酵母によるL-アスパラギン酸の生成に関する研究
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(2) 1 1 6. 近 畿 大 学 農 学 部 紀 要. 第. 5号. ( 1972). 触媒 し, この反応が可逆的に進行 す るこ とを D2 0 を用 いて確 認 し,W.R.WI LLI MSら2 )は Ene lro-. b ace lraerogenesか らえられた aspara t se の分子量は 1 800 ,00であ り,最適 pH は 8. 5であっ た と報告 しているO また R.. H.DEP. UEら 3)は Es ce h rc. ihi. aco. L lか らえられた aspara t seにおい て - SH 基 が フマ ー ル酸 か らア スパ ラ ギ ン酸 の 生 成 に 直接 関係 を持 たないこ とを指摘 し,F. B･RUDOLPH4 ) らは. GHT 5) ら Escherc ihi acoL i の aspara t se につ いて, また RID･HAI. t se につ いて報告 しているo T.F.EMERY6) は Bace lru lr nC aa d vers i を用 い て, も aspara NH2 0H とフマール酸 とか らア スパ ラギン酸が生成す る反応 を aspara t se が触媒す ることを認め. ている｡ アスパ ラギン酸は また gua ltmae t aspara tt et ransami nase の 触媒 に よ りグル タ ミン酸 とオ キサ ロ酢酸の存在 において生成 され るが, この酵素 は動物,植物,微生物 に広 く存在 し,. U.. MAI TRA7)は鼠の肝臓か らこの酵素 を 300倍以上 に精 製 し,A .NovoGRADSKY8)ら は こ の 酵素 の doxalphosphae t を必要 とす るこ とを確 かめ た｡ また C.TURANO ら 助酵素 として pyri. は. 9). - SH基指薬 の PCM Bに よ り, このア ミノ基転移 反応か顕著に阻害 され ることを認め , W.T. )は豚の心臓 よ り酵素 を精 製 し分子量 1 000であ る と報告 している｡ H.WADA ら JENKI NS10 10,. 11). は Esce h ,ih ci a col lお よび兎の肝臓か らえ られた酵素 につ いて, W.T.JENKI NS ら 1 2 )もこの doxal ,pyri doxami ne が触媒作用に関係 しているこ と 酵素の助酵素 につ いて ビタ ミン B6,pyri. を確 認 している｡ 微生物 を利用 してのア スパ ラギン酸の生成 につ いては渡辺 ら13)は直接醗酵法に よ りB, evl bac-. l er乙 um の生菌体 を用いて多量のアスパ ラギン酸が生産 され るこ とを見出 し, またそれはaspara t se 活性 と密接 な関係 を持っているという｡ また酵素的 にア スパ ラギン酸 を生産 す る方法 に aspara t se を利用 した ものがい くつかあ り,北原 ら1 4 )が Es ce h rc ihi a col iか ら aspara t se を調 整 して ア スパ ラギン酸の生成 に検 討 を加 えて可能 であることを認め ている｡ ア ミノ酸醸醇の 多 くは,代謝機構の阻害や抑制 に よ り無駄 な代謝がた くみに制御 された結果 で あ ると考 え られているが,まだ充分解明 されてお らず, また微生物 につ いて も細菌類につ いての も のの研究がほ とん どであ り酵母 に よる報告 が少 ない｡ 本報文 は酵母 に よるア ミノ酸生成の一端 を. h romycescerevI Sl ae を用 い, アスパ ラギン酸の生成 につ いて検索 し,二 知 る目的で Sacca 三の知見 をえたので報告す る｡. Ⅰ Ⅰ 実. 験. 方. 法. h romycescerevI Si ae Hansen を用 い,前培養の培 地組成は, NaHPO 2 ｡ 供試菌 には Sacca SO.0.. 5g,. MgSO｡0. 5g,FeSO40. 20. 01g,酵母 エキス0. 01gを基本培地 1. 01g,CaCl 0g,K2. 組成 とし, それに gu lcos. e 50g,( . NH4 ) 2 SO.20g . を添加 し pH6. 8,蒸溜水 12に して培養液. . t '.
(3) 鎌E E l 秀郎. :酵母 に よる L-ア スパ ラキン酸 の生成 に関す る研究. 1 1 7. 5. を調整 した｡ それに酵母 を接種 して3 ℃ で 4 日間振 とう培養 した後,無菌 的条件下 で培養 液 を遠. pH 7. . 0)で 3回洗浄 した もの をM/ 5トリス緩衝 液 に 心分離 して菌体 をあつめ ,M/5ト1 )ス緩衝 液 ( 0 0ml とした｡ 懸濁 させ て 1 pH とアスパ ラギン酸 の生成 の関係 につ いては, pH4. 0クエ ン酸緩衝 液 ( Mc 1 1･ 0- 60 . までは M/1 van ie 氏緩衝 液 )に よ りお こない,pH 6.. 5- 8.. 5まではM, 5トリス緩衝 液 に よ りお こなった｡基 0g, ( NH｡ ) 2. SO｡ 20g . を添加 し,前培養 の菌液 を接種 し前記の条件 で 本培地 に フマール酸 1.. 振 と う培養 して7 2. 時間後 の培地 中のアスパ ラギン酸 の生成量 を測定 した｡ 各種 の窒素化合物 の影響 につ いては,基本培地 に 7マー ル 酸 1.. 0gを加 えた ものに( NH. ) 2. SO.,. M添加 して3 NaNO｡,ur eaをそれぞれ 1. 0-2. 5. ℃ で振 とう培養 し,経時的に培養 液 を採取 してア スパ NH｡ SO｡を加 えた ものに,グル ラギ ン酸を定量 した｡各種 の炭素化合物 の影響 は,基本培地 に ( ) 2. コー ス, ピル ビン酸, コ- ク酸, フマー ル酸, リンゴ酸, オ キサ ロ酢酸 を 5×1 M,1 M, 0 2. 0. ー2. 5×1 0t3. M,1 0. L 3. M の各濃度 を添加 して3 5. ℃ で振 とう培養 した ものにつ いて窒素化合 物 の場合 と 同様 に してア スパ ラギ､ ン酸 を定量 した｡. oassay 法 に よった｡ ま L-ア スパ ラギ ン酸 の定量 はLeuconoso lcmese ne troi des に よるBi た, n -ブ タノール :酢酸 :水 -4 :1:1の展開液 を用 いてア ミノ酸 のペーパー クロマ トグラ フ ィー を同時にお こな ってア ミノ酸 の定性,定量 に併 用 した｡. Ⅰ 1 1 結果 および考察 アスパ ラギン酸 の生成 とpH との関係 をpH 4. . 0- 85 p . 0 . の範囲 内で検討 してみ た結果, H7. .. 5で も収量が良好 であ って最適 pH は65 において最 も多 くア スパ ラギン酸 が生成 され, pH 6,. - 7. ･ 0にあ る と考 え られ る∩ しか しアスパ ラギン酸 の生成量 は,ア スパ ラギン酸醗酵菌 であ るE. tse. , sce h rc ihi l aco iな どに比較 して少 ない｡ アスパラギン酸 の生 成に関係 してい る酵素 のaspara gua lt maea t spara tt et ransamn iase はそれ ぞれ最適 pH が 75 . , 8.. 5であ るが, ア スパ ラギン 酸 の生成の ための最適 pH は酵母 の生育 の最適 pH であ る中性 または徴酸性 に傾 いてい る｡生成 物 の量や 質は pH の変化 に最 も影響 も受 け, pH の調 整 には栄養 源 もかね た塩類 が最 も良 く, そ の他 の緩衝作 用のあ る もの, また酸, アル カ リな どが用 い られ る｡. ) 2. 0 2. 窒素 源の影響 については ( NH｡ SO4, NaNO｡,ureaを用 い,1. M添加 してア スパ ラギン酸 の生 成 を調べ た｡ アスパ ラギン酸 の生 成は2 4. 時間,4 8. 時 間 であ ま り増加 しなか ったが7 2. 時 間で著 し く. NH4 SO4≧urea>NaNO,の順 序 で効果 生成量が増 し, それ以後 も増加 の傾 向が認め られ た. ( ) 2. a は培養初期 では( NH4 SO｡, NaNO｡ にお とったが,. 7 2. 時間,9 6. 時間 では( NH｡ ) 2. S04 があ り, ure ) 2. t ama t hd o･ と類似 の傾 向 を認め たD NHrN は動物, 植物, 微 生物 に存在 してい る g lu edeyr. . iJ.
(4) 近 畿 大 学 農 学 部 紀 要. 第. 5号. (1972). 0. e q. (T EPu ) p!DeD! tJa s. me I nc ua bt i ont i. ( hr s ･ ). e c tofni t r og e Fi g. 2. Er r ns our c et ot he . Er r Fi g.1 e c tofpH t otep h r ou dc t i on pr ou dc t i onorLa s pa r t i ca c i dby ofLa s pa r t i a c c h a -. ca d by S c i Sa c c h a r omyc e sc e r e v i s i a eHa ns e n r o myc e sc e r e v i s i a eHa ns e n ge nas eや as para tse の触媒作用 に よって容易 にア ミノ酸 に同化 され るのに反 して,ur ea の場 合 にはu r eas e に よ りア ンモニアに分解 されてか ら NH4-Nと同 じ経路 で同化 されてい くため に. i t r a t d ca ts e, ereu この様 な結果が え られた もの と考 え られ る｡NaNO ｡の場 合 はNO 3-Nが まずn n i t r i t erd euca ts e な どのNO 3 -N を還 元す る一連 の酵素 の共役 で還 元 を受 けてか ら各種 のア ミ.. の活性 が低 か ったため と推察 した｡. M. 二. M. l oN Mo IJ M I. 0 7' 〇. (T. ! 2-. 0. 0. uPuJ) p!0空 U. 二. 0 2 ( T∈＼叫uJ)p. ノ酸 に同化 されてい くと考 え られてお り, この酵母 においてはNO 3-N を還 元す るこれ らの酵素. 7 !. で. 1C d s. ?J. ds? J. e. 0. 24. 48. 72. i ont I nc ua bt i me. 2 4. 9 6. ( h∫) s .. Fi g･3･ Ef f e c tofg l uc os et otep h r ou dc a s pa r. t i ca c i db t i onofL-. yS a c c ha -. ns e n r omyc e sc e r e v L ' s i a eHa. 4 8. 72. 9 6. I nc ua bt i ont i me ( hr s , ) Fi g, 4. Ef f e c torpyr u v i ca c i dt ot he pr ou dc t i onorLa s pa r t i ca c i db y S a c c h a r omyc e sc e r e v i s i a eHa ns e n. 炭素源 として グル コー ス, ピル ビン酸, コ- ク酸,フマー ル酸, リンゴ酸,オ キサ ロ酢酸 を 5×. Mまで添加 した場合 には, フマー ル酸 の添加 にお いて最 も良好 な収 量が え られ, アス. 10 2- 10 3. パ ラギン厳 の生成の ため の フマー ル酸 の最適 濃度 は 5×1 0 2∼1 0. 2M であ る｡ 各炭素化 合物. とア. スパ ラギン酸 の生成 の関係 については, グル コ-スでは 添加 量 を増す と生 成量 も増加 し5×10-2M. 4時間 ∼4 8時間 でか な り増加 し, それ以後9 6時間 まで徐 々に生 成量 で最 も多い｡ また培養 時 間が2 が増 して い くが フマー ル酸, オ キサ ロ酢酸 な ど と比較 して少 ない｡. tl.
(5) 11 9. 鎌 田秀 郎 二酵 母に よる L -ア スパ ラ ギンの生成に関す る研 究. ピル ビン酸 は用 い られ た他 の どの炭素 源 よ りもアスパ ラギ ン酸 の生 成は少 な く,効 果 があ ま り. 0 2M で生成量が最 も多 くそれ よ り添加 量 を増す とアスパ ラギ ン酸 の生成が抑制 認め られ ない｡1 され た｡ M. 二. Jぎ. M. o∼M oー M X oXo. u J仙u) p !oc D!. (T. 二. 0. 2 (u T. 20. 0. )p ! ,". s?J. d s?J. tlC. !) , a. 0. ｡L# 24. 4 8. 72. 2 4. 9 6. 4 8. 7 2. 9 6. i me( h∫) s . I nc ua bt i ont. 1 nc ubt ai ont i. me( h呈 r. ) Fi g･5･ Er r e c tors uc c ii ncac. i dt ot he s par t i ci pr ou dc t i onorLa ca dby e n S a c c h a r o myc e sc e r e v i s i a eHans. Fi g･ 6･ Ef e c u r i c i he f toffmaca dt ot pr ou d ct i onofLa s par t i ca c i dby Sa h a r o myc e sc e r e v i s i a el l a ns e n c c. コ- ク酸, フマール酸, リンゴ酸, オキサ ロ酢酸 の場合 には, ア スパ ラギン酸 の生成 と培養 時. )8 4 時間 までは徐 々に生成量が増 してい くか72時間 で顕著 に 間の関係 は グル コー スの場合 と異な ( 増加 す る｡ これ らの有機酸 はア スパ ラギン酸 の生 成過程 において グル コー ス とはか な り異な った 挙動 を してい るこ とを暗示 してい る｡ ア スパ ラギ ン酸 の生成に最 も効果 の あ ったのは フマー ル酸 であ り, コ- ク酸, オ キサ ロ酢酸, リンゴ酸 の順序 に効 果が あ り, いずれの有機酸 で も最適 濃度 0 は 5×1. 2. -1 0 2Mであ った｡. 使 用 され た炭素 源の なか で, グル コー ス, ピル ビン酸 は添加 量 を増 して もア スパ ラギン酸 の生 成 にあ ま り効 果が認め られ なか ったのは,TCA回路 に入 らず に解糖系や他 の代謝系 に よっ て分 解 され た もの と推定 され る｡. 二. 0. M M M M 0, . OJ =? lT X o Xo. 二. 2 4. 4 8. ●. ●. 7 2. 9 6. I nc ubt ai ont i me( hr s . ) Fi g･7･ Er r e c t or mac l i a c i dt ot he pr ou dc t i onorLa s pa r t i ca c i dby S a c c r omyc e sc e r e v s a eHans e n ha i i. O. 2 d. 4 8. 7 2. 9 6. I nc ubt ai ont i me( hr s . ) Fi g. 8. Ef f e c t oofoxa l oa c e t i ca c i dt ot he pr ou dc t l OnOrLa i ca dby s par t c i a c c S h a r o myc e sc e r e v i s t ' a eHans e n. またフマー ル酸 においてア スパ ラギ ン酸 の生 成 に効 果が認め られ たが, それはa spara tse. の.
(6) 1 20. J E t畿 大 L r農 学 部 紀 要. 第 5号. (1972). 触喋 に よ り生成 された もの と考 え られ る｡コ- ク酸 の添加 に よって も,か な りの生 成 を認め ,TCA 回路に 入ってフマー ル酸 に変化 し代謝 され てい ったため と推定 した. リンゴ酸 の添加 に よってはア スパ ラギン酸 の生 成が あ ま り増加せ ず, TCA 回路において リン ゴ酸- フマー ル酸 の逆 反応か進 まなか った もの と考 え られ る｡ オ キサ ロ酢酸 の添加 の場合 は フマ ー ル酸, コ- ク酸 よ りはア スパ ラギ ン酸 の生成が 少 ないが, か な りの生成か認め られ, TCA回 路 で生成 され た グル タ ミン酸 か らgu lt ama t e aspara tt etransaminase の作用 に よ り-NH2基 を転移 され てア スパ ラギン酸が生成 され た もの と推 察 した｡ すf c L L わ ち, ア スパ ラギ ン酸 の生成 は主 にaspara t se の作 用 に よって行 な わ れ るが , gua lt mae t. aspara tt et ransami nase の作用 も重要 な役割 を演 じてい るこ とが推察 され た｡. Ⅳ. 要. 約. 酵母 に よる L-ア スパ ラギン酸 の生成 につ いて検 索す るため に,Sac c har omyc esc ere vsa iie. Hansen を使用 して pH ,窒素源,炭素源 の効果 につ いて検討 した｡ . に調 整 してア スパ ラギ ン酸 の生成 を検討 した結果,最適 pH は 65 . pH の範囲 を 40 . - 85 . であ った｡ - 70 窒素 源 は (NH｡ (NH4 ) 2 urea は類似 ) 2 SO4,NaNO｡,urea を使用 し,培養時間において, SO｡, の 効 果 を示 し,NaNO ｡は ア スパ ラギ ン酸 の生成 にあ ま り効 果 が認め られ なか った0 炭素源 は グル コー ス, ピル ビン酸, コ- ク酸, フマー ル酸, リンゴ酸, オ キサ ロ酢酸 を使用 し, フマー ル酸, コ- ク酸, オキサ ロ酢酸 はアスパ ラギン酸 の生成 に効 果が認め られ た｡. t se とgua lt ma t e aspara tt e t ransami naseの作用に よ アスパ ラギン酸 の生成 は主 に aspara って行 なわれ る もの と推 察 され る｡. Ⅴ 文. 献. J. 958) 003∼1 009(1 1 ) S･ENGLARD andHC .･BREG IER : BL ' o. lChe m. ,233,1 . 967) Bi o. lChe m. ,242,2973∼2978(1 2) WI R･WI LuMS a ndDJ･LARTt CUE :J ) IBa c e r o. l,82,383J ヽ386(1 961 3) R .. H.DEPUE a ndA. G.MOAT : l i B･RUDOLH c. h Bi oce hm. BL ' o py hs . ,. 1 4. 7,92∼98(1 971 ) 4) F･ P adH n ･ J･FROMM :Ar "83,11 GHT adR n .. Y.MORIA T : 2 1 2∼10( JB .a c l e r i ol 5) R. D.HAI 962) 6) T･ ' oce hmL ' s l r y,2,1041∼1045(1963) F･EMERY :Bt 7) U. . ･DEKKER : Bi oc ht ' .e tBL ' o py hs . Ac l a ,815 , 17∼532(1 MAI TRA a ndEE 964). ' oc hi .e tBt ' o py hs . Ac l a ,81,605∼608(1 8) A. NovoGRADSKY a n. dA･MET S TER :BL 964).
(7) 鎌E E I 市郎 :酵母 に よ る L-ア スパ ラ キン根の生 成に関す る研究. 1 2 1. 9) C.TURANO , A.GI ARTOSO I I ,n adP.FASELLA :ArhB c. L ' ohm ce .Bi opy.14 h s, 0 ,2 5 4′ ヽ56 2 (9 164) 1 0) W.. T JENKI NS , DA. . YPHANTJ S ad n I. W.SI XER :JB . ilC o. he m.2 , 34,5∼ 1 57(9 15) 9 ll ) H. WADA adEE n ..SNELL .. J BilC o. he m.2 , 37,1 27へ12(9 ノ3 16) 2 1 2) W. T.E J NKI NS ad n I. W.SIE Z R:JB . ilC o. he m.2 , 356 ,20′ ヽ624(9 】6) 0 1 3) 渡辺 史朗,大沢岳義,信 田胤生 :農化 ,38,434-440( 1 964) 1 4) 北 原覚雄,福井作蔵,三 沢正 愛 :農化 ,34,4 4′ ヽ4 8( 1 96 0). I 且 ■ , ,.
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