PowerPoint プレゼンテーション

(1)

応用微生物学

(2)

NADH生成 ATP消費 ATP消費 NADH消費 NADH消費 ATP生成 ATP生成

(3)

講義内容

１．生産菌と有機酸の種類

２．具体例（学問的レベルのものも含む）

（２－１）酢酸

（２－２）乳酸

（２－３）クエン酸

（２－４）コハク酸

（２－５）イタコン酸

（２－６）３－ヒドロキシプロピオン酸

(4)

酢酸

バクテリア

Acetobacter pasteurianus

Acetobacter xylinum

Moollera thermoacetica

乳酸

バクテリア

Lactobacillus

Bifidobacterium

クエン酸

カビ

Aspergillus niger

コハク酸

バクテリア

Escherichia coli（遺伝子改変株）

Actinobacillus succinogenes

Corynebacterium glutamicum（遺伝子改変株）

イタコン酸

カビ

Aspergillus terreus

プロピオン酸

Propionibacterium

(5)

酢酸

バクテリア

Acetobacter pasteurianus

Acetobacter xylinum

Moollera thermoacetica

乳酸

バクテリア

Lactobacillus

Bifidobacterium

クエン酸

カビ

Aspergillus niger

コハク酸

バクテリア

Escherichia coli（遺伝子改変株）

Actinobacillus succinogenes

Corynebacterium glutamicum（遺伝子改変株）

イタコン酸

カビ

Aspergillus terreus

プロピオン酸

Propionibacterium

(6)

酢酸

バクテリア

Acetobacter pasteurianus

Acetobacter xylinum

Moollera thermoacetica

乳酸

バクテリア

Lactobacillus

Bifidobacterium

クエン酸

カビ

Aspergillus niger

コハク酸

バクテリア

Escherichia coli（遺伝子改変株）

Actinobacillus succinogenes

Corynebacterium glutamicum（遺伝子改変株）

イタコン酸

カビ

Aspergillus terreus

プロピオン酸

Propionibacterium

http://enfo.agt.bme.hu/drupal/en/node/2134

(7)

酢酸

バクテリア

Acetobacter pasteurianus

Acetobacter xylinum

Moollera thermoacetica

乳酸

バクテリア

Lactobacillus

Bifidobacterium

クエン酸

カビ

Aspergillus niger

コハク酸

バクテリア

Escherichia coli（遺伝子改変株）

Actinobacillus succinogenes

Corynebacterium glutamicum（遺伝子改変株）

イタコン酸

カビ

Aspergillus terreus

プロピオン酸

Propionibacterium

http://www.visualphotos.com/image/1x5065821/bifidobacterium_bifidum

(8)

酢酸

バクテリア

Acetobacter pasteurianus

Acetobacter xylinum

Moollera thermoacetica

乳酸

バクテリア

Lactobacillus

Bifidobacterium

クエン酸

カビ

Aspergillus niger

コハク酸

バクテリア

Escherichia coli（遺伝子改変株）

Actinobacillus succinogenes

Corynebacterium glutamicum（遺伝子改変株）

イタコン酸

カビ

Aspergillus terreus

プロピオン酸

Propionibacterium

(9)

講義内容

１．生産菌と有機酸の種類

２．具体例（学問的レベルのものも含む）

（２－１）酢酸

（２－２）乳酸

（２－３）クエン酸

（２－４）コハク酸

（２－５）イタコン酸

（２－６）３－ヒドロキシプロピオン酸

(10)

酢酸菌

酢酸菌属(

Acetobacter

)細菌の一群．グラム陰性，偏性

好気性の桿菌で，しばしば鎖状に連なり，非運動性．

２～11％の酢酸による強酸性のもとでアルコールを

酸化できる点で，近縁のシュードモナス属菌と区別され

る．酢酸･グルコン酸･ソルボースの製造など，発酵工業

に重要．代表種は

Acetobacter aceti

．

[株式会社岩波書店岩波生物学辞典第４版]

(11)

(12)

ピロロキノリンキノン［英pyrrolo‐quinoline quinone］ PQQと略記．4,5‐ジヒドロ‐4,5‐ジオキソ‐1Ｈ‐ピロロ［2,3‐ｆ］キノリン‐2,7,9‐トリカルボン酸の略称．キノン補酵素の一つ．還元型はPQQH２と表される．NAD,FADに次ぐ第三の酸化還元補酵素として1979年に構造決定された．発見当初はメトキサチンともよばれた．メタンおよびメタノール資化菌，酢酸菌などのアルコールデヒドロゲナーゼ(メタノール デヒドロゲナーゼ)およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ，PseudomonasやAcinetobacterのグルコースデヒドロゲナー ゼなどの非共有結合型補酵素として働く．酵素との結合にはCa２＋_{が必要(他の二価金属イオンでも代替可)とされ} る．PQQの検出･定量にはグルコースデヒドロゲナーゼのアポ酵素が用いられる．また，アルカリ溶液中でグリシン ‐ニトロブルーテトラゾリウム塩を用いる染色法でも検出される．モル吸光係数ε２４９ｎｍは18400M－１･cm－１．酸化還元電位(PQQ／PQQH２)は＋90mV(pH7.0).PQQの生合成には少なくとも６個の遺伝子が関与し，チロシンとグルタミン酸が縮合して環化と酸化を受けると考えられているが，詳細な生合成経路は不明． [株式会社岩波書店岩波生物学辞典第４版]

(13)

(14)

http://iio-jozo.livedoor.biz/archives/50045696.html

http://nadachemistry.web.fc2.co

m/bunkasai/2012/2012-11.pdf

(15)

(16)

伝統的発酵食品製造の特徴

●衛生的作業以外の無菌操作を、積極的には行わない

●複数の微生物による機能を統合的に利用

●微生物機能の安定的な発現を、方向性を持って達成

伝統的発酵食品製造

＝

集団微生物による物質変換

過程解析のモデル系

●培養法による解析

●分子生物学的手法による解析

●上記解析結果を統合した、多面的解析

(17)

伝統的発酵食品製造

（集団微生物による物質変換過程解析のモデル系）

酢

に着目。その理由。

●食酢には伝統がある（塩と共に最古の調味料である）

●食酢醸造現場には発酵的多様性がある

（固体表面 [菌膜] と液内の２つの部位が存在する）

●目的産物が明快である（モデル系として適する）

(18)

食酢の分類

品質表示基準による分類

発酵法による分類

醸造酢

穀物酢

米酢

米黒酢

大麦黒酢

果実酢

りんご酢

ぶどう酢

合成酢

表面発酵法

深部発酵法

固定化発酵法

固体発酵法

米黒酢と

穀物酢

の醸造過程を解析

(19)

醸造酢のうち、原材料として１種又は２種以上の穀類

（酒かす等の加工品を含む）を使用したもので、その使

用総量が醸造酢１Ｌにつき４０ｇ以上であるものをいう。

(20)

粕酢製造過程

酒粕を熟成、湯を加えた後に固形分を取り除く

種酢・アルコールを添加し、酸度を約

1.5%、

エタノール濃度を約6%に調整

酢酸菌膜を浮かべ、

2～3ヶ月間静置

酢酸発酵完了後、熟成

↓

(21)

0

200

400

600

800 1000

1200

1400

0

7

14

21

28

35

42 mM

0

200

400

600

800 1000

0

7

14

21

28

35

42 mM

酢酸

エタノール

乳酸

グルコース

発酵液のパラメータの変遷

Time(Day)

エタノールから酢酸への変換が定常的に行われている

乳酸の濃度が米黒酢

(Max 150 mM) に比べ低い値で推移

(22)

DGGE法

Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE; 変性剤濃度勾配ゲル電気泳動) 法は，同じ長さの二本鎖DNA断片を塩基配列の違いに基づいて分離する電気泳動法である．この特徴を利用して，遺伝子の変異の検出や微生物群集構造解析など，DNA多型の解析をすることができる．尿素やホルムアミドなどの変性剤により二本鎖DNAは解離して一本鎖となる．変性剤に対する二本鎖の安定性はその塩基配列によって異なり，GC塩基含量が多い領域ほど安定性が高い（解離しにくい）．そこでDGGEに用いるDNA断片にはGC塩基含量に富んだDNA（GCクランプ）を付加し，完全に一本鎖に解離することを防ぐ．また，ポリアクリルアミドゲルには低濃度から高濃度の勾配がついた変性剤が含まれる．この変性剤濃度勾配ゲルを用いてGCクランプを付加した二本鎖DNA断片を泳動すると，ゲル上の一定の位置で二本鎖DNAの一部が解離するために泳動速度が落ち，移動しなくなる．DNA断片の塩基配列が違うと，解離の起こる変性剤濃度が異なるため，泳動の止まる位置も異なる．従って，塩基配列の異なる複数のDNA断片を同時に泳動すると，配列の異なる断片を別々のバンドとして分離することができる．同じ目的に活用されているTGGE（温度勾配ゲル電気泳動）法と比較すると，DGGE法はシャープなバンドパターンが得られるため，ゲル内における分解能の高さが特徴である．全細菌に普遍的に存在しかつ種の推定が可能な遺伝子，例えば16S rRNA遺伝子を標的としたPCR 法を組み合わせた PCR-DGGE法を用いることで，試料中のすべての細菌を対象とした群集構造解析が可能となる．電気泳動の結果得られたバンドの数は存在する細菌の種類数に相当し，泳動停止位置は細菌種に固有のものであることから，電気泳動のバンドパターンを比較することで，試料中の細菌群集構造の変化・相違を追跡することができる．

http://www.e-cew.co.jp/Microbe-contents/21dgge.html

(23)

(24)

推定された微生物種

(相同性)

①

Acetobacter pasteurianus

(100%)

②

Acetobacter pasteurianus

(98%)

③

Lactobacillus acetotolerans

(100%)

酢酸菌膜のDGGE解析（細菌）

0 1 7 14 21 28 35 42

Day

①

②

③

乳酸菌は殆ど検出されない

酢酸菌膜中の主要微生物は

A. pasteurianus

であり、

酢酸菌膜の微生物叢に大きな

変化は見られない

10 17

(25)

1.0E+02 1.0E+03 1.0E+04 1.0E+05 1.0E+06 1.0E+07

0

7

14

21

28

35

42 Time(Day)

C

F

U

/g

(p

el

li

cl

e)

GYP

MRS

GMP

酢酸菌膜中の生菌数の測定

GYP培地(主に酢酸菌)： CaCO₃を添加、クリアゾーンを形成するコロニーを計測 MRS培地(主に乳酸菌)： CaCO₃を添加、培地を重層して嫌気状態で培養し、クリアゾーンを形成するコロニーを計測 GMP培地(酵母・カビ)：抗生物質Streptomycinを添加、コロニーを計測

10

7

10

6

10

5

10

4

10

3

10

2

GYP培地のカウント数が酢酸発酵後期まで維持される

酢酸発酵の前半で、乳酸菌が多く存在

(26)

推定された微生物種

(相同性)

①

Lactobacillus

plantarum

(100%)

②

Lactobacillus brevis

(100%)

③

Lactobacillus acetotolerans

(99%)

④

Lactobacillus acetotolerans

(99%)

⑤

Lactobacillus coleohominis

(97%)

酢酸菌膜のDGGE 解析 (乳酸菌特異的なプライマーを使用)

0 1 7

10

14

17 21 28 35 42

Day

①

②

③

④

⑤

酢酸菌膜中に乳酸菌が検出された

_{酢酸発酵過程を通して菌膜中に}

_Lb.

acetotolerans

が存在している

Lb. acetotolerans

以外の乳酸菌の

菌叢に変化が見られる

(27)

DGGEプロファイル(単離株との比較)

単離株

(GYP培地)

《酢酸菌》

《乳酸菌》

Day28(

A. pasteurianus

)

A. pasteurianus

A. aceti

Gluconacetobacter xylinus

単離株

(MRS培地)

Day

◎：

Lb.acetotolerans

◎

(28)

培養法と分子生物学的手法による結果の違い（特に乳酸菌）

より多面的な解析を行う必要性

分子生物学的手法により存在が示唆された菌株の単離・特性解析

定量

_PCR

存在部位・時間特異的な菌（叢）の代謝特性の変化

「穀物酢」の纏めと今後の展開

(29)

(30)

(A) Asaia sp. colonizes the gut epithelium of Anopheles sp.（はまだら蚊）, Ae.

aegypti（しまか属の蚊）, and S. titanus, establishing a specific association with the

insect epithelium（上皮細胞） mediated by an extracellular polysaccharidic matrix that surrounds Asaia sp. cells.

Crotti E et al. Appl. Environ. Microbiol. 2010;76:6963-6970

(31)

(32)

(33)

(34)

講義内容

１．生産菌と有機酸の種類

２．具体例（学問的レベルのものも含む）

（２－１）酢酸

（２－２）乳酸

（２－３）クエン酸

（２－４）コハク酸

（２－５）イタコン酸

（２－６）３－ヒドロキシプロピオン酸

(35)

(36)

(37)

(38)

マロラクティック発酵（本当は、呼吸とよぶべき）：酵

母がおこなうアルコール発酵に対して、こちらの主役

は乳酸菌です。主な葡萄由来の有機酸は、酒石酸と

リンゴ酸ですが、マロラクティック発酵は、このうちの

リンゴ酸が乳酸菌によって、乳酸と炭酸ガスに分解さ

れるものです。リンゴ酸はMalic acid、乳酸はLactic

acidなのでMalo-Lactic Fermentation、略してＭＬＦな

どとも呼ばれます。

この発酵による効果は、

ワイン

の酸味が柔らかくな

ることです。（乳酸はリンゴ酸よりも、酸味が弱く穏や

か。）また発酵中に、いくつかの副産物が生成され、

香味がより複雑になります（その結果、フレッシュさは

一部失われる）。

さらに微生物的に不安定な（つまり微生物に「食べ

られやすい」）リンゴ酸がなくなるため、

ワイン

の微生

物安定性が増します。

http://www.kikkoman.co.jp/manns/story/dictionary/dekiru.html

(39)

マロラクティック発酵(はっこう)酵母がおこなうアル

コール発酵に対して、こちらの主役は乳酸菌です。主

な葡萄由来の有機酸は、酒石酸とリンゴ酸ですが、

マロラクティック発酵は、このうちのリンゴ酸が乳酸菌

によって、乳酸と炭酸ガスに分解されるものです。

リンゴ酸はMalic acid、乳酸はLactic

acidなのでMalo-Lactic Fermentation、略してＭＬＦなどとも呼ばれます。

この発酵による効果は、ワインの酸味が柔らかくな

ることです。（乳酸はリンゴ酸よりも、酸味が弱く穏や

か。）また発酵中に、いくつかの副産物が生成され、

香味がより複雑になります（その結果、フレッシュさは

一部失われる）。

さらに微生物的に不安定な（つまり微生物に「食べ

られやすい」）リンゴ酸がなくなるため、ワインの微生

物安定性が増します。

http://www.kikkoman.co.jp/manns/story/dictionary/dekiru.html

(40)

(41)

(42)

講義内容

１．生産菌と有機酸の種類

２．具体例（学問的レベルのものも含む）

（２－１）酢酸

（２－２）乳酸

（２－３）クエン酸

（２－４）コハク酸

（２－５）イタコン酸

（２－６）３－ヒドロキシプロピオン酸

(43)

１．Fast uptake of glucose based on simple diffusion.

２．Unrestricted metabolic flow through glycolysis, making

precursors for synthesis of TCA cycle intermediates readily available.

３．Uncoupled NADH re-oxidation resulting in lower levels of ATP

and therefore decreased anabolic reactions.

Three main metabolic events that replenish TCA

(44)

講義内容

１．生産菌と有機酸の種類

２．具体例（学問的レベルのものも含む）

（２－１）酢酸

（２－２）乳酸

（２－３）クエン酸

（２－４）コハク酸

（２－５）イタコン酸

（２－６）３－ヒドロキシプロピオン酸

(45)

The two-component ArcAB system consists of themembrane-associated sensor kinaseArcB and the cytoplasmic response regulator ArcA (Figure2A). ArcB has three cytoplasmic domains

(H1,D1,andH2) and two transmembrane. Phosphorylation of H1 is inhibited by oxidized quinones within the cytoplasmic membrane and stimulated by lactate, acetate, and pyruvate. Phosphorylation of H1 leads via several steps to formation of phosphorylated ArcA. This modified protein regulates the expression of numerous genes involved in energy metabolism. It represses genes contributing to respiration and activates those involved in fermentation. For example, the TCA cycle, almost exclusively contributing to anabolic reactions under anoxic conditions, is upregulated in an arcA deletion strain during

nitrate respiration. Therefore, Pettinarietal. (2008) suggested that arcA deletion strains could be

promising candidates for the production of

reduced bioproducts like polyhydroxyalkanoates. The rationale behind this assumption is that the upregulation of citric acid cycle enzymes under anoxic conditions could potentially lead to elevated concentrations of NADH or NADPH. Beside the above described functions, the ArcAB system is also involved in aerobic hydrogen peroxide resistance and microaerobic redox regulation.