Vol. 140, No. 4 YAKUGAKU ZASSHI 140, (2020) 485 Symposium Review 遺伝子ネットワーク解析による分子パスウェイ解明及び AOP 開発状況について 田邊思帆里,,a 広瀬明彦, a Maurice Whelan, b 山田隆

a_{国立医薬品食品衛生研究所安全性生物試験研究セン} ター安全性予測評価部（〒2109501 川崎市川崎区殿町 32526），b_{欧州委員会 Joint Research Centre (JRC)} (Via Enrico Fermi, 2749, I21027 Ispra VA, Italy） e-mail: stanabe＠nihs.go.jp

本総説は，日本薬学会第 139 年会シンポジウム S52 で 発表した内容を中心に記述したものである．

2020 The Pharmaceutical Society of Japan

―Symposium Review―

遺伝子ネットワーク解析による分子パスウェイ解明及び AOP 開発状況について

田邊思帆里，,a _{広瀬明彦，}a _{Maurice Whelan,}b _山田隆志a

Molecular Pathway and AOP Development Using Gene Network Analysis

a_{Division of Risk Assessment, Center for Biological Safety and Research, National Institute of Health Sciences;} 32526 Tonomachi, Kawasaki-ku, Kawasaki 2109501, Japan: andb_{European Commission,}

Joint Research Centre (JRC); Via Enrico Fermi, 2749, I21027 Ispra VA, Italy. (Received August 1, 2019)

The Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) has initiated the adverse outcome path-way(AOP) Development Program in which the concept of AOP is applied to evaluate the safety of molecules such as chemicals. This program aims to assist regulatory needs and construct a knowledge base by accumulating AOP case stud-ies. AOP consists of a molecular initiating event(MIE) as the initiating event of the pathway; key events (KEs) as the events themselves, such as cellular-molecular interactions; and adverse outcome(AO), such as signaling transduction-induced toxicity, as adverse events. KEs are extracted as important events at various levels, such as the molecular, cellu-lar, tissue, organ, individual, and species levels; measurement of KEs and key event relationships(KERs), including mechanisms, plausibility, species diŠerences, and empirical support information, are gathered. The development status of the AOP relating to histone deacetylase inhibition-induced testicular toxicity, currently being reviewed by the OECD, has been introduced. The AOP describing malignancies by Wnt ligand stimulation and Wnt signaling activation using gene expression network analysis-based mechanisms in molecular pathway elucidation has been suggested.

Key words―adverse eŠect; adverse outcome pathway (AOP); gene molecular network pathway; Organisation for Economic Co-operation and Development(OECD)

1. はじめに

化学物質等の有害性評価に関連して，経済協力開 発機構（Organisation for Economic Co-operation

and Development; OECD）では有害性発現経路

（adverse outcome pathway; AOP）の概念に基づい た統合的評価手法が検討されており，事例集積によ る知識ベース構築による行政判断支援を目的とした

AOP開発プログラムが進行している．AOP は，当

該パスウェイの開始イベントとしての分子開始イベ ント（molecular initiating event; MIE）及びその後 に惹起される細胞内分子相互作用等を示す主要イベ ント（key event; KE），並びにシグナルパスウェイ により引き起こされる毒性等の有害作用を示す有害

性発現（adverse outcome; AO）から構成されてい る ．1)_{今 回 ， わ れ わ れ が 提 案 し ， OECD に て レ} ビ ュ ー 中 の ヒ ス ト ン 脱 ア セ チ ル 化 酵 素 （ histone deacetylase; HDAC）阻害による精巣毒性発現機構 に関する AOP の開発状況，並びに作成中の Wnt リガンド刺激及び Wnt シグナル活性化によるがん 悪性化機構の AOP に関連する遺伝子発現ネット ワーク解析による分子パスウェイ解明に関して，メ カニズム等を説明して AOP 構築の実際を紹介する． 2. AOP の構成について 生 体 内 に お け る 有 害 性 発 現 パ ス ウ ェ イ で あ る AOP は，パスウェイの開始点である MIE，パス ウェイの中間イベントである KE，パスウェイの有 害性発現を表す AO から構成される．知見に基づ き，分子レベル，細胞レベル，組織レベル，臓器レ ベル，個体レベル，種レベルのそれぞれの階層にお いて重要な事象を KE として抽出し，KE の測定法，

KE間の関連性（KE relationship; KER）やその妥

田邊思帆里 国立医薬品食品衛生研究所安全性生物 試験研究センター 安全性予測評価部 主 任研究官．2005 年東京大学大学院薬学 系研究科博士課程修了．薬学博士．が ん及び幹細胞の遺伝子発現分子ネット ワ ー ク 研 究 並 び に OECD に お け る AOP 研究開発を進め，国際共同研究等 に参画．日本再生医療学会代議員，レ ギュラトリーサイエンス学会評議員， 複数 Journal の Editor, Reviewerを務 める．

Table 1. Terms Related to AOP1)

Term Meaning

Molecular initiating event (MIE)

（分子開始イベント)

A specialised type of key event that represents the initial point of chemical/stressor interaction at the molecular level within the organism that results in a perturbation that starts the AOP.

（AOP の開始点となり得る，化学物質／ストレッサー等の分子の分子レベルの分子相互作用開始点と しての KE)

Key event (KE) （主要イベント)

A change in biological or physiological state that is both measurable and essential to the progression of a deˆned biological perturbation leading to a speciˆc adverse outcome.

（特定の有害性発現 AO へ至る規定された生物学的摂動の促進において重要かつ測定可能な，生物学 的又は物理学的状態の変化)

Key event relationship (KER)

（KE 関連性，KE 間の関 連性)

A scientiˆcally-based relationship that connects one key event to another, deˆnes a causal and predictive relationship between the upstream and downstream event, and thereby facilitates inference or extrapola-tion of the state of the downstream key event from the known, measured, or predicted state of the upstream key event.

（KE 間を接続する科学的ベースの関連性であり，上流イベント及び下流イベント間の因果関係及び予 測され得る関連性として定義される．したがって，KER は，既知又は測定可能，若しくは予測され 得る場合の，上流 KE から下流 KE の状態の推論又は外挿を促進するものである)

Adverse outcome (AO) （有害性発現)

A specialised type of key event that is generally accepted as being of regulatory signiˆcance on the basis of correspondence to an established protection goal or equivalence to an apical endpoint in an accepted regulatory guideline toxicity test.

（既に確立された保護目的に相当する，若しくは承認された行政ガイドラインの毒性試験のエンドポ イントと同等の，レギュラトリー的な重要性が一般的にみとめられている KE)

する．1)

AOP 構成における関連用語を Table 1 に，KER を立証するエビデンスに関する用語を Table 2 に示 す．1)_{本用語及びその説明は OECD の AOP に関す} る Users' Handbook に掲載されている英語原文を 示し，仮訳として一部意訳した日本語を示したもの であるため，原文を参照して頂きたい．1) ま た ， AOP 開 発 状 況 に 関 し て ， International Council on Animal Protection in OECD Programmes （ICAPO）による AOP-Wiki Informal Landscape

Surveyのデータを基に AOP のエンドポイントをま とめたので参照されたい（Fig. 1）．なお，本デー タは 2018 年時点のものであり，総 AOP 数は 221 となっているが，2019 年 6 月 14 日現在で AOP-Wiki に登録されている AOP 数は 300 となってい る．OECD に提案中の AOP 等が今後も登録される ものと思われる． 3. HDAC に関する AOP の開発状況

われわれは，AOP212: Histone deacetylase inhibi-tion leading to testicular toxicity として，HDAC 阻 害 か ら 精 巣 毒 性 へ と 至 る AOP を 開 発 し て い る （Fig. 2）．現在，本 AOP は内部レビューが終了

し，今後外部レビューに進むことが決定している． 一般的に，内部レビューは OECD 分子スクリーニ ング及びトキシコゲノミクス拡大顧問委員会（Ex-tended Advisory Group on Molecular Screening and Toxicogenomics; EAGMST）メンバーにより AOP 構成等の全体的な枠組みや記載事項の妥当性等が審 査され，外部レビューにおいては AOP の MIE や 各 KE の分子機構・毒性等の内容に関連する専門家 により審査されることになっている．場合によって は，内部レビューにより外部レビューに相当する内 容が審査されるケースも考えられる．本 AOP は HDAC 阻害により細胞内のヒストンアセチル化が 亢進し，p21（cyclin dependent kinase inhibitor 1A;

Table 2. Terms for Supporting the Evidence of KER1)

Term Explanation

Stressor （ストレッサー)

Chemical names selected from established chemical ontologies, chemical categories (groups of chemicals with deˆned structural features known to trigger the MIE), and non-chemical stressors such as genetic or environmental factors. （既存の化学物質オントロジーから選択された化学物質，又は，MIE を誘導することが知られている 構造的特徴で定義される化学物質カテゴリー，若しくは遺伝因子又は環境因子等の非化学物質スト レッサー) Biological Plausibility （生物学的妥当性)

The biological rationale for a connection between KEupstream and KEdownstream. （上流 KE と下流 KE の間のリンクに関する生物学的合理性)

Empirical Evidence （実証的エビデンス)

Speciˆc evidence that supports the idea that a change in the upstream KE will lead to, or is associated with, a subsequent change in the downstream KE, assuming the perturbation of KEupstream is su‹cient. （上流 KE の摂動が十分と仮定した場合に，上流 KE の変化がその後の下流 KE の変化をもたらす，若

しくは関連する，とする考えを支持する特定のエビデンス)

Dose Concordance （用量反応性の一致性)

In the case of dose-response concordance, the aim is not to show dose-dependence of a single KE in the pair, but rather to establish that KEupstream is generally impacted at doses (or stressor severities) equal to or lower than those at which KEdownstream is impacted.

（この場合の用量反応性の一致性においては，単独 KE 間の用量依存性を示すことは目的ではなく， むしろ，下流 KE に影響する用量以下の用量等において，一般的に上流 KE が影響されることを示す ことが目的であるとされる)

Temporal Concordance （時系列の一致性)

In the case of temporal concordance, it is desirable to assemble evidence showing that eŠects on KE upstream are observed earlier in a time-course than eŠects on the downstream KE.

（この場合の時系列の一致性においては，上流 KE の効果が下流 KE の効果よりも時系列的に早期に 観察されることを示すエビデンスを収集することが望まれる)

Incidence Concordance （発現の一致性)

In the case of incidence concordance, evidence should be assembled that addresses whether, at an equiva-lent dose or stressor severity, KEupstream occurs more frequently than KEdownstream.

（この場合の発現の一致性においては，等量の用量若しくはストレッサーの程度において，上流 KE が下流 KE よりも高頻度に生じるかどうかを示すエビデンスを収集する)

Fig. 1. AOP Status

Endpoints based on AOP-Wiki Informal Landscape Survey, compiled by International Council on Animal Protection in OECD Programme (ICAPO). (Color ˆgure can be accessed in the online version.)

Fig. 2. AOP212: Histone Deacetylase Inhibition Leading to Testicular Toxicity

Fig. 3. AOP298: Wnt Ligand Stimulation and Wnt Signaling Activation Lead to Cancer Malignancy

CDKN1A）発現の上昇及び細胞周期異常を介して アポトーシスを惹起することにより，精細胞枯渇に よる精巣毒性に至るものである．2)_{HDAC 阻害剤は} 抗がん剤としても用いられていることから，その精 巣における有害作用を予測する上で，本 AOP は一 助となるものと考えられる．3) 4. Wntシグナルに関する AOP の構築に関して

また，現在，AOP298: Wnt ligand stimulation and Wnt signaling activation lead to cancer malignancyと して，Wnt リガンド刺激による Wnt シグナル活性

化からがんの悪性化に至る AOP を開発している （Fig. 3）．細胞において，Wnt リガンドにより細胞 膜受容体である Frizzled Receptor が活性化され， GSK3beta の 不 活 性 化 ， beta-catenin の 活 性 化 ， Snail, Zeb, Twist に 代 表 さ れ る 上 皮 間 葉 転 換 （ epithelial-mesenchymal transition; EMT ） 関 連 転

写因子活性化を介して EMT が誘導される．48)_がん 幹細胞のポピュレーションは EMT 的な性質を呈す ることが知られており，がんの悪性化において， EMT は重要な役割を果たしているものと考えられ て い る ．48)_{本 AOP は 2018 年 12 月 の OECD} EAGMST電話会議において提案が承認され，今後 パイロットスタディーとして新たな取り組みである コーチングシステムにより開発が進むものと思われ る． 5. おわりに 現在 300 を超える膨大な数の AOP が開発されて おり，今後レギュラトリー応用を目指して益々の発 展が期待される．各国が開発中の AOP に関して， レビューワーが不足しており，通常の論文査読にも 増して複雑な内容を審査する必要があり，その人材 育成とレビューシステムの改善が望まれるところで ある． 謝辞 本研究を遂行するにあたり，御協力賜っ

た OECD EAGMST 及び Working Party on Hazard Assessment（WPHA）のメンバー，特に，Gladys Ouedraogo 氏 ， Dan Villeneuve 氏 ， Jason O'Brien 氏，Ye Lin Jun 氏，Nathalie Delrue 氏，Christina Quaglio氏，Rex FitzGerald 氏，Magdalini Sachana 氏 ， Hristo Aladjov 氏 ， Clemens Wittwehr 氏 ， Mirjam Luijten氏 ， Masaaki Tsukano 氏 に 感 謝 致 します．また，論文作成時に助言及びデータ解析 等，多大な御協力を賜りました国立がん研究セン ター研究所 佐々木博己先生，青柳一彦先生，小松 将之先生，神戸大学 横崎 宏先生，大阪大学 川端 猛先生に感謝申し上げます． 利益相反 開示すべき利益相反はない． REFERENCES

1) Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD). ``Users' Handbook Supplement to the Guidance Document for Developing and Assessing Adverse Outcome Pathways,'' OECD Series on Adverse Out-come Pathways, No. 1, OECD Publishing, Paris, 2018:〈https://doi.org/10.1787/5jlv1m 9d1g32-en〉, cited 28 August, 2019.

2) Yamazoe Y., Yamada T., Mitsumori K.,Food Safety, 3, 92107 (2015).

3) Damaskos C., Garmpis N., Valsami S., Kon-tos M., Spartalis E., Kalampokas T., Kalam-pokas E., Athanasiou A., Moris D., Daskalopoulou A., Davakis S., Tsourou‰is G., Kontzoglou K., Perrea D., Nikiteas N., Dimitroulis D., Anticancer Res., 37, 3546 (2017).

4) Clevers H., Nusse R., Cell, 149, 11921205 (2012).

5) Tanabe S., Aoyagi K., Yokozaki H., Sasaki H.,Int. J. Oncol., 44, 19551970 (2014). 6) Tanabe S., Aoyagi K., Yokozaki H., Sasaki

H.,World J. Stem Cells, 7, 208222 (2015). 7) Tanabe S., Komatsu M., Aoyagi K., Yokozaki

H., Sasaki H., Transl. Gastrointest. Cancer, 4, 258264 (2015).

8) Tanabe S., Kawabata T., Aoyagi K., Yokozaki H., Sasaki H.,World J. Stem Cells, 8, 384395(2016).