口 頭試 問 を 行 っ た 。 以下 に 提出 論文 の要 旨と 審査 の内 容を 述べ る。
1， 提 出 論 文 の 要 旨 I
ヒ ト パ ピ ロ ー マ ウ イ ル ス （HPV)は 、 現 在 ま で100種 類 以 上 の 型 が 報 告 さ れ て お り 、 種 々 の 上皮 性病 変の 原因 ウイ ルス と され てい る。
疫 学 的 、 分 子 生 物 学 的 研 究 か ら 、HPV感 染 と 口 腔 の が ん 化 の 関 連 が 示さ れて いる が、
各 々 の 報 告 に よ りHPV感 染 率 はOを か ら100を と 幅 が あ り 、 特 に 、 高 増 幅 回 数 のPCRを 行 っ た 場 合HPV検 出 率 が 高 く な る 傾 向 が 認 め ら れる 。
試 料 は 、 正 常 な 頬 粘 膜 組 織 （ 日 本 人 ：28例 、 バ ン グ ラ デ シ ュ 人 ：55例 ）、 頬粘 膜が ん 組 織 （ バ ン グ ラ デ シ ュ 人 ： 21例 ） を バ ン グ ラ デ シ ュ のBIRDEM病 院 及 び 、 北 海 道 大 学 病 院 で 患 者 の イ ン フ オ ー ム ド コ ン セ ン ト の 下 で 生 検 ま た は 擦 過 に よ り 採 取し た。 組織 試料
をプロテアーゼK（20p g/ml）で処理後、フェノール・クロロフオルム抽出とエタノー ル沈殿によルゲノムDNAを精製し出発材料とした。
26種類のHPV全長プラスミド、2種のHPV全長プラスミドを混合した試料、または、
頬粘 膜試料から抽出したDNAを鋳型として、コンセンサスプライマーであるpU−1M ( 5 ' ‑TGTCAAAAACCGTTGTGTCC‑ 3 I ) . pU‑ 31B ( 5 ' ‑TGCTAATTCGGTGCTACCTG‑ 3 ' ) .
pU‐2R（51―GAGCTGTCGCTTAATTGCTCー31） を使 用 したPCRを 行 った 。 各PCRは Dynazyme（ FINNZYMES社、フア ンランド）を用い、94aC30秒、520C30秒、720C30 秒で の増幅を30サ イクル行な った。これ らPCR産物 を精製した 後、Avan、AccIを
用い16時間の制限酵素処理後アガロース電気泳動にてHPV型を検討した。
また. 25種類 (HPV‑ 6 ,11,16 , 17 ,18 , 20, 21, 30, 31, 33, 34, 35, 39, 40, 42, 45, 47，51，52，53，54，56，58，59，61型）のHPV型を交叉反応なしに検出することが可 能な新規のDNAアレイ法（ジェネティックラボ、日本）を用い、頬粘膜がん試料より 抽出したDNAの解析を行なった。
コ ン セ ン サ ス プ ラ イ マ ー を 用 い たPCRの 結 果 、26種 のHPVの う ちHPV− 6，11，16，18，31，33，35，39，40，45，52，56，58型が検出可能であった。その後、同
様のPCRを2種のプラスミドを混合した試料を鋳型として行なったが、Ava II、Acc Iを用いた制限酵素処理によりPCR産物のHPVの型判別が可能であった。これより、
このコンセンサスプライマーを用いてHPV感染をスクリーニングできると考えられた。
試料はすべてGAPDHに対するPCRによって実験材料として適切であることを確認し、
コンセンサスプライマーを用いたPCRにより解析した。その結果、日本人正常粘膜28 例中2例で、HPV―6，11型がそれぞれ確認された。しかし、バングラデシュ人の正常 粘膜55例は全てHPV陰性であった。バングラデシュ人の頬粘膜がん症例21例につい て もPCRを行 なったがHPV DNAは検出さ れず、DNAアレイ法を用いた解析によって
も 、HPVは 検 出 さ れな か った 。 ―791―
喫煙、アルコール摂取と同様、近年HPVもまた口腔がんの主要なりスクファクター であると報告されている。バングラデシュでは、頬粘膜がんは頻繁に生じる悪性腫瘍で あるが、betel―quidが誘発因子のーっではないかと考えられる。betel−quidはが ん抑制遺伝子の変異が可能な化学的毒性物質を含んでおり、遺伝子の変異がバングラデ シュでの頬粘膜悪性腫瘍にも生じている可能性は高い。
100種類以上のHPV型があることを考えると、今回検討した症例におけるHPV感染 の可能性の除外は出来ないが、コンセンサスプライマーを使用したPCR法では頻繁に 感染 が確認され るHPV型を 高感度で検 出でき、DNAアレイ法 では25種類のHPV型の 同時検出が可能であることを考慮すると、バングラデシュにおいてはHPV感染が頬粘 膜 が ん の り ス ク フ ァク タ ーと な る可 能 性は 低 い ので は ない か と考 え られ る 。 また、 バングラデ シュと日本 の正常口腔 粘膜におけるHPV DNA検出をPCR法で行 なっ たが、日本 人28例中2例のみが、HPV陽性であり、バングラデシュ人55例から はHPV DNAが検出され なかった。 この結果はHPV感染の地理的な差異を示唆してい る可能性がある。頬粘膜におけるHPV感染には、文化や生活習慣の違いによる影響も 考えられるが、口腔領域へのHPV感染経路は未だ明らかではなく、今回認められた2 国間におけるHPV感染率の差異が生じる原因の解明には個人的な問診を含めた詳細な 解析が必要と考えられる。
2．審査委員からの質問
（1）HPV感染による、細胞のがん化について。
(2) Betel・quidにっいて。
(3) HPVのE6タンパク質とp53の関連性にっいて。
(4)HPVの 皮 膚 に 対 す る 感 染 と 、 粘 膜 に 対 す る 感 染 の 機 序 に つ い て 。 (5)DNAア レ イを 用 い たHPV DNA検 出 にお け る具 体 的か つ 詳細 な内容 について。
(6)論文中におけるバングラデシュと日本の正常頬粘膜についての検討について。
これらの質問に対して、論文提出者は適切な回答を行うとともに、本論文の学術的位 置 づけ を的 確に 把握 して いる と思わ れた 。ま た、HPVに関 する知 識お よび分子生物学 的分野に関して広範な知識を有することが認められると同時に、本研究を臨床分野ヘ応 用する展望、将来性の点においても評価できる。以上のことから、学位申請者は博士f歯 学 ）に 値す るも のと 判断 し、 主査な らぴ に副査は学位授与にふさわしいと判定した。
