イオンモビリティーとは? 原理は? 農薬スクリーニングへの適用漢薬中の異性体分析例アレルゲン成分探索と定量分析 2014 Nihon Waters K.K. 3 SYNAPT G2-Si SYNAPT G2-Si イオンモビリティーセル搭載の Q-TOF システムイオンミラー光学輸送系四重

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イオンモビリティーとは？原理は？

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農薬スクリーニングへの適用

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漢⽅薬中の異性体分析例

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アレルゲン成分探索と定量分析

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イオンモビリティーとは？原理は？

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農薬スクリーニングへの適用

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漢⽅薬中の異性体分析例

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アレルゲン成分探索と定量分析

SYNAPT G2 SYNAPT G2--SiSi SYNAPT G2-Si イオンモビリティーセル搭載のQ-TOFシステム 光学輸送系 四重極 _{コリジョンセル} コリジョンセル _{高電場プッシャー} 検出器 モビリティーセル イオンミラー 収束レンズ

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イオンモビリティーセパレーション(IMS)とは？

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イオンモビリティーとは？ イオンモビリティーとは？

化合物の大きさ(サイズ)により分離するモード

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イオンモビリティーの原理 イオンモビリティーの原理 全ての化合物は衝突断面積(CCS)を持つ – Å2_{として測定される。} CCS は分子の空間的⽅向性に依存する – 衝突断面積が⼤きな分子ほどモビリティーセル内での滞在時間が⻑い – これがドリフトタイムでm/zと相関がある。 – 同じようなm/z,または同じm/z (異性体)でさえ異なるドリフトタイムを⽰す。 ©2014 Nihon Waters K.K. 9 Ethene(C2H4) Nitrogen(N2) イオンモビリティーの原理 イオンモビリティーの原理 質量質量衝突断面積衝突断面積 小さい 大きい 質量質量価数価数軽い多いコンパクト重い 少ない かさ高い形形

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①スペクトルクリーンアップ（プリカーサー） ①スペクトルクリーンアップ（プリカーサー） 四重極 （選択なし） Time-of-flight ©2014 Nihon Waters K.K. 11 IMS プリカーサー （LC同時溶出） （IMS分離）プリカーサー ②スペクトルクリーンアップ（フラグメント） ②スペクトルクリーンアップ（フラグメント） 四重極 （選択なし） Time-of-flight

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SYNAPT G2 SYNAPT G2--SiSi / 7 O-glu Ω 136.7 Å2 8 C-glu Ω 129.6 Å2 6 C-glu Ω 132.9 Å2 Luteolin 7 O-glucoside MW 448.3769 C21H20O11 m/z 449.1 m/z 287.0 Luteolin 8 C-glucoside MW 448.3769 C21H20O11

③ ③MS/MS/MSMS/MS/MS 四重極 （選択） Time-of-flight IMS プリカーサー （⼀次開裂） （⼆次開裂）フラグメント

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イオンモビリティーとは？原理は？

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農薬スクリーニングへの適用

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漢⽅薬中の異性体分析例

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アレルゲン成分探索と定量分析

イオンモビリティー共同研究 イオンモビリティー共同研究

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残留農薬スクリーニング 残留農薬スクリーニング(EU)(EU)  スクリーニングメソッドの適用は擬陽性と擬陰性の割合によって定義される – 許容割合 ≤ 5% の擬陰性 – 望ましくは ≤ 5% の擬陽性望ましくは ≤ 5% の擬陽性  法的ガイドライン – 質量精度許容範囲 = ≤5 ppm – 質量分解能 = ≥20k (FWHM) – 保持時間許容範囲 2.5% ©2014 Nihon Waters K.K. 19  擬陽性、擬陰性を低減させるパラメーター – 保持時間許容範囲 ,質量精度許容範囲 , 複数アダクト – アイソトープ⼀致率, フラグメントイオン, イオン比, CCS CCSを用いたスクリーニングを用いたスクリーニング False +ve False -ve 2ppm以下での候補 CCSエラーが⼤きいIsofenphos methylは擬陽性

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検出された 検出されたIndoxacarbIndoxacarbののMSMSEE_データ_データ マスクロマトグラム マスクロマトグラム プリカーサーイオンフラグメントイオン ©2014 Nihon Waters K.K. 21 イオンモビリティーによる イオンモビリティーによる Indoxacarb Indoxacarbプロトマープロトマー m/z=528, RT=8.74 ２つのH＋イオンを検出 CCS = 136.5 Ǻ2 CCS = 148.0 Ǻ2 H+_{の付加位置により同じ化合物でもCCSが異なる}

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Indoxacarb Indoxacarbプロトマープロトマー フラグメントイオンスペクトル フラグメントイオンスペクトル CCS = CCS = 148.0 Ǻ2 CCS = 136.5 Ǻ2 ©2014 Nihon Waters K.K. 23 農薬スクリーニングのまとめ 農薬スクリーニングのまとめ  CCSは有用な同定ポイントとなる – 擬陽性と擬陰性割合の改善 – マスと保持時間のシフトが起こったときにでも確証が持てるマスと保持時間のシフトが起こったときにでも確証が持てる  IMSによりプリカーサーとフラグメントスペクトルをクリーンアップ – 構造の解明を援助  水素付加位置違いのフラグメントパターンと同定 – 四重極MSでのイオン比の不⼀致が説明される？ – 異なる水素付加位置は異なるフラグメントパターンを⽰す

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イオンモビリティーとは？原理は？

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農薬スクリーニングへの適用

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漢⽅薬中の異性体分析例

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アレルゲン成分探索と定量分析

Flavonoid Flavonoid ターゲットマーカーの構造ターゲットマーカーの構造 Passiflora

Passiflora caeruleacaerulea (PC)(PC)

O H Isoorientin Orientin イオンモビリティーを用いこれらアイソマーを分離 O H O H O H O H O O H O O H O O H O H O H O H O H O H O H O O H O O O H O H O H O H O O H O H Isoorientin Orientin Isovitexin Vitexin 同重量体 O H O H O O H O O O H O H O H O O O H O O H O H O H O H 6C glycocides 8C glycocides 同重量体

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MS MSEE_{データスペクトル（イオンモビリティー無し）}_{データスペクトル（イオンモビリティー無し）} スペクトルクリーンアップ無しイオンモビリティー無し低エネルギー高エネルギー ©2014 Nihon Waters K.K. 27 高エネルギ MS MSEE_{データスペクトル（イオンモビリティー有り）}_{データスペクトル（イオンモビリティー有り）} スペクトルクリーンアップ有りイオンモビリティー有りギ低エネルギー高エネルギー

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MS MSEE_{高エネルギースペクトル}_{高エネルギースペクトル} ((IsoorientinIsoorientin)) イオンモビリティー分離後のIsoorientinフラグメントスペクトル ©2014 Nihon Waters K.K. 29 MS MSEE_{高エネルギースペクトル}_{高エネルギースペクトル} ((OrientinOrientin)) イオンモビリティー分離後のOrientinフラグメントスペクトルこれらの種は同じフラグメントを生成するが,強度が異なるフラグメントイオンの強度比もまた化合物同定に使用でき、構造の解明を援助する。

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イオンモビリティーとは？原理は？

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農薬スクリーニングへの適用

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漢⽅薬中の異性体分析例

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アレルゲン成分探索と定量分析

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アレルゲンの分類 アレルゲンの分類 EU EU でのでの主要主要1414品目品目グルテン、甲殻類、軟体動物、卵、⿂、ピーナッツ、ナッツ、⼤⾖、ミルク、セロリ、マスタード、ゴマ、ハウチワマメと⼆酸化硫⻩を含有している穀類 ( t l l >10 /k 10 /lit d SO )

(at levels >10mg/kg or 10 mg/litre, expressed as SO₂)

ELISA

全タンパクまたはペプチド認識ベースの 現⾏の⽅法 装置の複雑さとコスト 高 _IgG抗体法

PCR

アレルギー性のタンパクDNA検出

MS

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““探索段階探索段階””

Bottom

Bottom--up proteomic based approachup proteomic based approach

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Progenesis QI Progenesis QIの探索ワークフローの探索ワークフロー アライメントアライメントピーク検出同定 omics/ lipidom ics proteomi c ペプチド定量ピーク検出化合物定量デコンボリューション ©2014 Nihon Waters K.K. 37 同定タンパク定量統計解析 metabol o cs 同定統計解析 イオンモビリティーによる イオンモビリティーによる ピークキャパシティの増加 ピークキャパシティの増加 3 次元分離 保持時間 X = m/z

OVT peptide m/z 878.7726 AIANNEADAISLDGG

/

Y = 強度 Z = ドリフトタイム

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タンデム四重極によるルーチン定量への移⾏

LC LC条件条件

LC system ACQUITY UPLC I-Class

Column ACQUITY BEH300 C₁₈, 2.1 x 150

mm, 1.7 µm 40_°C

Column temp 40_°C

Solvent A Water + 0.1% formic acid

Solvent B ACN 0.1% formic acid

Injection volume 2 μl

Time

(min) (mL/min)Flow rate % A % B Curve

0.0 0.5 98 2

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ピーナッツアレルゲンの

ピーナッツアレルゲンのMRMMRM条件条件

Peptide Protein Precursor Product Cone Voltage (V) Collision Energy (eV)

930.45 25 24 1077.52 25 24 1148.55 25 24 804.35 25 28 1247.51 25 28 Arah1 N Term Arah1 C Term 688.83 786.87 DLAFPGSGEQVEK VLLEENAGGEQEER 1360.6 25 28 587.3 30 30 1219.53 30 30 1347.58 30 30 175.12 30 19 505.26 30 19 761.37 30 19 660.31 25 31 807.37 25 31 1050.46 25 31 147.11 25 18 656.35 25 18 275.17 25 18 672.35 25 18 1186.53 25 18 147.11 30 27 299 8 30 27 Arah 2 N Term Arah2 C Term1 Arah2 C Term2 Arah1 N Term Prepro

Arah3 4 Basic 543.02 547.00 695 17 SPDIYNPQAGSLK 809.95 543.02 863.57 CLQSCQQEPDDLK NLPQQCGLR CCNELNEFENNQR ANLRPCEQHLMQK ©2014 Nihon Waters K.K. 41 299.8 30 27 404.25 30 27 809.37 30 27 923.42 30 27 1181.5 30 27 473.58 25 15 695.16 25 15 750.91 25 15 376.19 30 17 475.26 30 17 590.29 30 17 653.28 25 19 781.34 25 19 878.39 25 19 553.26 Arah7.1 Arah6 Uni Arah6 1 Arah3 4 Acidic Arah3 4 Basic 695.17 767.84 582.92 489.53 SPDIYNPQAGSLK QQPEENACQFQR IMGEQEQYDSYDIR CDLDVSGGR NLPQNCGFR ミルクアレルゲンのMRM条件

Peptide Precursor_(m/z) Product_(m/z)

YLGYLEQLLR (casein S1) 423.2 529.3 634.4 658.4 634 4 771 5 634.4 771.5 634.4 934.5 VPQLEIVPNSAEER (casein S1) 527.6 802.4 790.9 779.5 790.9 802.4 790.9 1014.5 FFVAPFPEVFGK (casein S1) 692.9 465.2 692.9 676.4 692.9 920.5 692.9 991.5 ALNEINQFYQK (casein S2) 456.6 827.4 684.3 713.4 684.3 827.4 684.3 940.5 FALPQYLK (casein S2) 490.2 332.2 490.2 551.3 490.2 648.4 490.2 761.5

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卵アレルゲンのMRM条件 Peptide Precursor (m/z) Product(m/z) DILNQITKPNDVYSFSLASR (ovalbumin) 761.0 767.4 761 0 930 5 761.0 930.5 761.0 1355.7 1141.1 1355.7 GGLEPINFQTAADQAR (ovalbumin) 563.3 732.4 844.4 860.4 844.4 1007.5 844.4 1121.5 844.4 1331.7 ELINSWVESQTNGIIR (ovalbumin) 620.3 673.4 620 3 888 5 ©2014 Nihon Waters K.K. 43 620.3 888.5 930.0 1017.5 930.0 1116.6 EVVGSAEAGVDAASVSEEFR (ovalbumin) 670.3 853.4 670.3 924.4 1005.0 1110.5 1005.0 1266.6

Compound name: YLGYLEQLLR (casein S1) Correlation coefficient: r = 0.995512, r^2 = 0.991045 Calibration curve: 59440.7 * x + -3078.23 Response type: External Std, Area

Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None

Compound name: FALPQYLK (casein S2) Correlation coefficient: r = 0.996969, r^2 = 0.993948 Calibration curve: 62929.5 * x + 567.125 Response type: External Std, Area

検量線 検量線((マトリックス検量線）マトリックス検量線） Conc 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Res pons e 0 1000000 2000000 3000000 4000000 5000001

Compound name: ALNEINQFYQK (casein S2) Correlation coefficient: r = 0.995324, r^2 = 0.990670 Calibration curve: 4296.6 * x + -289.732 Response type: External Std, Area

Conc 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 R e s pons e 0 1000000 2000000 3000000 4000000 5000001

Compound name: GGLEPINFQTAADQAR (ovalbumin) Correlation coefficient: r = 0.992720, r^2 = 0.985493 Calibration curve: 26267.2 * x + -5862.54 Response type: External Std, Area

R e s p ons e 200000 300000 R e sp o n se 1000000 1500000 2000000 2500000

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Peptide Identification & Confirmation Peptide Identification & Confirmation Using ACQUITY UPLC & Xevo TQ

Using ACQUITY UPLC & Xevo TQ--SS

1. Retention time 2 Standard MRM transitions 2. Standard MRM transitions ©2014 Nihon Waters K.K. 45 測定モード 測定モード 1. 保持時間 MRM 2. 標準溶液のMRMトランジッション 3. フルスキャン(バックグラウンドモニター) トリガプダクトイオンスキン ( d i 補⾜データ 4. MRMトリガープロダクトイオンスキャン (Product ion

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MRM

MRMとフルスキャンによる分析法開発とフルスキャンによる分析法開発

 Once the most selective, and then the most sensitive MRMs have been selected for a subset of food matrices, RADAR can be used to support routine analysis

5 S1 -Ov al b u m in -EVV Ov al b u m in -GGL Ov al b u m in -DIL Ov al b u m in -EL I Casei n S 2 -FA L in S1 -2 -4 3 ©2014 Nihon Waters K.K. 47 Casei n YL G Casei n S 1 -FFV Case i VPQ Casei n S 2 AL N ₂ 1 6 Full scan MRMs PIC PICによるペプチド同定によるペプチド同定((ピーナッツピーナッツ)) ペプチドマーカー DLAFPGSGEQVEK の PICスキャン * * * * * * * * *

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PIC PICによるペプチド同定によるペプチド同定 ((ワイン中のミルクワイン中のミルク) ) サンプル:白ワイン ペプチドマーカー FFVAPFPEVFGK の PICスキャン Casein S1の検出 ©2014 Nihon Waters K.K. 49 サンプル:赤ワイン PIC PICによるペプチド同定によるペプチド同定 ((ワイン中のミルクワイン中のミルク) ) ペプチドマーカー FFVAPFPEVFGK の PICスキャン Casein S1の検出

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アレルゲン分析のまとめ アレルゲン分析のまとめ  分析法の選択? –MS分析は、アレルギー反応を引き起こす分子の存在に対して直接的に分析する手法です  MSマーカーペプチドの選択?  MSマカペプチドの選択? –食品業界における⼀般の処理⼯程である加熱、ベーキング、ローストまたは圧縮処理において、すべてのタンパク質とペプチドが安定であるというわけではありません  標準品の選択? –13Cなどでラベル化されたタンパクやペプチド  タンパク消化酵素の最適化 –MSによるタンパク質定量では、再現性があるが効率的なプロテアーゼ消化を必要とします ©2014 Nihon Waters K.K. 51 –また、マトリックス/ターゲットの組合せに応じて最適化が必要です イオンモビリティー分離のメリット イオンモビリティー分離のメリット  ピークキャパシティの増加 –サンプルからより多くの情報 –チャージによる分離チャージの位置による分離形とサイズによる分離チャジによる分離, チャジの位置による分離, 形とサイズによる分離 o 同じm/z (アイソマー, エピマー)の分離  CCS はǺ2_{で⽰す物理的な値を⽰す。} –クロマトグラフィーの保持時間とは独⽴した値  スペクトルを分け、クリーンなスペクトルを提⽰分提⽰ –構造の解明を簡単にする

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APGC APGC

Watersブース展示パネル

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イオンモビリティーとは？ 原理は？

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農薬スクリーニングへの適用

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漢⽅薬中の異性体分析例

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アレルゲン成分探索と定量分析

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イオンモビリティーとは？ 原理は？

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農薬スクリーニングへの適用

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漢⽅薬中の異性体分析例

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アレルゲン成分探索と定量分析

イオンモビリティーセパレーション(IMS)とは？

化合物の大きさ(サイズ)により分離するモード

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イオンモビリティーとは？ 原理は？

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農薬スクリーニングへの適用

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アレルゲン成分探索と定量分析

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農薬スクリーニングへの適用

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漢⽅薬中の異性体分析例

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アレルゲン成分探索と定量分析

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イオンモビリティーとは？ 原理は？

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農薬スクリーニングへの適用

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漢⽅薬中の異性体分析例

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アレルゲン成分探索と定量分析

ELISA

PCR

MS

イオンモビリティーとは？原理は？

イオンモビリティーとは？原理は？

イオンモビリティーとは？原理は？

イオンモビリティーとは？原理は？

イオンモビリティーとは？原理は？