ヒト血液脳関門のDocosahexaenoic acid輸送におけるFATP1/SLC27A1の寄与と制御機構の解明

ヒト血液脳関門のDocosahexaenoic acid輸送におけ

るFATP1/SLC27A1の寄与と制御機構の解明

著者

落合 祐介

学位授与機関

Tohoku University

学位授与番号

11301甲第18893号

URL

http://hdl.handle.net/10097/00129246

博士論文

ヒト血液脳関門の

Docosahexaenoic acid 輸送における

FATP1/SLC27A1 の寄与と制御機構の解明

令和元年度

東北大学大学院薬学研究科

生命薬科学専攻 薬物送達学分野 博士課程

3 年

落合 祐介

略語表

Aβ; amyloid beta

ABC; ATP-binding cassette AD; Alzheimer’s disease ANOVA; analysis of variance BBB; blood-brain barrier

bFGF; basic fibroblast growth factor BSA; bovine serum albumin

CE-TOFMS; capillary electrophoresis-time of flight mass spectrometry cGMP; cyclic guanosine monophosphate

CNS; Central nervous system CTP; cytidine triphosphate

dATP; deoxyadenosine triphosphate dCTP; deoxycytidine triphosphate DHA; docosahexaenoic acid

EAAT; excitatory amino acid transporter EBM-2; endothelial basal medium-2 ECF; extracellular fluid

EPA; eicosapentaenoic acid FAT; fatty acid translocase

FATP4; fatty acid transport protein 4 FABP5; fatty acid binding protein 5 FITC; Fluorescein Isothiocyanate GABA; γ-aminobutyric acid GAT; GABA transporter Gln; Glutamine

GLUT1; glucose transporter 1 GLUT4; glucose transporter 4 GMP; guanosine 5’-monophosphate

hCMEC/D3; human cerebral microvascular endothelial cell line HEK; human embryonic kidney

HPLC; high-performance liquid chromatography

LC-MS/MS; liquid chromatography-tandem mass spectrometry LC-TOFMS; liquid chromatography–time of flight mass spectrometry LRP; lipoprotein receptor-related protein

MMP; Matrix metalloproteinase MRM; multiple reaction monitoring NAA; N-Acetylaspartic acid NO; nitric oxide

NPD1; Neuroprotectin D1 PBS; phosphate-buffered saline

PFA; paraformaldehyde P-gp; P-glycoprotein

PI3K; Phosphoinositide 3-kinase

QTAP; quantitative targeted absolute proteomic RAGE; receptor for advanced glycation end-products RT-PCR; Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction SLC; solute carrier

SMVT; Na+-dependent multivitamin transporter SRM; selected reaction monitoring

TauT; Taurine transporter

TBST; Tween-20 in Tris-buffered saline TNF-α; tumor necrosis factor-α

目次 第1 章 緒言

第1 節 血液脳関門の生理的役割 ・・・1

第2 節 脳内におけるDocosahexaenoic acid (DHA)と中枢性疾患との関 連

・・・3

第3 節 脳内におけるtaurine とbiotin の中枢性疾患との関連 ・・・6

第4 節 Fatty acid transport protein 1 (FATP1)について ・・・8

第5 節 本研究の目的 ・・・10 第2 章 ヒト脳毛細血管のDHA の細胞内取り込み輸送におけるFATP1 の関与 第1 節 序論 ・・・13 第2 節 FATP1 安定発現系の発現、局在及び機能評価 ・・・13 第3 節 FATP1 安定発現系を用いたDHA の輸送評価 ・・・16 第4 節 hCMEC/D3 細胞のDHA 細胞内取り込みにおける介在輸送の評価 ・・・19

第5 節 hCMEC/D3 細胞におけるDHA の細胞内取り込みに対するFATP1 の寄与

・・・24 第6 節 insulin によるhCMEC/D3 細胞におけるFATP1 発現、局在変化、輸送機能評価

・・・28

第7 節 考察 ・・・33

第3 章 FATP1 の脳毛細血管における局在及び輸送方向性及びtaurine、biotin の基質評価 第1 節 序論

第2 項 taurine 及びbiotin のBBB における輸送メカニズム ・・・37

第2 節 マウス脳切片を用いたFATP1 の免疫染色による局在解析 ・・・38

第3 節 FATP1 安定発現系のメタボローム解析 ・・・39

第4 節 FATP1 安定発現系を用いたtaurine 及びbiotin の輸送評価

・・・48 第5 節 FATP1 安定発現系を用いたメタボローム解析候補化合物の[3_{H]-oleic acid 取り込み}

阻害実験 ・・・50

第6 節 考察 ・・・52

第4 章 ヒト脳毛細血管のDHA 排出輸送におけるFATP1 の関与とAβ による影響

第1 節 序論 ・・・57

第2 節 hCMEC/D3 細胞におけるDHA の細胞外排出に対するFATP1 の寄与

・・・57 第3 節 Aβ によるhCMEC/D3 細胞におけるFATP1 発現、局在変化、輸送機能及び細胞

間透過性の評価 ・・・64

第4 節 hCMEC/D3 細胞のAβ25-35ペプチド取り込みに対するFATP1 の関与

・・・72 第5 節 考察 ・・・72 第5 章 結論および展望 ・・・81 第6 章 実験方法及び試薬 ・・・83 参考論文 ・・・118 発表論文 ・・・141

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第1 章 緒言

第1 節 血液脳関門の生理的役割 脳の機能を適切に維持するために脂肪酸を含むさまざまな栄養が血液から脳に取り込まれて いる。循環血液と脳組織は血液脳関門(blood-brain barrier; BBB)によって隔てられている。血液 脳関門の発見は1695 年に英国の生理学者Ridley H の水銀投与の実験に遡る(Ridley 1965)。 Ridley H は’The Anatomy of the Brain’を出版し、水銀を動物に投与し、血管中の物質が脳血管を 透過しにくいことから脳血管の密着性を記述している(Ridley 1965)。その後、1885 年にドイツ の科学者であるEhlrich P は上記のRidley H の報告を知らなかったが、病理組織学的視点か ら、色素を動物の血管に投与する実験を行い、脳が他の臓器と比べて染色されにくい臓器であ ることが示された(Ehrlich 1885)。Goldman E は直接脳に色素であるトリパンブルーを動物に投 与し、脳は染色されるがその他の組織が染色されなかった(Goldmann 1909)。その結果に基づ いてGoldman E は脳組織と血液の間には色素を隔離する特性を有していることを提唱した。 Ehlrich P とGoldman E のこれらの発見から、脳と末梢組織の間に物質の移行を制限している 関門が存在すると考え、後にBBB と命名された。 BBB の実体は脳毛細血管を構成する内皮細胞である。有窓構造を持つ末梢血管とは異なり、 近接する内皮細胞同士がタイトジャンクションで連結した継ぎ目のない筒状構造を形成してい る。したがって循環血液中の薬物は脳毛細血管内皮細胞内を透過して脳細胞間液に到達する必 要がある。ヒトにおける脳毛細血管内皮細胞の容積は全脳の約0.1%であり、脳毛細血管の直 径は5–10 μm ほどである(Pardridge 1997)。しかし、その全長は約650 km、表面積は12 m2_で あり、脳毛細血管は脳内に張りめぐらされている(Pardridge 1997)。これは脳毛細血管と脳組織

- 2 - 間の物質交換をよりスムーズにするための構造となっている。さらにBBB は血液側膜(luminal 膜)と脳側膜(abluminal 膜)から構成されているため、脳と循環血液間のBBB を介した物質輸送 にはこの2 つの細胞膜を透過する必要がある。また、脳毛細血管の脳側膜の周囲は、細胞外マ トリックスタンパク質コラーゲン、laminin、フィブロネクチン、ペリサイト、アストロサイト から構成され、脳内の物質の輸送を制限している(Fasler-Kan et al. 2010)。 1980 年以来、BBB は血液-脳間の物理的なバリアと考えられており、血液から脳への移行は 脂溶性に依存した透過であるが分子量500 以上の物質輸送は制限されるとしたレヴィンの分子 量閾値説が有力であった。しかし、1992 年にP-glycoprotein が脳内から血液への積極的な薬物 排出機能を持ち、脳内に入る物質は選択的に排除されていることが示された(Tsuji et al. 1992)。 現在までに、BBB を介した薬物の輸送経路は、能動的排出輸送、トランスポーターを介した促 進拡散および受容体介在型のトランスサイトーシスが主であることが明らかにされた (Pardridge 2003)。BBB はこれらの輸送体によって、脳と循環血液間の物質移行を動的に制御 している。BBB に存在する輸送系は、必須内因性物質の脳内への供給、脳内で産生された毒性 代謝物質の排出、血中からの外因性物質の脳移行性の制御を行うことで、脳の恒常性の維持と 防御システムにおいて重要な役割を果たし、Central nervous system (CNS)が正常に維持されて

いる。BBB が崩壊することで、重篤な精神疾患を引き起こすことからも、BBB が脳の恒常性 の維持に重要な構造であるといえる。一方、この防御システムによって中枢薬が脳へ到達でき ず、薬効がないことが中枢薬の開発の大きな問題となっている。中枢で薬効を発揮するが、そ のBBB の透過機構が不明な物質が未だ多く存在する。したがって、BBB を介した輸送機構を 解明することは、脳内恒常性維持のメカニズムの理解や中枢薬の開発に大きく貢献できると考 えられる。

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第2 節 脳内におけるDocosahexaenoic acid (DHA)と中枢性疾患との関連

Docosahexaenoic acid (DHA)は生体内で必須の多価不飽和脂肪酸であり、脳において神経新 生、シナプス形成、神経細胞分化、神経突起伸長、膜流動性の維持、抗炎症作用、抗酸化作用 に関与し、神経保護作用を示すことで、脳の機能維持に重要な役割を担っている(Yurko-Mauro

et al. 2015)。また、DHA が脳でリン脂質に組み込まれた後に、phospholipase A2によってリン

脂質より切り出されて生成されるNeuroprotectin D1 (NPD1)もneurotrophic の修復、脳細胞の 恒常性の維持、抗アポトーシス作用、抗炎症シグナル作用を示す(Hong et al. 2003, Marcheselli

et al. 2003, Woodman et al. 2003, Zhao et al. 2011)。脳内の海馬など様々な部位でfree 体とリン

脂質に含まれるDHA やNPD1 の低下が神経変性疾患であるアルツハイマー病(Alzheimer’s disease; AD)の発症と関連している(Astarita et al. 2010, Zhao et al. 2011)。AD モデルマウスに DHA やNPD1 を摂取させることで空間記憶の改善が報告されており、DHA はCNS を維持す るのに重要な役割を果たしていると考えられる(Catalan et al. 2002, Hashimoto et al. 2005, Hong et al. 2003, Hooijmans et al. 2009, Lim et al. 2005, Marcheselli et al. 2003, Woodman et al. 2003, Zhao et al. 2011)。神経変性疾患であるAD はneurofibrillary tangle、老人斑、Amyloid β (Aβ)の 蓄積を特徴とする認知症である(Poeck et al. 2012, Selkoe 2001)。AD の発症の原因は部分的に しか分かっていないが、その原因の一つとしてアミロイド経路仮説があるよく知られている (Hardy & Selkoe 2002, Selkoe 1993)。アミロイドタンパク質前駆体から切断されたAβ1–40と

Aβ1–42ペプチドが脳において不溶化タンパク質として脳実質、皮質と海馬に凝集し、細胞死を

引き起こすと言われている(Hardy & Selkoe 2002)。AD モデルマウスを使った研究から、BBB でDHA 透過量が減少し(Calon 2011)、脳毛細血管ではAβ1–40とAβ1–42ペプチドが蓄積するこ

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とで、BBB の機能破綻が起こることが報告されている(Clifford et al. 2007)。AD 患者の脳毛細血 管の破綻には、タイトジャンクション関連分子であるOccludin、受容体であるreceptor for advanced glycation end-products (RAGE)、lipoprotein receptor-related protein (LRP) 1、LRP2、 トランスポーターであるExcitatory Amino Acid Transporter (EAAT)1、EAAT2、EAAT3、 glucose transporter 1 (GLUT1)、P-glycoprotein (P-gp)、アポリポ蛋白質E の遺伝子多型の1 つ であるAPOE4、Matrix metalloproteinase (MMP)であるMMP2、MMP9 がAD に関連する分子 として報告されており、これらの分子がAD の治療標的になる可能性がある(Erdo et al. 2017)。 DHA とこれらの分子の関連は明らかはないが、脳毛細血管におけるAβ 蓄積がBBB の異常を

引き起こし、血液から脳へDHA の供給のバランスが崩壊している可能性があると考えた。

DHA の脳への供給は食事によって生体内の因子によって制御されていると考えられる。 DHA は食事からの摂取によって脳内量が増加することが報告されている(Su et al. 1999)。ま た、ラット及びサルにDHA 含まない食事を与えると脳内DHA 量が減少し、認知症と同様の症 状を引き起こすことが報告されている(Catalan et al. 2002, Connor et al. 1990)。これらのことか ら、食事によって効率的にDHA を脳内に取り込むシステムが存在すると考えられる。食事に よって血糖値が上昇すると、膵臓のβ 細胞からinsulin が分泌される。血中insulin 濃度は食後1

〜2 hr で上昇し、数時間後に食事前の濃度まで低下する。したがって、私は、脳へのDHA の

供給は、食事によって血中に分泌されたinsulin の作用を介して効率的に増加すると考えた。

脳内の脂肪酸前駆体からのDHA の合成能力は限られているが、脳は血中濃度に比べて大量 のDHA を含む(Calon 2011, Connor et al. 1990, Innis 2007, O'Brien et al. 1964)。したがって、 DHA はBBB を介して越えて脳内に活発に取り込まれると考えられている(Rapoport 2001, Rapoport et al. 2007)。これらのことから、私は、血液から脳内へのDHA 供給のメカニズムを

- 5 - 明らかにすることは脳でのDHA を高濃度に制御するメカニズムに重要なファクターであり、 このメカニズムを明らかにすることでAD を含む中枢性疾患の治療に貢献できると考えた。 BBB を介した血液から脳へのDHA の供給は以下の3 つのステップに分けられる(Figure 1-1)。 1) 血液からDHA の内皮細胞への取り込み 2) luminal 側からabluminal 側への細胞内輸送 3) 内皮細胞のabluminal 側から脳実質への排出

Figure 1-1 Mechanism of the supply of DHA across the BBB from blood to brain

The influx transport of DHA consists of three steps: (i) uptake of DHA from blood into endothelial cells across the luminal membrane, (ii) intracellular transport, and (iii) efflux from endothelial cells into the brain across the abluminal membrane.

DHA は血中では、非エステル体のアルブミン結合体、lysophosphatidylcholine–DHA のアル ブミン結合体、エステル化されてtriacylglycerol、diacylglycerol、cholesteryl ester、リン脂質、 他のリゾリン脂質に組み込まれたリポプロテインとして存在する(Chen et al. 2015)。非エステ ル体及びlysophosphatidylcholine–DHA が血液から血液脳関門を介して取り込まれることが報 告されている(Rapoport et al. 2011, Thies et al. 1994)、近年、血液からDHA の内皮細胞への取 り込みに、オーファントランスポーターmfsd2a がlysophosphatidylcholine-DHA を血液から脳 へ輸送し、非エステルDHA 体を輸送しないことがマウスを用いた解析から示された(Nguyen

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す可能性があることから(Gazzah et al. 1995)、非エステルDHA のluminal 側における血液から DHA の内皮細胞への取り込みも重要であると考えられる。しかし、そのメカニズムは明らかに なっていない。luminal 側からabluminal 側への細胞内輸送として、Fatty acid binding protein 5 (FABP5)がDHA と結合し、脳毛細血管内皮細胞のluminal 側からabluminal 側への細胞内輸送 を担うことが報告されている(Pan et al. 2015)。内皮細胞のabluminal 側から脳実質への排出の メカニズムは明らかになっていない。

第3 節 脳内におけるtaurine とbiotin の中枢性疾患との関連

脳の機能維持のために、DHA 以外にもBBB を介してtaurine などの神経保護作用を持つア

ミノ酸やbiotin などのビタミンを取り込む必要がある。taurine は脳内で幹細胞と神経プレカー サー細胞を活性化し、神経細胞に分化させる作用があり、神経毒性物と酸化ストレスに対して 神経保護作用をもつ(Boldyrev et al. 1999, French et al. 1986, Matsumoto et al. 1996)。脳内にお けるtaurine の欠乏は脳内の細胞分化と遊走を遅滞させ、てんかん発作、不安、多動を引き起こ すことが報告されている(Jin et al. 2005)。これらの報告から、taurine は神経生成に重要な物質 であると言える(Ripps & Shen 2012)。taurine は血液から脳に濃縮的に取り込まれることが報告 されており、BBB を透過すると考えられている(Stapleton et al. 1997)。BBB を介した輸送に は、BBB に発現するTaurine transporter (TauT/SLC6A6)が存在する。マウスの脳において、 TauT はNa+_-Cl-_{-共輸送によってtaurine を輸送することが明らかになっている(Kang et al.}

2002)。しかし、当研究室のLC-MS/MS を用いた解析では、マウス脳毛細血管のTauT は 3.8 fmol/μg protein であるのに対し、ヒト脳毛細血管ではTauT は定量下限(0.077 fmol/μg protein)以

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を用いた研究から報告されている(Uchida et al. 2011)。このことから、ヒトにおいてluminal 膜 を介した血液から脳毛細血管内皮細胞への取り込みには別の担体が関与している可能性があ る。さらに脳毛細血管内皮細胞からabluminal 膜を介した排出のメカニズムは明らかになって いない。また、insulin 静脈内投与によって大脳皮質中のtaurine が増加しており(Guyot et al. 2000)、AD モデルマウスでtaurine の脳内量が低下している(Chiquita et al. 2019)。これらのこ

とから、私は、DHA と同様にAD 時に血液から脳へtaurine の供給のバランスが崩壊し、

insulin によって効率的にtaurine を脳内に取り込むシステムが存在する可能性があると考えた。 biotin は構造的に炭化水素鎖とカルボン酸を有する水溶性ビタミンである。biotin は脳におい

てカルボキシラーゼのCofactor として働き、血中に比べて50 倍以上の高い脳内濃度を示し

(Spector & Johanson 2007)、その脳内の欠乏は神経障害に関連する(Ozand et al. 1998)。Biotin-responsive basal ganglia disease は、眼球障害、発作、および混乱が症状として現れる神経系 に影響を与える疾患であり、しばしば発熱性疾患によって引き起こされ、一時的な脳症として 特徴付けられている(Ozand et al. 1998)。SLC19A3(Thiamine transporter 2)の遺伝子変異はこの 疾患と関連しており、治療としてbiotin が投与されており、この疾患を改善するためにbiotin を大量に投与することが示唆されている(Zeng et al. 2005)。SLC19A3 遺伝子の突然変異は患者 のbiotin の輸送を減少させ、血液から脳へのbiotin の取り込みを減少させると考えられている (Zeng et al. 2005)。biotin 自体には神経保護作用は無いと考えられているが、biotin は脳におい てcyclic guanosine monophosphate (cGMP)の産生を促進する(McCarty & DiNicolantonio 2017)。脳内のcGMP が増加するとnitric oxide(NO)-cGMP signaling が活性化し、NO-cGMP signaling が脳内のAβ の産生が抑制する(McCarty & DiNicolantonio 2017)。これらのことから、 biotin は間接的に脳内のAβ の産生を抑制し、AD 発症を予防をするという仮説が提唱されてい

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る(McCarty & DiNicolantonio 2017)。当研究室の内田らの研究により、biotin はBBB のluminal 膜に局在するNa+_{-dependent multivitamin transporter (SMVT/SLC5A6)を介して血液から脳の毛}

細血管内皮細胞に取り込まれることが報告されている(Uchida et al. 2015)。しかし、BBB の abluminal 膜を介した脳毛細血管内皮細胞内から脳実質への排出も脳へのbiotin の供給にも不可 欠であるが、そのメカニズムは明らかになっていない。

第4 節 Fatty acid transport protein 1 (FATP1)について

脂肪酸、糖、アミン酸、ビタミンなどを含む様々な栄養物質がBBB を介して血液から脳へ

移行すると考えられている。BBB を介した血液-脳間の移行にはBBB に発現するトランスポー

ターを介して輸送されると考えられている。トランスポーターは膜上で物質の輸送を担う遺伝 子の総称であり、ATP-binding cassette (ABC)トランスポーターとsolute carrier (SLC)

transporter トランスポーターの2 つに大別される(Hediger et al. 2013)。ABC トランスポーター はATP の加水分解によって生じるエネルギーを駆動力としイオン濃度勾配に逆らった一次能動 輸送を行い、SLC トランスポーターはNa+_、H+_{、カルボン酸などのイオン濃度勾配を駆動力す}

る二次輸送を行う(Hediger et al. 2013)。これらトランスポーターがDHA、taurine、biotin の脳 内量を決定づける因子になっている可能性が考えられる。当研究室のliquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) multiple reaction monitoring (MRM) mode を用いた定 量標的プロテオミクス(quantitative targeted absolute proteomic (QTAP) analysis)においても、単 離ヒト脳毛細血管においてfatty acid transport protein 1 (FATP1)/SLC27A1 がタンパク質レベル で発現していることが報告されている(Kubo et al. 2015, Shawahna et al. 2011, Uchida et al. 2014)。FATP1 は、炭素数12 以上22 以下の長鎖脂肪酸及び炭素数23 以上の極長鎖脂肪酸を

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輸送するトランスポーターであるSLC27A family に属している(Martin et al. 2000)。FATP1 遺伝 子は、ヒト染色体19p13.1 領域に位置し、646 アミノ酸残基からなる1 回膜貫通型膜タンパク 質である(Martin et al. 2000)。アミノ酸残基1 - 190 は細胞膜貫通ドメイン、アミノ酸残基258 - 475 は細胞膜結合部位、アミノ酸残基191 - 257 と476 - 646 はサイトゾルに存在している (Lewis et al. 2001)。ヒトの各臓器におけるmRNA レベルの発現解析では、脂肪組織、骨格

筋、心臓で強発現し、脳、胎盤、膵臓、腎、肺で中程度の発現が報告されている(Doege &

Stahl 2006)。FATP1 はoleic acid、palmitic acid、lignoceric acid、myristic acid をといった長鎖 脂肪酸を細胞内に輸送することが報告されており(Holloway et al. 2011, Mitchell et al. 2009, Mitchell et al. 2011)、ヒト脳脳毛細血管における輸送方向性について、ヒト脳毛細血管初代培養 細胞においてFATP1 がoleic acid をluminal 側からabluminal 側とabluminal 側からluminal 側 の両方向へ輸送に関与し、myristic acid とpalmitic acid をluminal 側からabluminal 側の方向に 輸送する(Mitchell et al. 2009, Mitchell et al. 2011)。これまでFATP1 がDHA を輸送することは報

告されていないが、以上の報告から、BBB おいてFATP1 が様々な脂肪酸の輸送に関与してい

ることが示されており、私はFATP1 がDHA を輸送基質とする可能性があると考えた。また、 FATP1 は脂肪酸以外の物質を輸送することはこれまで報告されていないが、私はAD 時の脳内 量の変動がDHA と類似しているtaurine と、DHA と共通の部分構造を持つbiotin がFATP1 に よって輸送される可能性があると考えた。

FATP1 は生体内因子によってその機能及び発現が変動することが報告されている。マウスに insulin を静脈内投与することで骨格筋におけるFATP1 の基質であるpalmitic acid の取り込み量 が増加し(Stahl et al. 2002)、免疫組織学的解析からFATP1 の細胞膜におけるタンパク発現量は 増加し、細胞内小胞の発現量は減少することが報告されている(Wu et al. 2006)。これらのこと

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から、私は、脳毛細血管内皮細胞でも同様に、insulin によってFATP1 の細胞膜での発現量が

増加し、基質の輸送機能が亢進することで、脳内のDHA 含量が増加する可能性があると考え た。また、近年、AD モデルマウス(APP/PS1 mice)を用いた解析で、脳全体のFATP1 のタン パク質発現量が低下していることが報告された(Pan et al. 2018)。このことから、私はAD 時に

脳内で蓄積するAβ によって脳毛細血管内皮細胞のFATP1 の発現量が低下し、血液から脳への

BBB を介したDHA の輸送が低下するため、脳内のDHA 含量が低下している可能性があると 考えた。

第5 節 本研究の目的

Docosahexaenoic acid (DHA)、taurine、biotin は、脳の機能維持に重要な役割を持ち、食事

によって効率的に脳に供給されるメカニズムが存在する可能性がある。DHA の脳内量の低下は

Alzheimer’s disease (AD)に関連することが報告されている。脳毛細血管内皮細胞を実体とする 血液脳関門(Blood brain barrier: BBB)は様々な輸送系が存在し、脳内物質環境の維持に重要な役 割を果たしている。したがって、BBB のトランスポーターは、DHA、taurine、biotin の脳内量 を決定づける要因となる可能性があるが、DHA 及びtaurine のヒトBBB のluminal 膜を介する 輸送と、DHA、taurine 及びbiotin のBBB のabluminal 膜を介する輸送のメカニズムは不明で

ある。当研究室のQTAP analysis においてヒト単離脳毛細血管にタンパク質が発言することが

報告されているfatty acid transport protein 1 (FATP1)/SLC27A1 は脂肪酸を輸送するトランスポ ーターであり、脂肪酸のDHA を輸送する可能性が考えられる。FATP1 は脳以外の組織で insulin によってその細胞内局在と輸送活性が変動するが、脳毛細血管においても同様に変動す

- 11 - るかは実験的に証明されていない。また、AD モデル動物ではFATP1 の脳での発現量が減少す ることが報告されているが、そのメカニズムは不明である。 そこで私は、FATP1 がBBB においてDHA、taurine、biotin 輸送を制御しており、その輸送 は食事によって分泌されるinsulin とAD の発症及び進行の原因の一つと考えられている amyloid β (Aβ)によって調節されているとの仮説を立てた(Figure 1-2)。よって、本研究では、 この仮説を検証し、BBB でのDHA、taurine、biotin 輸送におけるFATP1 の役割とinsulin とA β による制御機構を明らかにすることを全体の目的とした。また、上記全体の目的を達成する ため、以下の4 点を目的とした。 i. FATP1 が DHA、taurine、biotin を輸送することがこれまでに報告されて いないため、FATP1 が DHA、taurine、biotin を輸送するか明らかにする こと ii. FATP1 が BBB において血液から脳実質への方向と脳実質から血液への 方向の輸送に関与しているかどうかを考察する上で、脳毛細血管におけ るFATP1 の局在性を把握することは重要であるため、FATP1 の BBB に おける局在を免疫学組織学的に証明すること

iii. 食事によって分泌されるinsulin によって効率的に DHA を血液から脳内

に取り込むメカニズムが存在すると考えられるため、insulin が BBB の

FATP1 の機能を変動させるか明らかにすること

iv. AD における DHA の脳内量低下のメカニズムを解明するため、AD 発症

の原因の一つと考えられているAβ が BBB の FAPT1 の機能を変動させ

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- 13 - 第2 章 ヒト脳毛細血管のDHA の細胞内取り込み輸送におけるFATP1 の関与 第1 節 序論 第1 章で述べた通り、DHA は神経保護作用を持ち、脳の機能維持に重要な役割を担ってい る。DHA はBBB を介して血液から脳へ供給されると考えられるが、脳毛細血管内皮細胞の DHA 輸送のメカニズムは明らかになっていない。FATP1 は脳毛細血管に発現しており、BBB

おいてFATP1 が様々な脂肪酸の輸送に関与することが報告されてることから、FATP1 がDHA

を輸送基質とする可能性が考えられるが、FATP1 がDHA を輸送することはこれまでに報告さ

れていない。また、食事によって効率的にDHA を血液から脳内に取り込むシステムが存在す

ると考えられる。脳以外の組織では、食事よって分泌されるinsulin によってFATP1 の細胞内 局在と輸送活性が変動することが報告されているが、脳毛細血管においても同様に変動するか は実験的に証明されていない。そこで、本章では、以下の2 つ、i) FATP1 がDHA を輸送し、 脳毛細血管内皮細胞でのDHA 輸送においても関与するか明らかにすること、ii) Insulin が脳毛 細血管内皮細胞でFATP1 の機能を変動させるかを明らかにすることを目的とした。

第2 節 FATP1 安定発現系の発現、局在及び機能評価

FATP1 がDHA を輸送基質とするか明らかにするために、本研究室の相澤 三四郎氏の研究に よりヒト胎児由来腎臓細胞株であるhuman embryonic kidney (HEK) 293 細胞を宿主細胞とし て構築したFATP1 発現細胞株 (Aizawa S., Master thesis, 2010)を使うことにした。このFATP1 安定発現株が細胞膜トランスポーターの輸送機能を評価するのに適切な系か確認するため、 FATP1 の発現、細胞内局在及び輸送機能評価を行った。

- 14 - FATP1 発現HEK293 細胞の発現評価

FATP1 発現HEK293 細胞においてFATP1 が発現しているか確認するために、FATP1 発現 HEK293 細胞及びmock HEK293 細胞のwhole cell lysate 画分において、抗FATP1 抗体を用い てwestern blot を行った(Figure 2-1)。FATP1 発現HEK293 細胞では目的サイズ付近(71 kDa)

に単一バンドが検出された。一方、空ベクターをトランスフェクトしたmock HEK293 細胞で

は、目的サイズには単一バンドが検出されなかった。

Figure 2-1 Western blot analysis of FATP1 in FATP1-expressing and mock HEK293 cells.

Western blot analysis of FATP1 in whole cell lysate fraction of FATP1-expressing HEK293 cells and empty vector-transfected (mock) HEK293 cells was performed from a single cell preparation. The protein expression levels of FATP1 in FATP1-expressing HEK293 cells and mock HEK293 cells were determined by western blot analysis. Western blot analysis was performed at 1 time.

FATP1発現HEK293細胞の細胞内局在評価

FATP1発現HEK293細胞においてFATP1が細胞膜に局在しているか確認するために、FATP1 及び核染色マーカーであるPIの共染色を行った(Figure 2-2)。FATP1発現HEK293細胞におい て、FATP1の染色蛍光(green)が細胞膜上に観察された(Figure 2-2, i)。PIによる核染色(red)が観 察され、核(red)周囲にFATP1の染色蛍光が観察された(Figure 2-2, iii)。一方、mock HEK293細 胞では、FATP1の染色蛍光(green)は細胞膜上に観察されなかった(Figure 2-2, vi)。

- 15 -

Figure 2-2 Immunostaining of FATP1 and Nuclei in FATP1-expressing and mock HEK293 cell

Immunostaining for FATP1 and nuclei. in FATP1-expressing HEK293 cells and empty vector-transfected (mock) HEK293 cells were performed. (i, ii, iii) FATP1-expressing HEK293 cells , (iv, v, vi) mock HEK293 cells. PI was used as a nuclear marker. (i, iv) FATP1 (green), (ii, v) nuclei (red), (iii, vi) merged image of FATP1 and nuclear staining (yellow). Magnification x 50. Scale bar represents 20 μm (i-vi).

FATP1発現HEK293細胞の[3_{H]-oleic acidの取り込み実験}

FATP1発現HEK293細胞におけるFATP1の基質輸送機能を評価するために、FATP1の基質で ある[3_{H]-oleic acidの取り込み実験を行った(Figure 2-3)。[}3_{H]-oleic acidを含むトレーサー溶液に}

[14_{C]-inulinを加え、各wellの付着水の評価実験を行った。[}3_{H]-oleic acidの取り込み量は、[}3

H]-oleic acidのcell/medium ratioから[14_{C]-inulinのCell/Medium ratioを差し引いた値で評価した。取り}

込み時間は5 min、10 min及び15 minに設定した。FATP1発現HEK293細胞において、[3_H]-oleic

acidのcell/medium ratioは経時的に増加し、全ての時間においてmock HEK293細胞と比較して 有意に増加した(P<0.001)。

- 16 -

Figure 2-3 Uptake of [3_{H]-oleic acid. of FATP1 protein in FATP1-expressing and mock}

HEK293 cells.

FATP1-expressing HEK293 cells and empty vector-transfected (mock) HEK293 cells were incubated at 37°C for 5, 10 and 15 min in the uptake medium containing 20 nM [3_{H]-oleic acid, [}14_{C]-inulin 0.0366 μCi/well and fatty acid free-BSA ([}3_H]-oleic

acid / fatty acid free-BSA at 1 : 1 molar ratio). Four cell preparations were used in each time points. The uptake amounts into FATP1-expressing (FATP1, closed circles) and mock (open circles) HEK293 cells of [3_{H]-oleic acid and [}14_{C]-inulin were}

expressed as cell/medium ratio (μL/mg protein), which was calculated by dividing the uptake amount (mol) by the

concentration of substrate in the incubation buffer (mol/μL) and the protein amount of cells (mg protein). [14_{C]-Inulin was used}

to estimate the volume of adhering water. The uptake amount of [3_{H]-oleic acid was calculated from the Cell/Medium ratio of}

[3_{H]-oleic acid minus the Cell/Medium ratio of [}14_{C]-inulin. Each point represents the mean ± SEM (n=4, independent cells).}

- 17 - 第3 節 FATP1 安定発現系を用いたDHA の輸送評価 Fig.2-1及びFig.2-2に示した結果から、FATP1発現HEK293細胞ではFATP1が細胞膜上に発現 しており、mock HEK293細胞では発現していないことが確認できた。また、Fig.2-3に示した 結果から、FATP1の既知の基質であるoleic acidを細胞内に輸送することから、基質の輸送機能 を有していることを確認した。以上の結果から、FAPT1発現KEK293細胞はFATP1の細胞膜ト ランスポーターとしての機能を評価するために適した評価系と考える。本節では本細胞系を用 いて、FATP1の機能評価を行った。 FATP1発現HEK293細胞の[14_{C]-DHAの取り込み実験} DHAがFATP1によって細胞内に取り込まれるかを明らかにするため、FATP1発現細胞系にお ける[14_{C]-DHAの取り込み実験を行った(Figure 2-4)。DHAは血中でただちにアルブミンと結合} し、その結合率は99.9%以上であることから、血中ではほとんどが結合体で存在することから

(Spector 2010)、Fatty acid-free bovine serum albumin (BSA)を[14_{C]-DHAの濃度比が1:1となるよ}

うにトレーサー溶液に加えて実験に用いた。取り込み時間は5、30 minに設定した。FATP1発

現HEK293細胞において[14_{C]-DHAのCell/Medium ratioは経時的に増加し、いずれの時間におい}

てもCell/Medium ratioがmock HEK293細胞と比較して3.0倍以上高い値を示し、有意に増加し た(P<0.001)。

- 18 -

Figure 2-4 Uptake of [14_{C]-DHA by FATP1-expressing and mock HEK293 cells.}

The uptake of 618 nM [14_{C]-DHA in ECF buffer containing fatty acid free-BSA ([}14_{C]-DHA / fatty acid free-BSA at 1 : 1 molar}

ratio) into FATP1-expressing (FATP1, closed circles) and empty vector-transfected (mock, open circles) HEK293 cells at 37°C for 5 min and 30 min was measured. Four cell preparations were used in each time points. Uptake was expressed as the cell/medium ratio (μL/mg protein), calculated by dividing the cellular uptake (mol/mg of protein) by the test substrate concentration in the uptake medium (mol/L). Each point represents the mean ± SEM (n=4, independent cells.). *** p<0.001, significantly different from mock (Student’s t-test).

FATP1 発現HEK293 細胞系を用いたDHA の担体介在輸送の評価

FATP1 発現HEK293 細胞株におけるFATP1 を介した輸送を調べるため、非標識oleic acid を阻害剤として用いて、[14_{C]-DHA の細胞内取り込みの阻害実験を行った。取り込み時間は30}

min で行った。oleic acid の阻害効果は、FATP1 発現HEK293 細胞の[14_{C]-DHA のCell/Medium}

ratio からmock HEK293 細胞のCell/Medium ratio を差し引いた値であるFATP1-dependent transport で比較した(Figure 2-5)。[14_{C]-DHA のFATP1-dependent transport は2 mM oleic acid}

- 19 -

Figure 2-5 Inhibitor effect of oleic acid on uptake of [14_{C]-DHA by FATP1-expressing and}

mock HEK293 cells.

The uptake of [14_{C]-DHA from a solution of 980 nM [}14_{C]-DHA in ECF buffer containing fatty acid free-BSA ([}14_{C]-DHA / fatty}

acid free-BSA at 1 : 1 molar ratio) at 37°C for 30 min was measured in the absence (control, open column) and in the presence of 2 mM oleic acid (closed column). Four cell preparations were used in each group. The transport amount via FATP1 was expressed as FATP1-dependent transport, which was calculated as the Cell/Medium ratio (μL/mg protein) of FATP1-expressing HEK293 cells minus the Cell/Medium ratio (μL/mg protein) of mock HEK293 cells. Each column represents the mean ± SEM. The SEM was calculated according to the law of propagation of error (n=8, independent cells). *** p<0.001, significantly different from the control group (Student’s t-test).

第4 節 hCMEC/D3 細胞のDHA 細胞内取り込みにおける介在輸送の評価

ヒト脳毛細血管内皮細胞におけるDHA輸送にFATP1が関与しているかを明らかにするため

に、ヒト不死化脳毛細血管内皮細胞株human cerebral microvascular endothelial cell line

(hCMEC/D3)細胞を用いることにした。hCMEC/D3細胞はヒト脳毛細血管に存在する血管内皮 細胞マーカーやタイトジャンクション関連分子を発現しており、物質透過制限性を持つ。構造 的にBBBモデル細胞として有用であると知られている(Weksler et al. 2005)。hCMEC/D3細胞の mRNA発現はヒト単離脳毛細血管と似たパターンを示し(Carl et al. 2010, Dauchy et al. 2009)、 当研究室のLC-MS/MS MRM modeを用いたQTAP analysisから、hCMEC/D3細胞における代謝

- 20 -

酵素、トランスポーター及び受容体の発現量はヒトbrain capillary画分での発現量と比較して大 きな差はないことが示されている(Ohtsuki et al. 2013)。また、当研究室の相澤三四郎氏の研究 から、hCMEC/D3細胞でFATP1がmRNAレベルで発現することが既に確認されている(Aizawa S., Master thesis, 2010)。以上の研究から、私は、FATP1のhCMEC/D3細胞はヒト脳毛細血管

内皮細胞におけるFATP1の輸送機能を評 するin vitro評価系として有用であると考えた。本節で

は、hCMEC/D3細胞を用いて、ヒト脳毛細血管内皮細胞のDHAの細胞内取り込みが担体を介し

ているか明らかにすることにした。

hCMEC/D3細胞におけるDHA取り込み評価の至適条件の検討

hCMEC/D3細胞において担体介在輸送の評価に適切な時間を決定するため、[14_C]-DHAの細

胞内時間依存性取り込み実験を行った(Figure 2-6)。取り込み時間は0 sec、10 sec、30 sec、1

- 21 -

まで直線的に増加した。したがって、次以降の取り込み実験では取り込み時間は、5 min以下に

設定した。

Figure 2-6 Uptake of [14_{C]-DHA and [}3_{H]-oleic acid by hCMEC/D3 cell line.}

The uptake of [14_{C]-DHA from a solution of 235 nM [}14_{C]-DHA in ECF buffer containing fatty acid free-BSA ([}14_{C]-DHA / fatty}

acid free-BSA at 1 : 1 molar ratio) into hCMEC/D3 cells at 37°C for 0 sec, 10 sec, 30 sec, 1 min, 3 min, 5 min, and 15 min was measured. Four cell preparations were used in each time points. Uptake was expressed as the cell/medium ratio (μL/mg protein), calculated by dividing the cellular uptake amount (mol/mg of protein) by the test substrate concentration in the uptake medium (mol/L). Each point and column represent the mean ± SEM (n=4, independent cells).

- 22 - hCMEC/D3細胞における[14_{C]-DHA取り込みの阻害評価}

ヒト脳毛細血管内皮細胞におけるDHA輸送に担体が介在しているか、また、その担体が

FATP1の既知の基質と同じ経路かどうかを明らかにするために、1 mM非標識DHA及び1 mM非 標識oleic acidを阻害剤として用いて、[14_{C]-DHAの細胞内取り込みの阻害実験を行った(Figure}

2-7)。取り込み時間は1 minで行った。[14_{C]-DHAの取り込み量は、1 mM非標識DHA及び1 mM}

非標識oleic acidによってそれぞれ86.1%、38.2%減少し、いずれも有意な差があった (P<0.001)。

Figure 2-7 Inhibitor effect of DHA (A) oleic acid (B) on uptake of [14_{C]-DHA by hCMEC/D3}

cell line.

(A) The uptake of [14_{C]-DHA from a solution of 266 nM [}14_{C]-DHA in ECF buffer containing fatty acid free-BSA ([}14_{C]-DHA /}

fatty acid free-BSA at 1 : 1 molar ratio) at 37°C for 5 min was measured in the absence (control, open column) and in the presence of 1 mM unlabeled DHA (closed column). (B) The uptake of [14_{C]-DHA from a solution of 266 nM [}14_{C]-DHA in}

ECF buffer containing fatty acid free-BSA ([14_{C]-DHA / fatty acid free-BSA at 1 : 1 molar ratio) at 37°C for 5 min was}

measured in the absence (control, open column) and in the presence of 1 mM oleic acid (closed column). Uptake was expressed as the cell/medium ratio (μL/mg protein), calculated by dividing the cellular uptake amount (mol/mg of protein) by the test substrate concentration in the uptake medium (mol/L). Four cell preparations were used in each group The uptake is shown as percent of the Cell/Medium ratio in the control group. Each point and column represent the mean ± SEM (n=4, independent cells). *** p < 0.001, significantly different from the control group (Student’s t-test).

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hCMEC/D3 細胞における[3_{H]-oleic acid 取り込みの阻害評価}

ヒトBBBにおけるFATP1の基質であるoleic acidの輸送がDHAと同じ経路であるかを明らかに するために、1 mM非標識DHAを阻害剤として用い、FATP1の既知の輸送基質である[3_H]-oleic

acidの細胞内取り込みの阻害実験を行った(Figure 2-8)。取り込み時間は1 minで行った。[3

H]-oleic acidの取り込み量は1 mM 非標識DHAにより38.6%減少し、有意な差があった(P<0.01)。

Figure 2-8 Inhibitor effect of DHA on uptake of [3_{H]-oleic acid by hCMEC/D3 cell line.}

The uptake of [3_{H]-oleic acid from a solution of 1.02 nM [}3_{H]-oleic acid in ECF buffer containing fatty acid free-BSA ([}3_H]-oleic

acid / fatty acid free-BSA at 1 : 1 molar ratio) at 37°C for 1 min was measured in the absence (control, open column) and in the presence of 1 mM DHA (closed column).Four cell preparations were used in each group. Uptake was expressed as the cell/medium ratio (μL/mg protein), calculated by dividing the cellular uptake amount (mol/mg of protein) by the test substrate concentration in the uptake medium (mol/L). The uptake is shown as percent of the C/M ratio in the control group. Each point and column represent the mean ± SEM (n=4, independent cells). ** p < 0.01, significantly different from the control group (Student’s t-test).

- 24 -

第5 節 hCMEC/D3 細胞におけるDHA の細胞内取り込みに対するFATP1 の寄与

本節では、hCMEC/D3のDHA輸送にFATP1が関与するかを明らかにするため、FATP1特異

的なsiRNAを用いたRNAi法によりhCMEC/D3細胞のDHAの細胞内取り込みにおけるFATP1の 寄与を評価した。RNAi法によるFATP1の発現抑制を確認するため、定量RT-PCR法とwestern blottingを行った。

RNAi法によるhCMEC/D3細胞におけるFATP1の遺伝子の発現抑制の評価

FATP1 がsiRNA によって抑制された条件下で[14_{C]-DHA の細胞内取り込み実験を行うため、}

mRNA レベルのFATP1 の抑制を確認することにした。ヒトFATP1 を標的としたsiRNA は、 Invitrogen から購入したStealth™ Selected RNAi を用い、FATP1-siRNA 群とした。Negative control としてFATP1 を標的としたsiRNA を同じGC 含有率であるnegative control medium GC duplex #3 を用い、negative control siRNA 群とした。hCMEC/D3 細胞にヒトFATP1 標的 siRNA もしくはnegative control medium GC duplex #3 を処理し、mRNA を抽出し、逆転写反 応によりcDNA を作製した。Power SYBR green を蛍光試薬に用いて、FATP1 とβ-actin の定 量RT-PCR を行った。hCMEC/D3 細胞におけるFATP1 のmRNA 量はβ-actin で補正した

(Figure 2-9)。FATP1-siRNA 群のFATP1 のmRNA 量は、negative control siRNA 群と比較して

- 25 -

Figure 2-9 Effect of FATP1-siRNA treatment on mRNA levels of FATP1 in hCMEC/D3 cell line.

hCMEC/D3 cells were treated with 25 nM siRNA targeted to FATP1 (FATP1 siRNA) or 25 nM Stealth RNAiTM _siRNA

Negative Control Med GC Duplex (Negative control siRNA) using Lipofectamine RNAiMAX for 6 h, then cultured for 42 h after replacement of the medium with fresh medium, and used for the experiments. The mRNA expression level of FATP1 normalized by that of β-actin in hCMEC/D3 cells treated with negative control siRNA (open column) or FATP1 siRNA (closed column). Three cell preparations were used in each group. Each column represents the mean ± SEM (n=3, independent cells). ***p < 0.001, significantly different from the negative control siRNA group (Student’s t-test).

RNAi法によるhCMEC/D3細胞におけるFATP1のタンパク質の発現抑制の評価

FATP1がsiRNAによって抑制された条件下で[14_{C]-DHAの細胞内取り込み実験を行うため、}

FATP1がタンパク質レベルで抑制されているかを確認することにした。siRNAを処理した hCMEC/D3細胞のwhole cell lysate画分において、FATP1とβ-actinのwestern blotを行った

(Figure 2-10)。その結果、FATP1とβ-actinがそれぞれの目的サイズ(71 kDa、42 kDa)にバンド

が検出された(Figure 2-10A)。FATP1のバンド強度はβ-actinで補正し、negative control siRNA

群のFATP1のバンド強度を100%としたところ、FATP1-siRNA群のFATP1発現量をβ-actinで補 正した値は53.2%減少した(Figure 2-10B)。

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Figure 2-10 Effect of FATP1-siRNA treatment on protein expression levels of FATP1 in hCMEC/D3 cell line.

hCMEC/D3 cells were treated with 25 nM siRNA targeted to FATP1 (FATP1 siRNA) or 25 nM Stealth RNAiTM _siRNA

Negative Control Med GC Duplex (Negative control siRNA) using Lipofectamine RNAiMAX for 6 h, then cultured for 42 h after replacement of the medium with fresh medium, and used for the experiments. (A) Western blot analysis of FATP1 and β-actin in whole-cell fraction from a single cell preparation. The protein expression levels of FATP1 and β-actin in

hCMEC/D3 cells were determined by western blot analysis. Western blot analysis was performed at 1 time. (B) The protein level of FATP1 was measured by densitometry and normalized by that of β-actin. The relative band intensities of FATP1/β-actin in hCMEC/D3 cells treated with negative control siRNA (open column) or FATP1 siRNA (closed column) are shown (n=1, number of lane in western blot analysis).

RNAi法によるhCMEC/D3細胞における細胞内[14_{C]-DHA取り込みの評価}

Fig. 2-9及びFig. 2-10に示した結果から、ヒトFATP1標的siRNA処理によってhCMEC/D3細胞

におけるFATP1の遺伝子及びタンパク質の発現抑制が確認できたことから、ヒトFATP1標的

siRNAをFig. 2-9及びFig. 2-10と同じ条件でhCMEC/D3細胞に処理し、[14_{C]-DHAの細胞内取り}

込み実験を行い、hCMEC/D3のDHA輸送におけるFATP1の関与を明らかにすることにした

(Figure 2-11)。FATP1-siRNA処理群で取り込み時間5 min及び20 minの [14_{C]-DHAの取り込みは}

negative control siRNA群と比べてそれぞれ、31.5%及び38.9%に減少し、それぞれ有意な差が あった(p<0.01)。取り込み時間5 min及び20 minにおけるDHAの取り込み量の減少率(31.5%及

- 27 -

び38.9%)からタンパク質発現量の減少率(53.2%)を割り、[14_{C]-DHAの全体の取り込みに対する}

FATP1の寄与率を計算すると、寄与率はそれぞれ、59.2%及び73.1%と算出された。

Figure 2-11 Effect of FATP1-siRNA treatment on uptake of [14_{C]-DHA in hCMEC/D3 cell}

line.

hCMEC/D3 cells were treated with 25 nM siRNA targeted to FATP1 (FATP1 siRNA) or 25 nM Stealth RNAiTM _siRNA

Negative Control Med GC Duplex (Negative control siRNA) using Lipofectamine RNAiMAX for 6 h, then cultured for 42 h after replacement of the medium with fresh medium, and used for the experiments. The uptake of [14_{C]-DHA from a solution}

of 266 nM [14_{C]-DHA containing fatty acid free-BSA ([}14_{C]-DHA / fatty acid free-BSA at 1 : 1 molar ratio) was measured at}

37°C for 5 min and 20 min, using hCMEC/D3 cells treated with negative control siRNA (open circles) or FATP1 siRNA (closed circles). Four cell preparations were used in each time points. Uptake was expressed as the cell/medium ratio (μL/mg protein), calculated by dividing the cellular (mol/mg of protein) by the test substrate concentration in the uptake medium (mol/L). Each point represents the mean ± SEM (n=4, independent cells). *p < 0.05 and **p < 0.01, significantly different from the negative control siRNA group (Student’s t-test).

- 28 -

第6 節 insulin によるhCMEC/D3 細胞におけるFATP1 発現、局在変化、輸送機能評価 本節では、insulinがBBBのFATP1の機能を変動するかを明らかにするために、insulinを添加 したhCMEC/D3細胞を用いて、FATP1の局在とDHA及びFATP1基質の取り込み量を評価し た。 insulin処理hCMEC/D3細胞におけるFATP1の免疫染色 insulinがヒト脳毛細血管内皮細胞のFATP1の局在を変化させるか明らかにするために、50 nM insulin処理hCMEC/D3細胞におけるFATP1の免疫染色を行い、insulinによるFATP1の細胞 内局在の変化を評価した(Figure 2-12)。FATP1の蛍光は細胞内スペースと同様に細胞表面に検

出された(Figure 2-12(i), green)。FATP1と核マーカーのPIの共染色では、細胞核の外側に

FATP1の蛍光が確認された。50 nM insulinを処理した細胞(50 nM insulin群)は、insulin未処理し た細胞(control群)と比べ、細胞表面におけるFATP1のimmunoreactivityを増強させた(Figure

- 29 -

Figure 2-12 Effect of insulin on localization of FATP1 in hCMEC/D3 cell line.

hCMEC/D3 cells were preincubated in EBM-2 medium without (control) and with 50 nM insulin at 37°C for 30 min, and immediately rinsed with PBS and immunostained for FATP1 and nuclei. (i, ii, iii) without insulin treatment (control), (iv, v, vi) with 50 nM insulin treatment. PI was used as a nuclear marker. (i, iv) FATP1 (green), (ii, v) nuclei (red), (iii, vi) merged image of FATP1 and nuclear staining (yellow). Magnification x 50. Scale bar represents 20 μm (i-vi).

LC-MS/MSを用いたinsulin処理時hCMEC/D3細胞のFATP1の発現量の評価 Fig. 2-12 に示した結果から、insulinがhCMEC/D3細胞のFATP1の局在変化を定性的に示し た。免疫染色を用いた解析では、一次抗体の特異性の観点からFATP1以外の分子も含めて検出 している可能性が否定できないため、細胞全体のFATP1の発現量やFATP1の局在変化を定量的 に把握することは難しい。そのため、続いては、hCMEC/D3細胞の細胞画分を調製し、QTAP approachによりinsulinがヒト脳毛細血管内皮細胞のFATP1の局在を変化させるか定量的に明ら かにすることにした。insulin未処理(control群)とinsulin 50 nM処理したhCMEC/D3細胞(insulin 50 nM群)のwhole cell lysate画分及びcrude membrane画分及びplasma membrane画分を調製

- 30 -

し、LC-MS/MS MRM modeを用いてFATP1の絶対定量を行った(Table 1)。FATP1ペプチドに 関して、2チャネルの平均値を算出した。その結果、insulin 50 nM群のFATP1の発現量はwhole cell lysateでの発現量は、control群と比べて109%と同程度だったのに対し、crude membrane画 分では72%減少し、plasma membrane画分では201%に増加した。

Table 1 QTAP analysis of FATP1 protein expression in different fractions of hCMEC/D3 cells without and with 50 nM insulin treatment for 30 min.

Fraction

Protein expression level of FATP1

Expression ratio (insulin/control) Control 50 nM insulin fmol/μg protein whole cell 4.87 5.32 1.09 crude membrane 3.45 0.965 0.280 plasma membrane 2.29 4.60 2.01

hCMEC/D3 cells were cultured for 6 days in φ10 cm dishes, and then preincubated in EBM-2 medium without (control) or with 50 nM insulin at 37°C for 30 min. The cell surface was quickly washed with PBS without insulin, and whole-cell fraction, crude membrane fraction and plasma membrane fraction from a single cell preparation were prepared as described in “chapter 6-3”. The protein expression of FATP1 was quantified by means of our established QTAP technique. Three fractions (50 μg protein each) of hCMEC/D3 cells were solubilized and digested with LysC and trypsin as described in “chapter 6-5”. Peptide samples spiked with the internal standard peptide were injected into the liquid chromatograph– tandem mass spectrometer. Measurement was performed as described in “chapter 6-5”. Human FATP1 was measured using the peptides and selected reaction monitoring (SRM) transitions as described in “chapter 6-5”. FATP1 was monitored with four sets of SRM transitions derived from one set of standard and internal standard peptide as described in “chapter 6-5”. Signal peaks with a peak area count of over 5000 detected at the same retention time as an internal standard peptide were defined as positive. The positive peak was detected in two SRM transitions. Each value represents the mean of quantitative values obtained from two SRM transitions.

- 31 -

insulin処理hCMEC/D3細胞における[14_{C]-DHA及び[}3_{H]-oleic acidの細胞内取り込みの評価}

insulinがヒト脳毛細血管内皮細胞のDHA及びFATP1基質の取り込みに与える影響を明らかに するために、hCMEC/D3細胞における[14_{C]-DHA及びFATP1の既知の基質である[}3_{H]-oleic acid}

の取り込みにおける影響を評価した(Figure 2-13)。hCMEC/D3細胞に50 nMもしくは5 μM

insulinを含む培地(50 nM insulin群、5 μM insulin群)もしくは含まない培地(control群)で30 minプ

レインキュベーションし、培地を除いて取り込み実験に用いた。取り込み時間は5 minで行っ

た。50 nM insulin群及び5 μM insulin群によって[14_{C]-DHAの細胞内取り込みはcontrol群と比べて}

それぞれ1.55倍、1.92倍に高く、5 μM insulin前処置では有意な差があった (p<0.01) (Figure

2-13A)。一方、50 nM insulin群及び5 μM insulin群では、[3_{H]-oleic acidの細胞内取り込みはcontrol}

群と比べてそれぞれ1.16倍、1.27倍高く、5 μM insulin群では有意な差があった(p<0.01) (Figure

- 32 -

Figure 2-13 Effect of insulin on uptakes of [3_{H]-oleic acid (A) and [}14_{C]-DHA (B) in}

hCMEC/D3 cell line.

hCMEC/D3 cells were preincubated in EBM-2 medium without (control, white column) and with 50 nM (gray column) or 5 μM (closed column) insulin for 30 min at 37°C, then rinsed with ECF buffer at 37°C, and used immediately for uptake experiments. The uptake of [14_{C]-DHA was measured from solutions of 314 nM [}14_{C]-DHA (A) and 20 nM [}3_{H]-oleic acid (B)}

in ECF buffer containing fatty acid free-BSA ([14_{C]-DHA or [}3_{H]-oleic acid / fatty acid free-BSA at 1 : 1 molar ratio) without}

insulin at 37°C for 5 min.Four cell preparations were used in each group. Uptake was expressed as the Cell/Medium ratio (μL/mg protein), which was calculated by dividing the uptake amount (mol) by the concentration of substrate in the incubation buffer (mol/μL) and the protein amount of cells (mg protein). Each column represents the mean ± SEM (n=4, independent cells). ** p <0.01, significantly different from the control group (Tukey’s post hoc test).

- 33 - 第7 節 考察

FATP1 発現HEK293 細胞を用いたFATP1 のDHA の基質評価

本章第3 節の結果から、FATP1 はDHA を細胞内への取り込み方向に輸送し、その輸送は oleic acid とFATP1 の同じ結合部位を介して輸送されることが初めて示された。このことか

ら、FATP1 が非エステル化DHA を輸送するトランスポーターであることが初めて明らかにな

った。

hCMEC/D3 細胞株を用いた脳毛細血管内皮細胞のDHA 輸送におけるFATP1 の関与

本章第4 節の結果から、ヒト脳毛細血管内皮細胞におけるDHA の細胞内輸送には担体介在

輸送が存在することが示され、その輸送経路はFATP1 の既知の基質であるoleic acid の経路と

共有していることが示唆された。さらに、本章第5 節の結果から、FATP1 は脳毛細血管内皮細

胞でのDHA の細胞内取り込みに主に寄与することが初めて明らかになった。ヒト脳毛細血管 初代培養細胞を用いた解析で、FATP1 は基質をluminal 側からabluminal 側とabluminal 側から luminal 側の両方向へ輸送することから(Mitchell et al. 2009, Mitchell et al. 2011)、FATP1 はDHA も同様にluminal 側からabluminal 側とabluminal 側からluminal 側の両方向へ輸送する可能性 が考えられる。

insulin による脳毛細血管におけるFATP1 の局在及び輸送機能の変化

本章第6 節の結果から、細胞外のinsulin は脳毛細血管内皮細胞のFATP1 の細胞全体の発現 量を変えずに、細胞膜へのトランスロケーションを促進することが定性的及び定量的に示され

- 34 -

た。また、脳毛細血管内皮細胞におけるDHA とFATP1 の輸送基質の細胞内取り込みは細胞外

insulin に依存して制御されていることが示された。

DHA は肝臓でα-linoleic acid から生合成される。肝臓でのDHA 生合成効率は生体内のDHA 濃度が減少した場合に増加し(Rapoport & Igarashi 2009)、膵臓のGPR40 を介してinsulin 分泌 を促すことが報告されている(Itoh et al. 2003)。これらの報告に基づき、私は、血液から脳へ DHA を輸送する恒常性メカニズムは以下の4 つのステップを経ると考えた。 (1) 体内のDHA 濃度に応じて肝臓でのDHA 生合成が促進される。 (2) DHA は血液循環を介して膵臓へ輸送される。 (3) insulin 分泌が膵臓におけるGPR40 を介して促進される。 (4) 分泌されたinsulin に従って、血液から脳へのDHA 輸送が増加する。 血糖値が食事摂取後に上昇すると、insulin は膵臓のβ 細胞から分泌される。血中insulin 濃度 は食後1〜2 時間で上昇し、数時間後、食事前のレベルまで低下する。本章第6 節で示した通 り、hCMEC/D3 細胞における[14_{C]-DHA の取り込みはinsulin 処理後30 min で増加した。した}

がって、私は、FATP1 を介した脳へのDHA の供給は、血中に分泌されたinsulin の作用によっ て、食後すぐに効率的に増加すると考えた。insulin は、insulin シグナリングを介して脳に様々 な神経保護作用を及ぼす(De Felice et al. 2009, Zhao et al. 1999, Zhao & Alkon 2001)。さらに、 脳内のinsulin シグナルの障害はAD の発症と関連している(Wang et al. 2010, Holscher 2011)。 実際に、血中insulin 濃度の低下はAD 病因に関与していると報告されている(Wang et al. 2010, Holscher 2011)。食事によるDHA の摂取がAD を改善することが報告されており(Hashimoto et al. 2005)、AD 患者における脳内DHA 量は健常人より低い(Celik et al. 2002)。私は、これらの

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結果はinsulin シグナル障害の結果としてBBB を介したDHA 供給が減少する可能性を示唆し

ており、AD の症状進行に関与している可能性があると考える。

FATP1 発現系及びhCMEC/D3 細胞におけるFATP1 によるDHA 輸送量の比較

本章第5 節で示した通り、hCMEC/D3 細胞における[14_{C]-DHA の細胞内取り込みにFATP1}

が主に寄与していることを示したが、そのcell/medium ratio (-2500 μL/mg protein, Fig. 2-6)は、 本章第3 節で示した、FATP1 発現HEK293 細胞におけるcell/medium ratio (10-80 μL/mg protein, Fig. 2-4)と大きく異なる。私は、この原因として、FATP1 はco-factor を必要としてい る可能性があると考えた。FATP1 はミトコンドリアに発現し、carnitine palmitoyltransferase I と複合体を形成しており、サイトゾルのacyl-CoA をミトコンドリア内へ輸送することが報告 されている(Sebastián et al. 2009)。ミトコンドリアのFATP1 は2- oxoglutarate dehydrogenase 活性を増加させ(Wiczer et al. 2009)、脂肪滴の分配のために小胞体のDiglyceride acyltransferase 2 と共役することも報告されている(Xu et al. 2012)。これらの報告に基づき、私は、細胞膜の FATP1 がその基質輸送にco-factor を必要としており、そのco-factor がhCMEC/D3 細胞には

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第3 章 FATP1 の脳毛細血管における局在及び輸送方向性及びtaurine、biotin の基質評価

第1 節 序論

第1 項 BBB における FATP1 の物質輸送に関する役割と輸送方向性

第2 章で述べた通り、ヒト脳毛細血管内皮細胞においてFATP1 がDHA の細胞内取り込みに

寄与し、insulin がDHA とFATP1 基質の細胞内取り込み量を促進させることを示した。ここ

で、FATP1 がBBB における血液から脳実質への方向と脳実質から血液への方向の輸送に関与

しているがどうかを議論する上で、脳毛細血管におけるFATP1 の局在性(abluminal / luminal 側) を知ることは重要である。当研究室の久保らの研究により、近年、単離ブタ脳毛細血管の細胞 膜画分とQTAP techniques を用いた研究から、FATP1 が脳毛細血管においてluminal 膜よりも abluminal 膜に局在していることが報告された(Kubo et al. 2015)。しかし、fractionation を用い た解析ではホモジナイズされた状態での結果であるため、全体の均質特性のみを反映する (Wang et al. 2010)。そのような結果は、集団の不均一性に関する重要な情報を見逃す可能性が ある(Wang et al. 2010)。この課題を回避する手法として免疫染色が挙げられるが、脳毛細血管

におけるFATP1 の局在に関して、免疫組織学的な局在解析は未だ行われていない。もし、

FATP1 が本当にBBB のabluminal 膜に局在する場合、BBB におけるFATP1 を介した血液か

ら脳実質へのDHA の供給を考えるためには、内皮細胞から排出方向への輸送について議論す

る必要がある。第2 章で述べた通り、FATP1 はDHA を細胞内に輸送することから、細胞外へ の排出も担う可能性が考えられる。

- 37 - 第2 項 taurine 及び biotin の BBB における輸送メカニズム 第1 章第3 節で述べた通り、神経保護作用を持つtaurine やカルボキシラーゼのCofactor と して機能するbiotin はBBB を介して血液から脳へ供給されると考えられるが、脳毛細血管内皮 細胞からabluminal 膜を介した排出のメカニズムは明らかになっていない。また、taurine はヒ トにおいてはluminal 膜を介した血液から脳毛細血管内皮細胞への取り込みにはTauT 以外の担 体が関与している可能性がある。第2 章で述べた通り、ヒト脳毛細血管内皮細胞において FATP1 がDHA の細胞内取り込みに寄与することを示した。そこで、DHA と同様にAD 時の脳 内量が低下するtaurine と、DHA と共通の部分構造を持つbiotin がFATP1 によって輸送される 可能性が考えられる。

以上のことより、本章では、以下の3 つを目的とした。

i. FATP1 が脳毛細血管において、abluminal 膜のみに局在しているか、

luminal 膜にも発現しているかを免疫組織学的解析から明らかにすること

ii. 定常状態におけるFATP1 の DHA の輸送方向性を明らかにすること

iii. FATP1 発現 HEK293 細胞系を用いて、FATP1 が taurine、biotin を輸送する か明らかにすること

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第2 節 マウス脳切片を用いたFATP1 の蛍光免疫染色による局在解析

マウス脳毛細血管におけるFATP1 の局在を免疫組織学的に明らかにするため、

C57BL/6NCRSLC マウスの脳を用いて、FATP1 の蛍光免疫染色を行った(Figure 3-1)。脳毛細 血管のluminal 及びabluminal 膜のマーカーとして抗GLUT1 抗体を用いてGLUT1 の共染色を 行った。FATP1 の染色では血管状の染色蛍光(Figure 3-1、green)が検出された。FATP1 と GLUT1 の共染色の結果から、FATP1 の染色(Figure 1、green)はGLUT1 の染色像(Figure

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Figure 3-1 Immunohistochemical analysis of FATP1 in C57BL/6 mouse brain sections.

GLUT1 was used as a brain microvessel marker expressed at both luminal and abluminal membranes of brain microvessel endothelial cells. (A) FATP1 (green), 10 x magnification; (B) FATP1 (green), 50 x magnification; (C) GLUT1 (red), 50 x magnification; (D) Merged image of FATP1 and GLUT1 staining (yellow), 50 x magnification. Scale bar=80 μm (A), 20 μm (B–D).

第3 節 FATP1 安定発現系のメタボローム解析

定常状態でのDHA の輸送方向性を明らかにするため、通常の培地で培養中のFATP1 発現 HEK293 細胞系を用いたメタボローム解析を行った。メタボロ―ム解析にはキャピラリー電気 泳動を用いることで、nucleoside、nucleoside、アミノ酸、phosphate、CoA 化合物、糖を含む

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1000 以上の物質の検出ができる(Soga et al. 2007, Soga et al. 2002, Bonen et al. 2000, Soga & Heiger 2000, Liu et al. 2005)。キャピラリー電気泳動では脂肪酸及びリン脂質の分離に不向きで あることから、脂肪酸及びリン脂質の分析系には液体クロマトグラフィーを用いた解析が必要 である。以上のことから、本章第3 節では、キャピラリー電気泳動と液体クロマトグラフィー の両方の分析系を有するHuman metabolome technologies 社にFATP1 発現HEK293 細胞系の

メタボロ―ム解析を委託し、定常状態におけるDHA 細胞内量を相対定量比較した。

FATP1 発現HEK293 細胞とmock HEK293 細胞の通常の培地で培養し、capillary electrophoresis-time of flight mass (CE-TOFMS)とliquid chromatography–time of flight mass spectrometry (LC-TOFMS)を用いて、whole cell のメタボローム解析を行った。DHA、

taurine、biotin を含む1020 種類の内因性代謝物質ライブラリーの中から、各化合物のm/z 値と CE-TOFMS の分析はmigration times、LC-TOFMS の分析はretention time に基づき、212 個の 代謝物がFATP1 発現細胞もしくはmock HEK293 細胞のいずれかで検出され、そのピーク面 積を内標準物質で補正した相対面積(relative area)について、FATP1 発現HEK293 細胞とmock HEK293 細胞で比較を行った(Table 2)。

FATP1発現HEK293細胞のDHAのCoparative analysis ratioは0.52であり、細胞内DHAの量は mock HEK293細胞と比べて0.48倍低い値だった。

DHA以外の化合物について、Coparative analysis ratioが2.0以上もしくは0.5以下の物質、 taurine、biotinについて記述する。FATP1の細胞内取り込み方向の基質として報告されている palmitic acid及びlignoceric acidそれ以外の長鎖脂肪酸(pentadecanoic acid、heptadecanoic acid、stearic acid、nonadecanoic acid)及び極長鎖脂肪酸(tricosanoic acid、cerotic acid)は、細胞