タバコモザイクウイルスに対するトマト品種の抵抗性(第9報) : 遺伝子を異にするトマト栽培種のペルオキシダーゼアイソザイムパターン
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(2) 1 6. 近 地 火乍 段乍 部紀 要. Ⅰ 緒 言 1 92 8 年 KU Ci lPJn aL l mmuni z aL in ｡ -. Meh c a･ ni s msand Pr act i call mpl i cat i onsとい う衣甥 で綜 脱 を出 した' しその中 で彼 は柏物 の 免疫現 態に 徒 は誘導抵抗性 も含 ませ てい ろ-. これ. 第1 6り.H983). { )瑞 光 ( ZK)1 3よび福 ′ f2号 (2 F )J)純 T . '城 王 m稚. 苗( 横 浜 市)か / )桝 人 した, 圭[ _ ･GCR系 トマ トの 托. F は,農林 水硬省野 菜戯験喝 (三 虫舶貰濃町 )故. の横楠 を, ウ. イル ス ･細 縛 ･糸状 侍な どの病 原体 に よろすへ てJ). l. Tal be1 TomaL ( )CUt I Vr aSus e d l nti hsepr xelet mn. 植物 病 宵 に共通 した･l uの として 考察 してい る. この 免疫 の 原 関 と して. 袷 はベ ル オキ シ ターセ ( Per -. Li gni r i cat i on) oxydas e,PO) と組織 の リブ二 ン化 (. Cul l i vr as. Gee ns. GCR 2 3 7. Tm1TmI. 3 GCf ( 26. ､ Tm∩ 2 ､Tm2 -∩. GCR 2 67. Tm2 ■Tm2 -`. 動 を使用 して, 1 'ンゲ ンモ ザ イ ク 隼で.感熊 に よる. ZL J iu k. J t 2 Tm 2 Lm. I Zのf的 r ･唖的変動 が追究 され た2 ) .. GCR 5 2 6. Tm2 -′Tm2 -. に旺 目 した.. PO にはい くつかの ア イソザ イム ( J s oz ymes .J Z) があ l ),】 965年頃 か らすで に で人ふ ん ゲル巧 気泳. 野. 喝 抑綾氏 か / )分吉 井さJLi =もの で ある.. --. 赦近 にいた りア クリ/ レア ミトゲルー ' l泳動 T 3L A L によ Zの病 ' &感典 に 上る変動 が調べ られ り POI. 7 ㌧ まr. J. ユー. ホルモ ンその 他J)葬 制 に よる PO の誘串 も報 告 さLL. 2)供5tウ イル ス. タ′てコモザ 1クウ イル スの. TMV OM)をF 7 ]いL･ . これ は47 で タバ コ 普通 系 (. た7 ･ ホ ) .. 以 上を適 L :て PO J , 'よ ' }その I Zが偵均 の病 r. E感 取や薬物 処理 に 上って変動 す る実態 が くわ し く述 べ られ たが. その 変動 が なぜ起 きるの か. またその変 の とこ 動 か どうい う意味 を もっているの か は. 日 F ろ 不明 の点 か 多い. 著者 は過 伝子組成 の明 らか f J . ･トマ ト鹿培機 を用 い. ヒで継 代保存中 であ る.. 3)供 拭 携 導 薬 物 供 成 し た Ol i go l mi no Ami de ( 01 A)は Di cyanDi ami deの J冊陣で,分. F 丑 33 6= ( CN),(NHZ )2× 4 で, そ の 構 造 は. t l _ T i t-C(NH2N ) l lC ･ N と考え JJ , L. ろ. この物 質 は 中 京段 1 二 大 橋 詰教授 が 合成 された t ' の で,強 いサ イ. て ,TMV (タバ コモザ イクウイル ス)感染 お よび. トカ イニ ン活性 を もつ.本物 符 は口本特産 K l (火京. Zが どの ように変動 あ るいは事物 処理 に よ り,POI. 都中野 区)小野 的. す るか を, ア ク リI L 'ア ミ トス■ ラブゲルT l気泳動 を用. 潔氏 を経 て入 手した･ .. Bam【 ol i n,BF)はササの成 分 次にパ ンフ ォ リン (. い て調べ た. この糊 合の事物 として は, ウ イル スに. であ る糖 蛋 白質であ り. 日本制 がん研究所 ( 香 川t , q. 対 す る植物 の抵抗性 を庚申 す る物 rf であ る高分 子の. L qi d布 巾) - かJ )入手 した.. 蛋 白が 考え らJLる9 1 .抵抗性 の誘帝 を知 るため に は, 植物 を感 毅 させ､ か つ誘碍物 筋 ( l nducer )として事 物 を低物 体内 に帝 人せね ばな らない. しか し本報 で. 実験 方法. 1) トマ トの育 成 法 お よび TMV嬢積 法. トマ. 棉抑 し､数回移抽 し. は椴物 への帝 人が容 易 な もの として, もう- つの 誘. トの和 子 は バー ミクラ イ ト ヒに. 申物 可,つ ま り低分 子の化合物 を用 い る こ ととした.. て.25C,5. 0 00/ , rの的光定温横 内で育成 した. そ. その代衣 として, 低分 T ･ でサ イ トカ イニ ン活性 を も. して本 紫4-5枚程度 の 宙を実験 に供 した.肥 料 と. つ 01 i gol mi noAmi de( OI A) を選 んだ -OI . この よ. して適 宜 ( I1. 000倍 ′､イポ ネックスを与えた.. うに して抵抗性 誘串 の上 で PO の 果たす役割 につい て多少の 考繁 を加 えたの で, ここに報告す る.. TMVの接機 は純 化 TMV ( 0.-02 1 . JI J g m/ )を 用 い.こLLに 6 00メッシュの カー ボ ラ ンダム ( 0. 2JT 1 7 t l )をJ J Pえた. この液 を トマ ト苗. 日. 実 験 材 料 お よ U実 等 粂方 法. 後 に流水 で カー ボラ ンダム を洗 いJ jとした.. 実験材料. 1) トマ ト栽培穫. の爪上 薬を除 いて. ト紫の 各先端築 片 に締席捲威 し, その 底 次の 2枚 の′. 供よ し1 =トマ ト扱培唖 お よ. びその遺 伝子組 成 は Tab] elの ようであ る. この う. 2) ス ラブゲ ル電気泳動 の方法. その詳細 はす. でに述 べ r= 川 か,主 要 な条件 を略記 す る と次の よう. ◆G L Tf l HFの略号をE目 t押 ' = _AOL77りノン沖.AF TtL f ′r ･' l y-.DF Bmo art ; n . /′1･ J/書 1 事Olt .)S A ノ //′.円 r1 '曲 r事 17 72叶.A G C ブ7ヤコ-∼.ほ hz ol m .I /1′イ=､O .t ) . _ 点B t 4 4〝 0巾l こLけろ■丸t t0^ .1 fl J†三′' ･こしP OJ ' e r oy xd甲(r J レナ十シアー t t .pJ Ol へ∼ナ十シター<-イソ･† T. I . .PYR ロd) e-t ･T . MV T如く t cm ol 洛LV arl r t J kケl コtイ[ケ1(17 . .之K.トマト瓜tJ尤 h.
(3) 平井 :タバ コモザ イクウイルスに対 す る トマ ト品種 の抵抗性 ( 第 9報). であ る.. 1 7. 溶解 して遠沈 す る と,葉緑粒 はほぼ完全 に沈殿 して 上 滑 は透明 とな る. しか し後述 す るよ うに PO活性. ス ラブゲ ル電気泳動 の条件 ス ラ ブ ゲ ル :厚 さ 1ml l t ,泳 動 プ レー ト 1 4 3×1. c m,泳動軽舟約 1 0c m, サ ンプル コウム 1 2検 体用 分稚 ゲル :1% 0 ア ク リル ア ミ ド,SDS ( s odi um. doe d cyls up lhae t) を含 まず レア ミ ド,SDSを含 まず 濃縮 ゲル :5% ア ク リ/ 泳 動 パ ッ7 7 1 :ト リ ス ･グ リ シ ンバ ッフ ァー. くH p 8 . 3 ) 試料添加 瓜 :2 0J L l穴 /. 0mA(4mA/穴),約 1 0 0mi n.ア ト定屯 流 :5 柵 密安定屯源装置 SJ 1 055A 型 に よる. 3)租 物 組 粒 か ら泳 動 駄 科 の調 製 法 ( 第 1法) 最初 Fi g.1に示 す方 法 で トマ ト茎葉 か ら泳 動 試 料 を調教 した. この方法 は トリス ･HClバ ッフ ァーに 酸化防止 剤 として メル カプ トエ タノール ( ME)お よ び キ レー ト剤 と して エ チ レ ン ジ ア ミ ン 4サ ク敢. ( E. J ). TA)を加 え, さらに試料 に並 み を与 えるため に シ ョ糖 を添加 す る.ホモ ジネー ト凍液 を 3. 5 0 0 0g で遠沈 した上 村 を と り, ミニ コン B1 5( 分子 丑1 5.. 00 0よ り低 分子 を吸着 す る)で濃播 す る. この場 合. 茎葉 をあ らか じめ氷結 す るか,苓 汁液 を一度凍結 ･. の大 部分 は薬 緑 粒 内 に あ るの で,一 度 凍結 す る と. PO の潤定 に は適 さない. そ こで本 報 ではな まの茎 葉 を直 ちに処理 した.. 4)PO反応 法. 泳 動 を終 わ った ゲ ル は と り出. して, 次の方法で PO の活性部分 を発色 させ た.. a. 01 . 〟 サ ク酸 バ ッフ ァー ( p. H4.. 5)液 にゲル 01 ni 1 7. 浸耕 す る. この間 シェー カー で振 と うす を1 る.. b.下 記の各基質 を上 記のバ ッフ ァ- に とか した 液 にゲル を移 し, シェー カーで振 と う しなが ら 1 0 桝f 乃お く. 基 質 1:0-ジ ア ニ シ ジ ン ･ジ 塩 酸 塩 ( 3, 3′ 一 dト 72 .) met di nedHC i l ,Si gma,分 子 Jt3L hoxybenzi ( DAl ' . ) ImM 同 日 :グアヤ コール ( GAC) 1% 同I l 】:ピロガ ロール ( PYR) 1% C.市販 H20,港 ( 35%)を 1% (u/u)にな るよ う上 記の液 に添加I す る.. d. I- 2mi nで反応 が現われ る. e.保 存 す る ときは, 7% サ ク軟水 に うつす. 5)デ ンシ トメーター測定 法 粟津化学 デジ タ ルデ ンシ トメー ター ( DMV-33 C)を用 い,波長 440. dSt er n Le afan. T m7で PO 各. I Zの吸光度 を測定 した.か つ各吸光度. 曲線 の面8t 積 分値 を求 め た.. genz. iewi L hamor t aa ln dp e s t ) ei5 n t i me s homo J oftef h oo H wi ngs v ou lme(Z J Ju) ou lt i on. 6)ゲ ルの写真撮影. フジカラー FI Iを用 い,. 00で透過光 に よってゲル Ki ngブライ トボ ックス 50 nkoFLの写末 を凍影 した. 7 イ ) レターは Ke W( 蛍. . 4). 2r 0 . 2M Tr i s -HCJ buf fr e ( pH7 ner ･ ME)5 0m〟.e t hl ye nedi ami ne c apo te t hanol( e L I Caci d( EDTA)2 0J s uc r os e0 . 5M l L M. tt er aac. 光 灯用) を用 いた.. l H. t er. t hr ou g. hgauz e. る こ と は す で に述 べ た が 1 2 ㌧ この う ち本 報 で は VE E CHの方法 13 lを用 いた.. 7)POの組 較化 学. これ には 3つの方 法 が あ. Exr ta ct. su f pcn :a t L r :t n U geat3 1 5 0 0g f , , or1 5mi c onc e nr tat et hr oughmi ni c onB1 5(I /1 0 ) ) ( Ami c onCor p. .ex L i nR l on.USAI El e cr topo hr e si s ne dS um F J g･1 Pr oc eu dr e fr o obt an ii ng el e cr topo hr e s l s me di u mf r om tmao一 o t e afan. ds t e mt i s s ue s ( Fit r s me t. hd o ). VEE CHの方 法 0 中性 ホルマ リンで固定 す る. a.植物組織 を 1% b.水洗. C.次の反応 軌 こ室温 ( 約2 5° C)で反応 の 見 られ る まで浸漬 す る. 反 応 液 :00 .5〟 2-N-mOr Phol i no et hanes ul f onc iaci d( MES. pH5. 0) 5 m/ .飽和塩酸ベ ン ジヂ ン 0. 1m/.H20,01 .%. 8)PO活性 の檀 物体 内 の所 在検 村 法. 前述の. よ うに P O活性 の大 部分 は葉緑粒 内部 に存在 す る と 考 え られ る.しか し Pl ae. L 12 , に も示 す よ うに,表皮 細 胞 の細胞 間隙や茎 の横 断面 では細胞壁 に近棲 して.
(4) 1 8. 滋 故 人7 艇乍 部組 曹. P O活性 が存 在す ろ こ とが組 織 化J L f的 A J に認 め / 'JLて. 耶1 6P , 日983) Lez l ran Cm dSL. い ろ. そ こで以 F I J) 検 討 を行な っr =. l aJ ア セ トンパ ウダー. ( Al l )浅. 川. 0t ralad hom叩C nz ie Wi t h; I1 1 1 n p ( 汚I I e) ' n1 0 l ･ )0 川, OIJ Iphos pa ht ebt l f t ･ me. s＼ t i ･ ( ). t um t･(L･L CI pl 1. 7 .. 2)c onann lilg 1A/h r ; I r( c L. トマ トJ) 隻. 0/ 常 を冷 ア セ トン ( 2. 〉 t l/ J I )で す r )つぶ 十. ニV)液 を. / J T )し 沌紙 で減圧 沌 過 し, 確 i l iを さ/ )に洗 勝 目5m/ て 前の 液 に加 え る.配 合液 を塊括 舷確 す る.次 で,. ( I . 5Jlシ ョ樺 を加 えL･冷 Oo .IM I )ん巌 J iッフ ァー ( pH6. 0) で乾傑 物 を抽 出 (5" 1. /l O. Omg乾域 拘 ) し, 抽 出液 を 7, 5 0 0g で 20川 / ' J 7追 沈 してその 1 ･ _ 桁を 泳動 試 料 とした.. c. 0 m i l l. sk L ･On Shakerfor 3 me r thr oughgau ?.C h a t. Fl. hr ae. l. t b) 塩 溶 出 法S T -. IM. c arx L r aCl. L. 泳動拭料 明製法 ( 第 2 法 ). NaCIを含 む 1 0倍 硫 (L P山 の ( 日 日JIりん. 17 . ( ) )で 厳 ,<L ･ /フ ァー (pI. 輩展 をす .)I).;:し. そJ)ま. 0] J L t ' , )シェー か-で振 ま沌過 せ ずに, 裳 妨汁 碑 を 3 ) ( )g･1 5 とうす る. その 後 ガ- t･ ' で沌過 し.沌液 を 5( 1 1 1 1 ' 7 日/ ) 遠 沈 にか け上納 r _ Yヒろ. 二の. し. 上納 ( =は築細 粒. Iを ミニ コ ン B1 5で約 I が 王だ 卜分伐 って い る, わ L (に渦輪 ) し. シ ョ糖 を 2 00｡( L t -t ･ )に F . L vる ように加. c enr. tI l u g. eaL5 0 ug F or2 0"LilL Sup er naa tnL c onc enr lat et hr oughmi ni c on B1 5 日/1 0 ) add s u cr os et o2 0 O o(･t t t ･ 7 El e cr LOPhor C S i s me di um. えて泳動 武 料 とした. ' )P o告 この I J 法 は. 後 に速 へ る理 由 で 憤物 体内 J. .P Oll S 一 性測 抽 出 十 るか r i ･I )良 好 な 7 1法 と 号え らjL 定 の ための泳 動 試 料 調製 の 前 2法 と し. その 詳細 を. FL g.2 Pr oc eu dr e fr o obt ann iig e l e cr Lopo hr e s I S me di um f r o. m tmaol o t e arands t e mt i s s ue s ( Se c on dmet. hd o ). Fi g. 2に示 し[ =. ( C). JJ. 細 胞 間 隙 酵 素 追 出 しの T :め の 遠 心 分 析 法 は'. 2J健 ) 全 漫態を約 トマ トF'. 一 一 一C2. 0O .LAJりん放 ′I･ ン7 /- (. PH6. O) を減圧 通 人 した. 噂の場 合 に は i A l血 q)R皮が 水h状 l に なLLぱ 卜L / Tであ. z r搾度 か か る/次 で火 面の 水 分 を 1 ･ 分ぬ るが.約 1J. 一一 一Cl. ぐい とって,塩 ビの フ グl )き遠 沈菅 ( 大 き さは随意 ). g.3の よ う に ′ ト形 の 塩 の 内 部 に Fi. 一一 一H. ビ遠 沈 管 を しっ. か り同定 した. その 後 8のr i t か に上記 の細 切 した 堪. 一一一 一｣. 塵 を つめ ろ. 後背の遠 沈 管 の底 に は小 さな穴 が あ け. 3. 2 i ･1 00 0g･ t lJ nt ' lの遠 I 沈 にか け 大形 て あ る. こJLk 遠 沈管 の底 に た まった液 を採 取 Lた.液 は 大作 0. 5. l l t lg トマ ト生 一 泡ほ ど とれ る. こJtに 2% 0 は･' L ･ )に な る よう シ ョ糖 を加 え て泳 動 戚 料 と した.. =. _ _ I I. 5m1 1 7角に細 切 りに し,. 実 験 結 果. P Oの トマ ト組織 内所 在 の組 捜 化 学 的検 討 まで泳 動 試 料 調 製 第 1法 に 上 り作 刺 した トマ ト. 2宰顎 汁液 に,1 } 0 の机 節 化乍 反応 を施 し, こJLを ド-. FI g. 3 Theappar au tsfTO ( J bt ann iigel e cr LOPho･ r c s i s me di um (. e nz y. mc s ( ) t uL i on) f r om iL ner C eI I ua lrs pac e sorO LmaL (. )l e av e sa. n d se LmS b･u ) s i n gc e nr ti l u か唱 l or c es L:s ma一 l pi e c e s oH efo a rs t e m. C.: r 如n gt e mae ub d byvi l ar gc c e nru Li n y一 cC.ニS mal l ub emade c hl or i d. C e nr ti r ugn igt h一 or i de. I 1:s mal =1 0l eaLte h byvi n ylc uc ie b ouom orC2.J. :pa ln. tj s obLi an c d . t aLLc h bot om olC1. aL eI . 3にみ る よ うに.襲泉た 棒 銀 Lr =.その結 喋 は Pl 粒 の 破 片 圭た は グラナ と思j)L Lる帝 位 や頼 粒 の 娘F t J がT r J ' ･ 色 を示 し, こ こに. P O油性 が 存在 -rる こ とが推. 定 さ)した. 次 に健 全 トマ ト F2躯の横 断 切 片 を作 り, P O皮応. を' R施 した.I J lt ael .1にみ る ように,珊状 組 織 の 反 I . tl . が椴 も強 く. 次 に海綿組約 で L. 長々 と反応 陶性 部 が 見出 さJtた. 二九 ･ )のL i応 部 は贋緑 粒 上 にあ る と 考え / }れ ろ..
(5) 1 ' -. =･二 9べ. げ(I /･ L ,I J Lr Lに 対･ F, 3トマ トL L " 1 . 抽 J)航 抗惟 (弔9輔 ). J･ t-. 1 9. 前緋L 2 )て鑑 R.LT _ ･とこ> 'T j)ろか . トマ ト F2V). i. . 隻の 横 断 切 目に l ) Ok t /l r ･ < F l ( 施I -ろ と. I ) ( )所 作J ) 諾 dJ/ ,LL, 3の は. Eとして 衣穫 糸 . 内 吃 (En doder ･. sL Jj上 T mi J' 逝背 部 : 長組 蛾 で あ っ/ _ ･ . こjt/ ': =は 岱. 毛 那t ? _ V )f Jい 部 分が や ∴. 壬f =こJ ) 叫 lTJ )F L 紘: 開化 部. LL, + . I , は細 胞 甲 に近 侍 した とこ7 '. 二LZVJ/, BJ)由 岐' 紐 綿 を は ぎ とっ て l 〉 O そ こで トー . 'ト F2t. ' t i 応をf ff /･Iた. そ L ) k l i r. f !l '. l aL eI . 2. 二! ' JJよ うに. 細 胞 と細 胞 の 間 作 Hne tr cC ● f色F : i ･ ‖u] ar. T I. Pae. CS )にl . 仁が 71/ ,jLl ∴ I 以 上 . r _ !要約 ナ/ )ヒ. Ⅰ ' 0所 作 の 他 拘 † fi f部 如 勺の f. )抑 胞 噂 故楼 部 ∴り 細 胞 脚 隙 と は.日 鱒松 柏 巾 .2 ~ 't. JT二. 考え ･ トマ ト品 種 の TMV感 染 に よ る POI Zの変 動. T. 11 ㌧ ●碓 柄 性 の F2と航 抗 r lJ)ZI くせ剛 い て.. Tll' ＼接 印綬 6rI Hの 試 料 をr P 川1Ll. - = 二itか J ,汰 動成料凋魁 第. 統r_ 1は に より酔 凍. ･ L (作 'た . 堪Tfは. i. DASで あ , ゲ. / レJ)PO k 応 J)あ り さ ま I tr ' l at ( IL 1の ヒJ5I ). で. これ J r lテ ン シ ト 1- 9- : :と. [ _ ･ J)か Fi g. Jで. 5)ら.~ 手 ◆ r l ･ わ ざ 七 き て分 . ナて,一極 か J ,十陣 . こか . T. Zsかば +){ 'Ltた.こLL/ 'J)う ら て.I- 7の 7群 J) I ･ 分 画 で あ る. 卜 2, 1. 5の a I 大 きr L Zsr <とりj) 汁. そJL/ 'J) 眼 光摩 ( ( ) i )… )の 向柵 榊 5 1 rL T hJ比 ) J r･ :f r LI_ ･ J)が Ta bl el )て j7, 3.. =l 炎; こ示 しr Z群 U)r Jか = ･ ,後述 十 ろよ うに浪 健 の I , 唄 光性 の 大 きいJ)は ) . b いの は ( . J, ; )I / IL dで. l 1･. 2分 画 で I t濃 厚 は 低 い .い 圭Tabl e2々み ろ と. ]･. FJ g. 4 El e cr LuPhor e s i s pr of i l e s or l } ( ) l Z f r om ＼ ' L i Va r sunn io cuae ltdan t oma) L lCUI dTlI i n ( ) Cuae tLd. dev eo lp c d on 1 0 0 0 p oy ldt. -s lb a gel acr ya lmi ) 7:POI Zs .OD. . .: opt kalde n s i L yal J J O llt t t .Z O:r c s i s t anLC ul i ヽ arZK unn io cuVi 1L ae. d ZI:ZK T_ ＼ 7. nocuae ltd. FO. ･ l Kul s u se CPL i bl ec uL ia ･r F2unn i( ae, td Fl: ＼ ' i n. ( ). cu. ). ae LdSbL .usr ae L:r ) AS. F' l TII. l. I. 2分 向 で . ' 2と I Uに,非 悠 i抵 抗 作 の ZK.棺桶椎 の F1 敬 ( 陣L f I )柄 物 ( ZO また H FO): 二比 ヾて. 好 戦 ( 拷. 輔)的拘 ( ZIよ [ =は FI) v T )F Jが 暇 脚 f l( Ol ). ") か . え て い ろ. しか し浪 雌 J)1 1 7- J 捌. i ' : い り . 5分 痢 J r E ･1Lと 7 , ,ZK で は 悠 敬 に よ り眼 光 唯 が . 3-5割相 性 ふ え られ k 対 に 擢楠 惟 U)F' Zで は,悠 f か こよ り鮎 や納杓 よ り吸 光噂 が 減 少 ll = .. Ta bF e2 r iL ai oolOt ) . . ｡ofe a c hPOJ Z r T l 0n li n ( ～. : ul ae. Ldt ona lt OC ul t i ･ var sl ot hatr r or nuni n( x : ul at e dcul t I Var S. 基 賞 の相 違 に 上 る POI Z. J JJ) トマ ト ZKJ, '上1 LFl I. * 持 相 伴 と Tll ＼'樟 押 綾 7日 fiJ)材 料 を恥 ., I ! 3 ; ･ 田J) 醐迎 : こ上7 ,I OI ZI I : 調べ, 七･ . 泳動 d J t 料t / )作 魁. ' 王耶 1. I . . 二よ り. tた 蛙n. tS. .2)(A ; C,: ' , IP. YR を 朋 い/I . にこ i.H D. 泳軌. ケ. / レ与 PO や 色 Lf:ii いたを )l ' 1 {L L ･t . J-6に ･ r ;. LJ =. い よ ZO ( 抵 抗 作 ZK iム紳 J)J巨7 L t染) ニZl( 同 主 . I , 紬. t R斡 ) を比 較Tろ と, 1, i. 5. 6 ･7V)t ' i r. J Z群 と t穐 B ･ V)方が 前 芹 より眼 光 呼 が 人 で あ った.. l ne tR Tl ac al c uu lsof( ) D .. ｡cur v e sofe a ch n l P( ) I Zt scmp o ar e db ehl でt ! n( ℃ul ae 【dan d u nn io c uae lLdtmaoC o t u】 t I Y ar. S ae ld.ZO: ZI.r e s i s L anlcul い＼ , arZK iに n (ul t h e sme a C. uI L i v arunn io cul ae Ld. Fl:s u s ul t h, arF2 i no cul ae ld. FO:t h e c ept i bl ec. ed. s ameeul t i ＼ ･ aru. nn lt rul al.
(6) 2 0. 近戦大字曲学部紀 要. 第1 6号 (1 983). 一方 FO ( 羅病性 F2品唖 の非感典)と F日 同品種感. た.そのあ りさまを Pl a. l e 17 . .8に示 した.. Z群 とも吸光度 におい 史)を比較すると,上記の各 l. すなわ ち両基質の場合 とも,AP法によると 1 Zの 5分画のみが出現 した. これに対 し普通法では 1,. て両者間に大差がなかった. この傾向は用いた 3柾. 3, 4, 5, 6の各 I Z群が検出 された.AP法によ. の碁野 ともに一致 した.. Z各分画の吸光度の分 次に基質の相速による POI e3の ようである. この衣では Fl 布 をみると,Tabl と ZIの値の平均値 を例示 してあ る.す なわ ち基 質 DASでは I Z5分画の吸光度が全体の 60%,4分画 1 6% で あ るの に対 して,基 質 GACで は それ ぞ れ. ると恭緑粒 はほぼ完全に除去 される. そこで 5分画 Zの少な くとも一部 は､非黄緑粒 ( おそらく細胞 のI 壁質あるいは細胞間隙に存在する)の POI Zであ る と考 えられ る.. 2)塩溶出法 過丑 日 M )の堀 ( NaCl )を′トソ F2 )重葬 を ファーに加え, この液で健全な トマ ト (. 22%,60%であった.この ように基質によって I Zの 分布が異 なった. また基 筋 PYRでは一般 に反応度 が少ないが,DASに似た吸光度の分布 を示 した. 基訂 GACでは分画 6,7がほ とん ど出現せず,皮 対に基 懲 DASでは分画 3が出ない.また基質 PYR. GACを用い,また茎葉以外 に茎のみを材料 として実. では分画 4,5以外 はほ とん ど反応 しなかった.以. 験 した. この場合の避雷は DASのみである.. 0JL nn す りつぶ し,策片 を含んだホモジネー ト液 を 3 振 とうした.これによって細胞壁質な どに boundし てい る辞 紫 を溶 出 しよ う と した.基質 は DAS と. OI Zの屯的 ･質的 な 上の ように基質の用途 により P. aeL9 -1 1に示 す とお りである.すな 結果 は PlL. 帽過が認め られた. しか し 3健 の基野の うち DAS. Leaf )で基質 DASでは,明 らかに 1.2, わち茎頚き(. が最 も反応度が大であったので,今後の実験 では主 として DASを基野 として使用 し､GAC を副次的 に. 3,4,5,6,7の 7本の POI Z各分画が認め られ た.そのほか 4と 5の間 に 4本の副バ ン ド(4より+. 用いることとした.. 伽にある もの を 4' ,4〟と,また 5よ り一側 にある も. ,5′ ′とす る)が現われ,また 7は 7および 7一 の を 5t 植物組擬 か ら PO群兼液抽出法の検討 前述のように植物体内では黄緑粒内,細胞壁近接 部,および細胞間隙などに PO活性が存在す るこ と. の 2つか らで きていた.すなわ ち合計 1 2本 (1,2,. 3. 4, 4, ` 4〝, 5, ′ 5" . 5, 6, 7, 7つの バ ン ドが認め られた.次に墓 所 GACでは,I,3,A,. )酵素液 が明 らか となったので, これ らすべての P(. 4′ ,5と 5本のバ ン ドがみ られた.一九 基 質 DAS. を抽出す る最 もよい方法を確かめ ようとして,次の. St em)では. 1, 2, 3, 4, 4, ′ 4" ,5′ ′ , の葺 く. 実族 を行なった.. 5,6,7と計 1 0個のバ ン ドが 検出 されるのが認め. 1)アセ トンパ ウダー ( AP)法 この方法で健 F2)か ら抽出 した酵紫液 を屯気泳動 にか 全 トマ ト (. られた｡ 一般 に塩溶 出法で は普通 法 に比較 して 1- 4の. け,基質 DAS または GAC を用いて反応 させた.対 照実験 として普通法 ( 泳動試料調製第 】法) を用い. I Z群の反応が強 く出 / i( Tabl eJ) .普通法ではこれ Z群の反応が弱 く. 5,6の i Z群の反応が強 らの I. "ofe ac h Tb aJ3 e Di s t r i bL ui onofOD. POI Zf r om t omat oC. ul t i var s amogtet n h oa tlOD"ow. hen u s e ddi f f er enLki n dsofs ut x. L ･. r ae lS. Tb al e4 I nc r e a s e si nOD"0ofe ac h POI Zf r omhe al t hyLm O at O cul t i v a. rF2bya ddi n g1M Na Cl i n t h e exr Lac t l n g bu f f e rs ol ut i on. l Zs. t l us r ae s P er c e n l O ー O D …Sb 一l d L Z s 〇 t. Z O. t h a t d e a c. h l. DAS. 3 I 4 , 2. GAC. PYR. 9. 4 2 1 6 q , a. 6 9 0%. 2 3 一 %. DaL aae rc er a geval u e a). Cl uat e. df r om anav (K I n o cul ae ld)an dZlZ ofFlr F2i no cul ae td) .. T Z s. ) . 2. OD". Oi nt h. ec a s. eofs us bL T ae tS DAS GAC. 3. 2 3 3% 1 4 2. 3 3 2. 1 9 7 qO. 4. 】 0ー. 1 3 0. 5. l o g. 7 9. aL t ･ Fi g ur e ss how I 光r C enLofOD川 ofs b oun dPO t ot hatols al tf r e ePO..
(7) ･ 1 1 ) r:タJコモザ I イクウイルスに対する トマ ト品助の抵抗性 ( 第 9報) いのが普通 である. したが って塩特出法では普通法 での反応の弱 いバン ドが補強 され る傾向があるとい える. 次に茎 を用い る と L O個の バ ン ドがみ らtL ,特 に. 2 1. GCR系 トマ ト栽培棟の TMV感染による. POI. Zの変動 本項では GCR2 37,2 36,2 67,526の 4栽培棟 を用 い.非持唖 ( 健全)トマ トと.TMV接鹿後 6日日の. 4,5の I Z群で副バ ン ドか現j) れた.掌 には垂線粒. トマ トを材料 として突放 した.泳動試料作製 は前述. の含故が少ないので.4,5の I Z群にu非繋梓粒に. の第 2法によ り,基質は DASとした.. 由来する POがかな り含 まれている可能性がある.. 3)細胞間隙酵素追出 し法. 鯉全な トマ ト品種. ゲルの PO反応の あ りさまは Pl at el l ,1 -2に示 す とお りである. また非接機区 ( 0)を 1 00として,. F2を用いて,細胞間隙辞避追出 し法を実験 した.基. . Oの伯 同一栽培唖の接機 区 日 )の各 T Z群毎の OD.. 質 と して DASとGACを用 い た.屯 気 泳 動 像 は. を Tabl e5に示 した.衣によると,l Z群の 3･4お. P】 at el .1 2 -1 3に示 した.. よび 5分画において, いずれ も接種 区が非接種区よ. すなわ ち革質 DASでは, 1,2.3.4,4′ ,5,. '. り高い値であった.そのあ りさまは Tabl e2に示 し. 5' ′ , 5, 6, 7の計 1 0個の I. Zの存在が,また益軒. た ZK品種の感染による OD… の増加 と同 じ傾 向で. GACでは 1, 2. 4, 5, 6の 5個の l Zの存在が,. あった.なお l Z群の 6･7分画においでも,感染 に. そL l , ぞれ認め L )れt . :. . 二の方法では酵糸液が ミニ コ. より非感典区の 32 O%,700% とい う高い値がみ られ. ンで浪縮 されていないのにかかわ らず､上記の よう. た. しか しこの高い値は非感染区にはみ られない,. にかな り店い反応度 を示 した.特 に普適法に比べて. 新 しいバ ン ドの出現 を意味 してお り, この新バ ン ド. 4, 5の I Z群 に副バ ン ドが現われた.. の生成 は,実験の くりかえしによって,必ず しも再 現 されなか ったので,結論か らは除外す ることとし. 次 に各 I Z間の OD … の分布 を両韮質問 で比較 す ると,張筋 DASでは+睦に近 い 3, 5.6.7の各 I Z分画への分布が拓 く,基質 GACでは一極 に近 い. た｡. 以上の ように TMVに対 して抵抗性 の品威 あ る. 1,2,4の各 I Z分画への分布が高かった( Fi.) g 5.. いは栽培棟 では,常に f Z辞3･4, 5分画で OD…. 以上述べた 3つの PO辞顛液抽出法では,埴溶出. 値が非感染 区 よ り感染 区 で高 くなる結果が え られ. 法 と細胞間隙追出 し法が良好な結果 を示 し,特に 4,. た. しか しTabe2に明 l らかなように,羅病性品櫨. 5の t Z群で質的な溶性増加.つまり新バ ンドの出現. ではこの傾向 はみ られない.. をもた らした. その うち今後の実験では,簡易な方. 法 として塩溶出法を採用す ることとし. これ を泳動. 試料詞穀 ( 植物組綿か ら PO酔顔液抽出) 法の第 2法. とした.. 50. %. ahl Z be Icessi Tal5 nrae nODHoolec f T Om L OmaL oCCRgr oupc ul t i v aSb T yTMV･ i r t r et ci on ( sbtaeD usrt AS) GCRgru op. ⊂ ). Rai toofOD… oHZs ト 2 3-4 5 6.7. A:GCR 2 3 7 1 4 3% 1 07 1 1 1 7 0 0. ロ30. 3 17 00 / a 】8 2 12 7 1 5 7. B: Jl 26. J L. く つ . ト. C: 〝 2 6 7 1 0 3 % 1 5 7 1 3 6 3 2 0. 10. 1 , 2. 3. 4. 5. 6 7. 1Z. F i. g5 Di sr Liuin bLo or OD. . oorahP ec OI Zadi n t s. c onai rprsn o bt ewe en te h dl iErne eeC of s u bs U･ al e sus e d The el et crpoei ohrss meim du Was ob ne df rm o itre necl llrsae ua pcsofun. ･ t ai i nclt ouae d tmao o t cl ut ia v rF. 2 I 7. : I Zs:DAS.CAC s ubs t r al e su s e d.. Fl grS ue So hw te h rt ai o oft omat o GCR cul t i vr asTMVi -ncl ouae tdt ota htofui nnI o cul ae. td. ウイルス抵抗性誘導での誘導薬剤処理 と トマ ト品種の PO暮 Z ウイルス抵抗性誘導薬剤の代表 として,アクリジ ン偉 く AO日 00P J 桝 ,ササの含有糖蛋白であるバ ン. P桝.お よび OI ioI n d フォリン( BF)0 50P g mioAmie.
(8) 2 2. 近食大字 農学部紀要. 6号 (1 第1 983). 00♪ OJ A)1 Pm を用いた.これ ら薬剤 を トマ ト抵抗 (. 以上のように O I Aが抵抗性品種 において.POの. 00 0L 性 ZK および確病性 F2の根か ら 25 ' C,3. r下 l 間吸収 させた.その後第 2法で泳動試料 を と で 2E. id n uceTとして効果のあ ることがわかったの で,以 AI OO♪m J 7 を用いることとした. 下の奨験 では OI. り出 した.用いた基質は DASである.. ael. 1 .. 3の とお りである. また こ PO 反応図は P】t れを各 I Z群毎 に,無処理 区の OD一 一 ｡を 10 0 として薬. 接種 と OJ A処理 による トマ トZK.F2品種 での PO誘導. 剤 処理 区の吸光 度 の割 合 を図示 したのが Fi g. 6で. TMV抵抗性 品感 ZK と擢病性 品唖 F2を用 い.. ある.すなわち羅病性品種 F2ではいずれの誘専物. OOP TMV棲額後 5日目の材料 ( T) .OI AI Pnl処理 ( 根か ら吸わせ る)5日間 ( A) ,および接種 と同時 A 処理 5日目 (B)の 3区を設 けた.対照区は に 01. 野の場 合 で も,PO の各 I Z群 を とお して吸光度 は. 1 00%以下である.これは誘導物野処理区の PO活性 Zにおいても,無処理区よ り少ない こと がいずれの l A 処理 を示 している.一方,抵抗性の ZK では,01 Z群 とも吸光度が 1 0 0%以上であった.しか し で各 I. 無接種 で水を吸収 させた( 0) . これ らか ら試料調魁 法第 2法 で酵素液 を とり,基質 DAS として反応 さ. 他の AO,BF各処理では無処理区 と比べて,吸光度 はあまり増減 しなかった.. T. F 7CEN. O D 4 4 0PE. 幸 - ,…=. 80三. 0 0 5 0 r - L _ STE王. 0 5 12 .. 3. 5. 4. 6. 7. T. IZ. 1, 2. 3 4 5 6, 7 lZ. Fl g. 6 Chan ge si nOD. . .ofPOI Zc aus e dbydi f f e r e nLi nu dc er s ld nu c e r swe r egi vent otmaoc o t uhi var s F2 an. dZKl r or nt her oos t.OD"｡aH0 0q / o l e v el:OD s hownbyconr tol( wae tr c ul ･ t ur e d) pl ans t. J nu dc er sこAO.a cr i di ne or ange 1 00p ycopr oen ti, pm. BF:gl Bamf ol i t an ie. r om bar no b o ga rs n ob. df s s s ( Sda p. ) . 5 0m. Ol A.OHo g l mi no 0 00 dehavn igcyo lkii nna Ami ct ii vt y. 1 0 0p J)nJ. Fl g. 7 I nu dc t i onofFOI Zf r om tmaoc o t ul t i var s ZKandF2byTMV-i orOI A ∝t nl i onand/ me t r e at nL lI7:I el: 0 0ol 0 / ev T: . ｡ a11 Zs . Lt oaHZO .D一 onr tol( unn io c uae ltdand OD s lbyc howT ae L ト ans t-FT:s us ce pt l bl ecuI unr te Ld) pl varF2TMVe r e ae ld i n ocul at dF ,A:F2L j ) 1 1 7 . hi hOL A1 0 0♪ wi L no c ul ae td FB:2 F bot es i s t antcul L i v ar ZK andt r e ae. td ZT:r TMVi n o cuae. ltdZA:ZK t r eae td wi t h OT A1 0 0jH ,ZB:ZK bot n∝u】t ae d I PL hi an dL r eae. Ld.
(9) 平井 :タバコモザ イクウイルスに対する トマ ト品種の抵抗性 ( 第 9報). せた. このほか同様の材料の写 ( St em)のみをとり,. 2 3. Tal6 be Chne agsl nOD . . .ofec ahI Zf rr on. これ を細切 して細胞間隙酵紫追出 し遠沈法で酵頼液. t omaoG L CR cl ut i vT aSb y TMV･. 与えて.基 町 DAS として反応 させた.. i ncl ouai to,O n I AL rar etnn.ad et n. 泳動図 を Pl at el I , J～6に示 した.いま無援嫌,秦. t nt hi ncl ouai tonadI n _ ram et et n. 00として,棒 球 ( T),秦 処理の対照区の OD… を 1 剤処理 (A),接種 と薬剤両処理 (B)各区の吸光度. GCR No.. I , 2. Z群の 分画 毎 に澄理 したの が の パーセ ン トを各 I Fi g. 7( 前貢)である. ます茎葉 ( LEAF)をみると, F2で はほ とん どの値が 1 0 0以下である. すなわ ち各 J Z群 とも対照区 より接種 あるいは/および薬剤処理 これに対 してZKでは, 特 にl Z 区が PO活性が少ない. 群の 4,5分画で吸光度が 1 0 0を越 える bのが多い.. STEM)の み の 結 果 をみ る と,F2で は 次 に茎 ( LEAF と同 じ傾向にあ り.また ZK で も LEAFに似 て, 4, 5分画 その他で吸光度が 1 00を越 えるもの が多か った. 以上 の結 束 か ら,抵 抗性 品種 ZKで は,接唖 や. 01 AK r L 理 によって PO活性 が誘萌 され,それ は主 と して I Z群の 4,5分画で顕著 であった｡ 接種 と OJ A処理 による トマ トGCR系での PO扶導. 67,52 6の各栽培棟 を用い, トマ トGCR237,236,2 T), 前 述 と同 じよ うに,TMV接 糠 後 5日 目 ( OI A1 0 0ppm 処理 5E l 間 ( A),接鹿 と同時 に OI A. OD "oofTZs. 3. 4. ⊃. 7 T 6 GCR2 3 6 0 , 0 97 13 0 15 0 0% A 1 3. 92. 85. 9 8%. 96. 98 115. B. 88. 6% 115 131 GCR2 3 6 T 6 6, a l§ o A 8P. 6 . 7. T. 27. 88. 52. 96. 0. 95. 94 1 53 l oo. 82. 80. 5L l. B 8 8% 1 50 102. 95. 77 ー 05. GCR2 67 T 1 2 2%. 90. 11 6. 86. 87 〕OO. 3 0 0 , わ 96 A 1. 78 10 1. 83. B 1 51 % 119. 86 log. 80 108. oo ‰ GCR5 2 6 T l. A 60 9, a. 99. 1 0 3. 88. 82. 96. 81. 92. 40. 79. Fi grs ue so hw I 光ret Cn OfOD… ofec ahl Zi n∝ul a･ t e dado n rt rae etdt ota htn ui T I Ou Cl ae Ldad n ut nra･ et e d.T:TMV･ n i ocu l ae. td AiOI At rae etd.B:bt oh i nou cl ae tdadt n rae. etd Goh ti cL y l 光 So hwsl agr re 0% i nls3 Z .. 45 .T:oa ttlIs Z v al u hnl eta 1. 処 理5日 (B)の各区を設定 した.対照区 ( 0) は 無棲唖 ･無処理 である.試料調魁法第 2法で辞紫液 をとり.基質は DASとした.. at el I , 7 -9の とお りである.対照区で 泳動岡は P) .. ｡を 1 0 0として.接種 または各処理区の吸光 の OD. Z群毎に整理 したのが Tabe l 6である. 度の割合 を I. Tal be7 J ht j oofOD. . .ofec ahl Zf rm o TMV･ i ncl ouae ldadO n I A･ t rae etdtm o ao t cl u一 t i vr ast ota htf rm o ui nnCl ouae td ad n u nt r e at e dcu) t i v ar s. 1 0% を超す値 に対 してはゴチック字体で示 衣で は 1 Z群 1,2および 6,7では値 がかな した.ただ し I. CU) l i v ar s. り不揃 いで再現性が とば しいので,11 0% を超 えて も その ままの事件 とした.. GCR 2 3 7. EI Z s Ra t j oo fOD..●o 3 . 4 5. 9 5 %. 1 0 2%. Z群 3, 4, 5分画につい 衣に明 らかなように,l. GCR 2 3 6. 1 1 4. 8 9. てみると,接唖 または薬剤処理 によって対照区の吸. GCR 2 6 7. 9 3. 1 11. ZK ( St e m). 1 3 6. 1 3 6. Z (e L2 n GK CR 5a 6. 2 0 0< 1. 1 5 8 9 6. F2 ( Le an. 6 6. 8 6. Ge n e s Tm1. Tm2 " β. `. Tm 2. 00以上の もの)はかな 光度 を超 える t , の ( 数字が 1 Z群 5分画が り認め られ る. その うち GCR267の l かな りの店い値を示 しているが. この系統の遺伝子 -をホモに もつ ものであ り,ZK が Tm 組成 は Tm 2. 2 -をヘテロに もつ もの とか な り類似 している. し. -. Tm 〟2 -t m2 ■ 十. か し一般に GCR系では前節の ZK の デー タと比 較 する と.PO誘導の程度がかな り低か った.この点 は 考察の項 で品す る.. Fi gr ue saeaeaevl r vrg au eof3dt aa:n i∝U) ae td( T) . etd( .n nt ouae n ra ed( B) . t rae A)adt hofi ncl tdadt et.
(10) 2 4. 近戦大学農学部紀要. 接種 と薬剤処理 による P OI Z携導の まとめ. 2品機 を通 L;て,接磯 CR系および ZK,F トマ トG Zの誘導状況 をま とめ お よび OA I 処理 に よる P OI al7 e (前貫)の ようになる.この衣では l Z群 ると Tb の うち澱 も砥要 と考 えられる. 3･4と 5分画につ いてまとめた. 表 によると最 も P Ol Zの誘尋度の高いのは抵抗性. 第1 6号 ( 1 9 83 ) を樺出 した. 塩溶出法および細胞間隙群発追出 し法によって,. s o l u b lP e Oまたは b o u n d(おそらく細胞壁質などに b o u n d ) P Oを溶出する報告はすでに多数現われ てい る. R A THME L Lらは タバ コの s o l u b 】 eP Oを i n t e ト c eu l ll a rs p a c e sか らとり出 した▲ S ) 那, この液 は酵紫 usr a L eに もな りうる1 7 I の検 出以外 に,病 原菌の SbL. 品唖Z Kで,ZKでは華 だけでな く,茎においでも商. とい う. また辞 糸液追 出 し遠心 分雌 法 には.本文. GCR系 はこれに対 して一般に誘 い誘導度 を示 した.. Fi3 g .で明示 した,塩 ビ製二盃遠沈管使用以外に,一. 専慶が少ないが, それで も 3･4分画 または 5分画. 定の大 きさのマーブル ( 硝子玉)使用の方法叫 もあ. 1 0 0 %を超 えている ものが多. る.最近 W I T らは糸状 歯に感染 した トマ トの細胞間. 2では黄 ･茎 を問わず い. これ に対 して確病性 の F. 杵柄 を採取する新 しい方法 を推示 し. これ らは トマ. に掛 ､て,いずれかで. P OI Zの許等度が少 なか った.. ト華 に ネ クロー シ スを起 こす こ とを明 らか に し た '恥. I V 考. .. 一方. アセ トンパ ウダー. 蕪. 1.スラブゲル上の P OI Z反応の再現性 Oの活性 をスラブゲル上 で再現 した も 本実験 は P ので,蛋白の染色反応な どと異な り,ゲル上で酵紫 の活性が保持 されていなければな らない. したが っ てゲルの組成 から SDSは除去 され ているので,ゲル. Z各分画の分子瓜は推定できない. 上に現われた l. ( AP)法では非確繰粒の. P. Oは検 出 され るが.その活性 は極めて少なか った (. P. a t el7 , 8参照) ,KC U らはインゲンの APを作 l h e n y l a t a n i n ea mmo n i a 1 y a s eの検出を行なっ り,p Oではこの方法は活用で きない. ている川が,P 要するに塩溶出法や辞穀追出 し遠沈法によって, 多 くの l Z群が検出可能 とな り. ( P. l a t e. I ,9 , 1 01 ,2参. トを材料 とすると,群発液の適 当な抽出法 ( 後述). O検出上有効であった. 照) , これ らの方法は P 3 P Oの植物組織内所在. - 7までの I Z群が出現 した,かつP) a t e によ り.1 Zの 4,5分画 L9 . 1 01 .2にみるように,主 として I. Oの主な所在は黄緑粒 を実施 した結果.植物内の P. 実験結果 に示 した ように,健全で成育盛んな トマ. 本文 に も記 るした とお り,P Oの組擁化学的反応. 1 2個程度の. 内 と考 えられた. これは APによって薬緑粒 をとり. I Zが検 出 された.この検出は トマ トの同一試料 を使. O反応 はほ とん ど現われ ないことか らも 去れば,P. 用するか ぎり,極 めて再現性が高か った.ただ一極. 証明 され る.. 付近 には多 くの副バン ドが出現 し,合計. Zで副バ ン ドが現われ る場合,た とえ や十極 に近い I. しか しそのほか, 葉の表皮や茎の併断面 をみ ると,. ( P. l a t e,. I3 )や茎の析断面での. ば 7分画 における 7'の出現 な どは,再現性 にかな. 表皮細胞の細胞間隙. 0F F E R E Kは オ オ ム ギ で 1 7 5個 の り欠 け て い た. 1. 衆皮 ･内皮 ･道管 柔組織 内 に も P O反応 が み られ. P OI Zを認めてい るが畑, この程度の数が櫓物 で は. Jこれ . らは細胞壁の近接部に反応が認め られ,お るJZ. 一般的であ るように思われる.. そらく細胞壁 に b o u n dした P Oと考 えられる.. 一方, ウイJ Lス接凝 , または種 々な処理 を して. ト マ トを陽光定温横内に 4,5日放m t lした場合 には, I. 菓緑粒. P Oと非薬緑粒 P Oとをゲ Jt '上で区別す る. ことはむづか しい. しか し前述の APの実験 か ら,. Pl a t el l ,. 45な どにみ られるように.かなり I Z数 b. I Zの 5分画の一部 には非繋緑粒 P Oが あ る ことは. 減少 した. しか し基質 を変 えて.た とえば DASと. 確実である. また塩溶出や細胞間隙追出 し法で新 し. GACを比較すると,各 P OI Zの出現傾向やその濃度 Tb al3 e やFi5 g . に示す とお り,かな りよく再現 は,. Zの 4,5分画中の副 バ ン ド4,4 ′ 〝 , く出現 する,J. された.. えられ る.. PO. I Zの ゲル上の反応 は, 以上の貞 をまとめると,. 再現性が極めて良好な もの と考 えられ る.. 5' ,5"な どに も,非葉緑粒 P Oが存在するもの と考 4. トマ トの TMV抵抗性品種 での P O誘導 本報告では トマ トの TMV抵抗性品種 ( 栽培凝). 2.泳動試料 ( 租酵兼液)の とr )方. K以外に GCR系の故種 を用いた.これ ら として,Z. この実験 では.原初に用いた泳動試料調製の第一. 品機 に TMV を接櫛 した ときの. 1参照)のほか,機々その方法を検討 した結 Fi g . 法( 果,壇溶出法を主体 とした,同第二法. F. i2 g . 参照) (. P Oの活性 増加 を,. Zl こ分けて調べると,Z Kで椴 も高 スラブゲルで各 ] Zの 4. 5分画の清惟相加 ( OD… 吸光 く. それは I.
(11) ､ T ' ･ ) F:タ′コモザ : イクr J 7ィ, レスに対す る トマ ト品柄の抵抗性 ( 第 9報) 度増 加)に娃づいていた.次で GCR系で はGCR2 6 7 が高 く, これは ZKに似 て過伝 子 Tm 2 Dを むつか,. ZKE iへ テ ロで､GCR2 6 7はホモであ るだ けの退 い で糸ろ.他の供試 GCR系 は感熱 二上る P Oの訴乱 と くに P OI Zの 4.5分画での OD… の増 加が少 な か った.もっとも TMV羅病性 の F2に比 べ る と,そ れは高か った. 野上 削 こよる と)9 JT . MV OM を トマ トGCR系 に. 2 5. もすでに陶 発 き)してい る2 2 1 ので. この点将来の研究 が待 たれ る.. 5.酵 兼ア イソザ イム と遺伝子 との関係. Zが解析 され.それ と酔瀬が抽 最近種 々な酔 鵜の I 出 された細物 の遺 伝 tとの関係 t ) 論 じられ てい る. た とえば M ARCI ANO らは歯核病 菌 には され た ヒマ ワ リと リンゴの p oya lgl a【rns cuoaeの I Zの相 連に ついて検討 した23㌧ また a myL as eの I Zとコム ギの. 棲木播種 す る と, CCR2 3 7は無病徴か軽 いモザ イク.. 過伝子 との関係2 一 ) 早,e s t er as eの T Zの バ ター ン と. GCR2 3 6は無病徴か ネ クロー シスのないえそ斑点, GCR5 2 6は ネ クロー シスの ない えそ斑 点 .GCR2 6 7 は激 しい ネ クロー シ スを隻 ず る とい う.ZKで は TMV OM の 接 機 で激 しい L op･ n e cr os I Sを生 ず る. Ae gt ' / o ♪S属植物間 との間 に多少の関係があ ること2 5 1. ことが知 らitてい る2 0 ･ 川 この こ とか ら考 える と,激 しい ネクロー シスを生. も論 じられた. さらに ウンシュウ ミカンとカラタチ か らの リンゴ酸脱 水 紫辞 滋 を, ゲルで I Zに分 けた ところ,両者 はそれ ぞれ二屯体の酵 瀬 BB.AA とい うホモの 工 Zか らな り,両者の 雑機 第 -代 は ABな. Zか らなることが明 らか にされた28I. るへ テロの I. ずる もの では POI Zの柄性が務 ま り. そ うでない も. 本報告 で用いた トマ トZKは じめ GCR系 は, い. のでは, た とい抵抗性 であ って も P Or Zの活性 はあ. ずれ も トマ トとその野生種 との磯間雑種 である.す. ま り高 まらない. しか し萌 まらない とい うの は,同. 晶唖では,棲鹿 ･ 処確 に よ り POI Zの活性 は無接種 ･. な わ ち GCR27 3 は トマ ト (Lc♪nL yoe' ' cn o ecsu m) と L./ / e n/ L t t t ' r s 〟/ 〟m との雄健で,ZKおよび他 の GCR系 は トマ トと L.Pnu e Li o〃〃 tn との雑種 であ . トフ 卜 ( 擢病性 F2 )とこれ ら概間雑種 との間 る27I. 無処理区よりいちじる しく低下 す ろ. この ことを考 え. には,P OI Zに関 して雷的に新 しい I Zの出現 は認め. る と.抵 抗 惟 の GCR系 で は.接 唖 や 処 理 に よ り POI Zが対照区 よ り低下 しな い点が噴要であ る とい. Z分画 7では, られなか った. もっ とも十俺 に近 い I. える. この ように低下せずにある程度の高い レベル. あったが, 葬 位 を変 えた りして実験 を くりか えす と,. 一 栽培矧 問で,無模倣 ･無処噂 と接唖 ･処理 とを比 較 して市 まらない とい うことである.一方,擢病性. 71な どの いわ ゆ る削 バ ン ドが形 成 され る こ と も. を保 つ こ とは, これ ら GCR系があ る程度 ウイル ス. か な らず Lもこの結 果 は再 現 され なか った. した. に対 して抵抗的であ るⅦ実の反映 と考 えられるが,. が って トマ ト自身 とその機関雑機 との間 には, POI Z. それが具体的 に どう関係づけ られ るかは.現在不明 であ る.. 表の実験 で.ナ ス料の他の植物,i , .ヤガイモ,ナス.. それ で は ZKやGCR2 6 7で 代襲 され る ネ クロー. ホウヅキなどの P OI Zを調べたが, それ らは トマ ト. の質的な相過 は/ i : い もの と考 えられ る.平井 は未発. シスの出現 と,P O活性 の高 ま りとの関係 は どの よ. と比 べて POI Zの ′ てタ- ンI かl ち じる し く変 って い. うに意味 づけ られ るであろうか.平井 らは TMV感. た.. 染の ZKでは.o･ tpncoi erssの出現以 前か ら.組織 内. この よ うに供試聴闇の トマ ト品棟 ( 栽培棟 )の も. 病変 として師管部 えそが起 こ り, さらにそれ以前に. つ過伝子組成 と P OI Zのバ ター ン との間 には一定の. 師背部で I J O活性 が存在 するこ とを組鞭化学的 に明. 関係 はない. ただ Tm 2 -をホモ また はヘ テ ロに も. らかに した) 2 . Iすなわ ち ZKでは.感染 によ り茎内部. つ トマ ト栽培棟 で は,TMV感染や誘尋物質の処理. O活性が誘尋 され, それが もとと の組抑内 に高 い P. Zが故的 に増加 した. によ り,一部の I. なって組織 の え死が促進 され る. それが外部 に現わ れ たのが t opnc( er) s i sで あ る. つ ま り誘 導 され た. V. 摘. 要. POは t op ･ n e cr os i sをひ き起 こす組蹄 の反応 であ る といえる. 二の こ とは蔓の内部の非繋緑粒 PO とネ. 用 して, トマ ト茎葉のペルオキシダーゼ ( PO)アイ. クロー シスとの関係 として意味づ けられた.. ソザ イム ( l Z) を分析 した.. 日 ポ リア クリルア ミ ドか らなるスラブゲルを利. しか し他面, ネ クロー シスと黄緑 粒 P O との関 係. 2)用 いた トマ トの品種 ( 栽培健) は,抵抗性 の. を知 るためには薬緑粒の完 全な分離が必 要で. その. 瑞光 ( ZK)および GCR系の 4椀 で, これ らはいず. 上 で分離 された薬緑粒 について辞紫反応 な ど調べ る. れ も トマ トと野生 トマ トとの健間雄健 で. 遺伝子組. こともで きる. この ような硬練粒分離のための装疋. 成 は異な っていた. また確病性 品種福寿 2号 ( F2).
(12) 1 2 6. 近故人7: 位軍部紀 背. は これ { 'の遺伝 + を t L . たなか った.. 3)泳動試料 (相好 諾r ; ･ 液 )の柄 出 . ' 土細 々検E t lLT = 次の 2法 か長好 であ った. a,塩 溶 出 法 :l M NaCtを ′トyフ ァー に加 えて 雀苛 をす りJ )ぶ し. その純 を 3 01 7 1 i J L振 とう して慮. 結取. 過 す る.. b.細胞間暗酵 #追 出 しJ)ための遠心分鮭 は :事 I- を減 F 博の小 片にあ J )か Lめ ' ′ ヾL ･ /7 , t渉透 し. こ. Fi. g: ～. ) に 入山 て遠 心 分推 れ を塩 ビ敬 二 屯遠 沈管 ( し, 退 沈管 の底 L =T =圭った頼 J を用 い る.. ' '+ A) その結果,成 f i L 旺盛 r l ･トマ トで け.一睡か 極 にか け てはぽ 7個 J -Z )J 許か 見出 され [ _ ･かつその .. 4,5,7群 は さ{ >に 2- 3に分 かJL ,合計 1 2個の I Zが認 め られ た. こJLJ )の OD… の吸 収 曲線 を と り, その面鞭棟 分値 か / ), そL D浪度 を判延 した.. 5)抵抗性 品 格 ZK( 遺伝 FTm 2 Bへ テ ロ)では.. TMVの感 熊 お.よぴ. あ るい は OI A ( 旗 抗性 誘 耕 物. /ミノで, ' サ イ トカ 1ニ ン活 町, rリゴ ･イ ミノ ･性 を有 す ろ)処理 に よって. PO 統他 が卿 加l L, とく. Zの にl. 4,5分画 で OD… か無感椴 ･無地稚 L {より. 増 加 した.. 6)GCRに成 す る他 の抵 抗作 品撒 U)なか T.は,. ZK と同 し辻伝 fr _ {ホモ に t u)GCR2 67が.感 染,. OI A 処 確 で活 性 が 増 加 した. 他 の 遺 伝 1 二号 も I ). GCR系 では,抵抗性 といしI r i ･ か ら.椎か + J活性柄 加 2(こ]トンのi B伝 1 ' をも にす ぎなか った.擢病作 の F は,懸梁 に 上って OD "oI 土無懸 取班 よ りむ し たない ) ろ減少 した.. 7)ZK は TM V の 感 鞍 で n E l端 え そ を 生 し, GCR2 67も激 しい ネ クロー シ スに r _ ^る. ･ 他 の GCl モ 系 は軽 いモザ イ クか確 点 を, また･ 確病惟 U)F2はモ ) OI Zの増 加 ほ ト ザ イクをそJtぞれ F とず る. そ こで l マ ト穀1 織 の ネ クロー シスJ , : ･ F k映 す る もJ)ヒ考え ; I )Lt. た. 8)以 上の 町実 か ▲ '. POI Z と トマ トi B仁王f 二 の作 用 との関係 ( こついて考繋 LI _ ･ .. OJ A を供訳 された. 屯右･ . 良Ⅰ _ 大字 憶｡教招 吉 ,日本 特産KX小野 凹 源氏 に感 謝 で ろ. 上/ I( i CR系 u ) 過. 耶1 6り 日9 83) 引用 文献 日) ｣ .KLC:^ct h･ e Dcf encc ll e chani s ms i n aL RKS l l lo ol )Ed) ..p.. pI ) 71 7,【 8 J l ePl ns(. num l Jb u.Cop r.(92 18). . ( . i) G. L. ド^R I くSad ^ n ゝLA.S1∧l l l l. ^Tr ( . T.I ' ht _ 1J ･ l PO. -. ... J / ( ) 脚･ 56.6 6 96 7 7日9 6 6. 7. / I L r f ･ l JE' l 三･加藤 盛 ･鈴 + L f) i: - t 川代病 繊 3. 7 ( 3) 三i : i J d: 1 5 J H97日. ( J) Rll , 1 m はRLJ SI I. WL ) Tad∫K n .l . C:仇 . V l uE pI I I l/ u･ u J L l7 ･ 0.t 6q 9日9 RO). ( 5 J t t .日^ . 1 1 1 1 ES kCHMI Lr r . EM .. NL r L IL KE S. ad n J. KuC:P/_ IY . iJ L ' l/ .PIP . u/ / I2 . 0,38 7 2( 1 9 8 2. ) ( 67 N. MAsY MA:/lltt. rUA ti ) J l yoa lp / / I. .SE l t ･JP a〟] 1. 48,2L 721 9日9 8 2) .. ( 7) ､ T l J l m遥 ･fL t E I l 笛 L火 :本虎 7.l l21日9 7 J).. ( 8) 若: ･ m追捕 ･岩松 It r -･鈴木草維 ･波辺仲郎 ･関 沢 鼻詳;:r li l l l 病報 4 8.2 672 7 J( 1 9 H 2) . V ･ J r ･ 花造 ･ 鳴 け 徽 ･掩JF 梢倍 Iq円芯 1 久 L: , ( 9I L t I 的蛸報 4.5 3 2 ポ5 : 旭 日9 7 7). . t l u )† ' ･ J f. 軒造 :口偵病 輔 48,J n JH92 8)(捕 要 ). _. u U 平井禰遥 :本d f1 5, 1 1 8日9 82) .. ( J 2 ) 平J I l 構造 ･唯 野 点 ･ ト･塩 呪 店 久 X: i 本 誌 14. .. 1 011 2 . 5 日9 81 1 .. 日 3 l J. A.＼ ' E E Cl I:/ ) / I _ V / l J J ) a/ / t l ) / ( ) A , , V 66. 17 02 17. 06. 日97 6) .. ( 1 0J .. E RA川･ : J .Ku. C adC n . ヽⅠ . Cl MA: i ( . :I ) J t ya. / t ･ I J t ･ 1 7 7 i . i / I _ 19 ･ .0 1( ) 911 05日9(. 7) ) ( 1 5 7l l ' .. G RA'l n. l lL EL ad n L.S( L) し : Ft lZ A:I ) / I L 1 7 /. /) I L l ･ . < i E J /5 . 3.373 1 1 8 日9 7). 1.. 【 L 由 1 1日oFFt EE tK:Bt ' l J C J I ( ,. 1 1 1 l ' /･ n. q' ( I / . J沖 JI二. 川. .. 176,7 1( )Ⅰ1日91 8 8) u7 7 Z.KL L ME.T ( 1:PL / y/ t J P〟h L( ) l o. gt t55. 1 Oニ 3il OJ 3. ( 柑65 ) .. ( l P . l. lL l TA Em :] ' J L . t ･ I oE PL // L r l / n. gl ･ 70. 36こ 5 iO. 6. (1 9 8 0) .. ( 1 ぬ) l J JGM .. _ L ) El ＼r 十 adG n .H S K. MAN:/ I / I . I . S). t (/ _. / Y /初/ J L .21.1H ( 1 9 8 2 ) .. u 9 ) 空f 叫和地 ･渡辺E k l l _:F l 他病 報4, 8 1 1 6日恥2). ( d #曹) .. 帝省. 伝(組成 一 につい て =教 ' 示 にあずか った. 良 作水. 良･ %技 術研究所 本 吉絶 P,氏 にI' ' 7L申 しありよす. 島 外 水種 市野 望 t lJ fな t トマ ト GCR系の 稚 (は. 試験喝. 故 野崎 和鹿氏 か J )いただいた.感謝 す る と. と い こ, この際. 同氏 の小感の ご遡上 : =対 して野 人. で 哀悼 の 哲を表 したい.. 日97 6) .. L ? I ) 出 典 蒋 ･(. nt治 l 雄 :荘 田海 大 手 術 雑h L ･ .9. 1.. 1 0 日 日9 7 81 .. 位 C( .;K .ノ l I l ' : mh( ' . ^M .SPG) .. (L ' ( ;.B I I IlI A(E S:.. ( J .RAM' S S SN E .ad n DJ.L SMI SON:Ca心 ′b t ･ r g. J t L ･ S ,CJJ tl lm/ L. l l42.3 ｣1J9日9 3 7 7. ). I.
(13) t F J F:タ, <コ モザ イ クI l /I/ レ7 .に 村 ｢} 3トマ トd L J , 軸の抵抗稚 く 1 7 S9. 報). L 2 3 ) I ) .八l. ARuA. T u). . P. D.LEIn (I , and ド.. 1 , I A( ; kO:. Ph y s i ( J IP , lP .a / / I2 . 0.20121 2(9. 1 8. 2. ). 糾 K.NImK S AWA and ll.. Vol w I ^RA:J a / ) uJ Zノ. 7. G. ( , 7 7. L , I I ' ( . S46,3｣533日9 5 1 ).. t 2 5. ' .i NAKAland K.TsL I . YEWAKI:J a p〟J Jノ.(, ' ( 7. 1. ) 1 1. L t ･ / i c . 1 .. 46. .3. 1. 7. 13 3 6日97. 日.. u6 ). 37. I l l 1喝. ‡ t ･ :･内宮仲文 ･杉 納r r ' 1弘 :伯拘細胞 作稚 入門,( F I ･ : 物 化7: 実験 法 J 6. ) ,p.L 77.7 会出版 セ ン ター 日98. 2. ).. qT )本 吉総 労 :蛸物 にJ) I ( ナる誘尋抵抗性 ,p.. 1 06. .昭. 5. 7年度 ｢1 本 地物 病 確 乎 会場拘 t ･ .史熊 * _ 作柄 稚 化. 乍韻謡 全. 日98. 2. ) .. Exp). ana. t i o. n0(Pl at es PLATEl an ie db･ さ I:. Cr ecl i onoft omaoe t ul L i ＼ , arF21. cahL os ss l aS t S L. hemet hodo(＼ r ET : Cl l ,別ueCoo lronchl ) r UPt so h Wstep h r e 父nC COfPO act h･ l L y. P:Pal i s ae d t i s s u. t , iS . : .. S PO n耶･t i s s ue.e:epi der mi s . der. ml St r. ( ) m Lma o L 2:PO rl e<Ct i ononl carcp) t )eul t i .Ar r varFl Z owsSh州, t t h L IPr eS enCL ･( ) rl ' ( )acl i ＼t ･ i) , ( b一 uec t. l l or. )aH hl Li ne tr c L , =ua lrs pact 5. 3:PO r e ac. t i o. nI ) n lch h ( 1 m叩 ea nL L ･f r om l ビa ＼ ･ e ゝ( ) r t l ) na lt OCul lronchL t i varF2. NoCb L 一 uecoo ur opa ls t sa ndl hL. ･gr ana.. AsofPOI r on. o. mat i l , ar 貰F2an d 6:Change Zl lt oCul l Z. K byusi ngdi f r er cl l LS ubt sr ae ts. i:s usr blae L DAS.. 5:d) t (A ; C. 6:du.1 } YR.FO:s us cept il bt L eul i ＼ ･ aTF2unn LOClL uae. d FI F2T. TI γi nc Ou･ lL ae d.ZO.r es i sa tntCul l iOClLd uae . i varZK unn Zl:ZK TM＼ 'i nocua lL C d,I 6.POIs Z. 7. 1. 8:POI ZubLi ane dF r om 1ma ( I t (C JI UI L i l ･ arF2b〉 ･t hL A acco tnep川r r dermt i . L h( l d.7:s usr bLat eD^S,浴: do. ( ; AC.^･ac eo tn. e powder .ar rw o ss how pt ) s i t i vcr eac. L i on. s州 1 Zgr oupl No. 5. S.ur dJ ' Zs . nar さ ･meto h dConL r Ol .1 6:POI Z obt an ie df r om L omao l cul 9. -H :POf t i var Fl Jby aCIi hchomogcni / . i ngs addi ng il i lhT nL ou JL i on ands haki ngf or: 川 n7 L l l t( s oCal l c ds ' ll LCX. L. TC a L. I. c denz _ ymc.9 ) -s usr btaL CL ) ASf r om s t em.l O: rm .l l:do.GACr rm 0: du.l JASr n t ear o t ear . ( ) r. di nar. ymeto h dnotc onann tiigNaCL .ドニC｡nLii ann. gNaCl1 . 7:POI Zs . 1. 2. -1. 3:POI Zr rm ( ) LmaOC O L u) t i varF2bygeuigt n he el ccr tophor e s i sF li ud f r om t he i ne Lr c el l ua lr 2. :s usr bLae. l s paee s( s ee Lc h METHOD) . 1. DAS.1 こ i:d( ) .GAL.A.也:L hedi f r er enLmat eT ･ il a bot hr rm l l F2,. I 7:POL Zs .. l. U TEI I I ) 12 - :Change si ntea h eL i ヽ , i l 一OfPOJ Zobt an ie dF r om L OmaO t GCR cuL t i var scaus e d by TMV i ne fcL i on. A:GCR2 3. C:GCR2 D: 7.B:GCR2 3. 6 . 6. 7. ( ;. CR 5. 2. 6. .( ),. unn i( l. Cuae lLd conr tolpl ans t.). ＼ i ' 1 ､ 人1' r l O. Cuae. ltdpl ans t.I 7:POt Zs . : i:l ncr eas csi nt heaCt ii vL ) ･t J rPOI Zf r on llma o L O cul t i ＼ ･ arZK by addi n. gi nduc er s. . ZO:r e si sa tnL cul t l . ＼ ･ arZK unr Leae. td ZA:ZK t r c < lt e dWi t hacr ト r eae tdWi t di ncor angt H0 0ノ 坤1 1 1. .ZB.ZK t hbam( oT i n5 00♪ J ) ∼. /ZH .ZKL r e a. t C. dWj l. hOt AI OOfI P川 . 1 7･POI Zs . . I -. 6:. Id n uct i onorPOL Zf r o. m いma0 1 1 C ut t i ＼ ,. ar sZK and F2by 111 Vi nr e ct I On andorOt A nl at ･ S CL ･ Pl i bl ccul men. t i:l eaf( JS r U. Li ＼ ,. arF. 2 ,. 5:t cal olr c s i sa Lnlcul t i varZK .. 6.se tm olZK.FO:F2. unn i( ) cua. lL t. I d.unr leae td.FT:F2 iM＼ - 'i nocu･ ll ae d,FA:F20l Al r c aL C d.FI う.F'. lbo. L hi no cull ae d and t r cae ld.ZO･ ,ZK unn iocuae lLd.un･ t r c ae td, ZT:ZK TMV i nl l CU】t ac d､ ZA.ZK Ol AL rae CLd. ZB:ZKbりt hiK n( U IL ae dadt n r eat ･ c. d I 6:l } 01 Zs . 7. 1. 9: t nducL i onorPOI Zf r om tmaoG o t c代 i : ut i ＼ ･ ar s b yT入V 1 i ne fct na. ndorOI At r c aL menL 7:. i o. GCI く2 3. 7. 8:GCR ' 2. ニ i 6.. 9:( 1 , Ct i5 2. 6. AO:GCl く 2 37 unn io cuae ltd.unr Le ae tA.AT:. do. T入t ＼ ' at ed.Al l. i noc uae lLd.AAこdo. 01 ^t r e :do but hi nocuae ltdadt 0:GCR 26u. n r e ae. td 1 3 3 n･ i mN : UlLd ae ,unr Le ae td.RT:do.T. 17. ＼ 'i noua ClL At 旧 :d( .bot hi no cue. d RA:do.OI r eae td,[ ∃ 1 lL ae dandt r eae td.. DOT iocua ll C d. .GCR 56u 2 nn unr teaL C d,DT:do,Tll VJ nOCUL ac. td I ) A:d｡, Or At r eae td.DB do. b ot hi n( ) c uae lLd and L r e at C d.I 7:Ⅰ 〉 OZ Zs .. l.
(14) 近畿大学位学部紀要. 第1 6号 ( 1 983). 華 7 L r 膏 L l蔓 帝1. l Ae LdJi . 5 1L. .. 2 9.
(15) 平井 二タバ コモザ イクウ イル スに対 す る トマ ト品桃の抵抗性 ( 第 9報). 3 0. l. g QT T. 言. キ. 圃. 1 3 44. Al ｢. 盲 ｢1 2 ｢F ⑨. 2. ト F 6 ㌣. -一 -. fQ_ FTfA. ㊥. r 4 JL ■L. ー∴ I _ F B. ZOZTiA. ZB 二. 6-. .:-. ! ･_ -. モ 6. ･ ト t. ' ' 7. 1. 4 -L. t II I ･ I II l r. す. 1. f l ロ r ■. ⑥. JI J. : 三･ : ≧旦 ZTヱ旦_ 呈旦｣. L _∴ 与. AD ATI AAI ABIBOBTB i AJ 旦巨暮 DOD _ T! 担L PB.
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