第1節 試薬 放射標識化合物
[3H]-oleic acid (oleic acid [9,10-3H(N)], 45.5 Ci/mmol)
PerkinElmer Inc., Massachusetts, USA [14C]-Inulin (10 μCi/vial)
American Radiolabeled Chemicals Inc., Missouri, USA [14C]-docosahexaenoic acid (DHA [1-14C], 51.0 mCi/mmol)
Moravek Biochemicals Inc., California, USA [3H]-biotin (biotin d-[8,9-3H], 60 Ci/mmol)
American Radiolabeled Chemicals Inc., Missouri, USA [3H]-taurine (taurine [2,2-3H(N)]-, 31 Ci/mmol)
PerkinElmer Inc., Massachusetts, USA
HEK293細胞培養関連試薬
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) with out sodium bicarbonate
Nissui Pharmacetical, Tokyo, Japan Hygromycin B invitrogen Carlsbad, CA, USA Fetal bovine serum (FBS) Moregate, Bulimba, Australia Trypsin-ethylenediamide-N’, N’, N’, N’-tetraacetic acid (EDTA)
Gibco BRL, Grand Islannd, NY, USA
- 84 - hCMEC/D3細胞培養関連試薬
EBM-2 MV Bullet KitTM Takara bio inc, Shiga, Japan Endothelial Cell Basal Medium-2 (EBM-2) Lonza, Basel, Switzerland EGMTM-2MV singleQuaotsTM kit Lonza, Basel, Switzerland Collagen type I BD bioscience, Lincoln Park, NJ Penicillin-Streptomycin invitrogen Carlsbad, CA, USA HEPES Sigma-Aldrich, St Louis, Mi, USA basic fibroblast growth factor (bFGF) Sigma-Aldrich, St Louis, Mi, USA 0.25% Trypsin-EDTA invitrogen Carlsbad, CA, USA Hydrocortisone invitrogen Carlsbad, CA, USA Chemically Defined Lipid Concentrate invitrogen Carlsbad, CA, USA Fetal Bovine Serum "Gold" PAA The Cell Culture Company, Pasching, Austria セルバンカー Nippon Zenyaku Kogyo, Fukushima, Japan
取り込み実験、排出実験及び細胞間透過性実験関連試薬
Oleic acid Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation, Osaka, Japan Docosahexaenoic acid Cayman Chemical, Michigan, USA Free fatty acid bovine serum albumin
Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation, Osaka, Japan insulin, from Bovine Pancreas
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Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation, Osaka, Japan HEPES DOJINDO, Kumamoto, Japan Aβ-Protein fragment25-35 (Aβ25-35 peptide) Sigma-Aldrich, St. Louis, Mi, USA DHA-d5 (the purity of deuterated form (d1-d5) ≧99%), at the 21, 21, 22, 22 and 22 positions
Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA Fluorescein Isothiocyanate (FITC)-dextran (4000 Da)
Sigma-Aldrich, St. Louis, Mi, USA Aβ25-35 HiLyteᵀᴹ Fluor 488 AnaSpec, Inc., Fremont, CA, USA
タンパク質関連試薬
DC-protein assay Bio-Rad, Hercules, USA Albumin from Bovine Serum (BSA)
Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation, Osaka, Japan Sodium ethylenediaminetetraacetic (EDTA-Na)
Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation, Osaka, Japan Trizma base Sigma-Aldrich, St. Louis, Mi, USA Sequencing Grade modified trypsin Promega, Madison, WI, USA
遺伝子関連試薬
RNeasy Plus Mini Kit QIAGEN, Valencia, CA, USA Rever Tra Ace Toyobo, Osaka, Japan
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Prime STAR Max DNA Polymerase Takara, Shiga, Japan dNTP mixuture (10mM) Takara, Shiga, Japan Oligo(dT)15 Primer Takara, Shiga, Japan
抗体
Mouse 由来monoclonal anti FATP1 antibody (Clone # 308420, MAB3304)
R&D systems Inc., Minneapolis, MN, USA Rabbit由来polyckical anti FATP1 antibody Abcam, Cambridge, UK Rabbit 由来polyclonal anti ACSVL5 antibody (M-100, sc-25541)
Santa Cruz Biotechnology, Inc., California, USA Mouse 由来monoclonal anti β-actin antibody (AC-74)
Sigma-Aldrich, St. Louis, Mi, USA Rabbit由来anti-FATP1 antibody (ab81875) Abcam, Cambridge, UK Mouse由来anti-Na+ K+-ATPase antibody [464,6] (ab7671)
Abcam, Cambridge, UK
HRP標識抗rabbit IgG抗体はCHEMICON Inc. (Temecula, CA, USA)とAbcam (Cambridge, UK)から、HRP標識抗mouse IgG抗体はCHEMICON Inc.とInvitrogen (Carlsbad, CA, USA)か ら購入した。Alexa488およびAlexa568標識anti-mouse、rabbit及びguinea pig二次抗体は Molecular Probes Inc. (Eugene, OR, USA)から購入した。
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Guinea pig 由来monoclonal anti GLUT1 antibody及びrabbit由来monoclonal anti GLUT1
antibodyは北海道大学大学院医学研究科解剖発生学分野 教授 渡辺雅彦 先生から供与して
いただいた。
Western blotting
30% acyrlamide/Bis solution 29:1(3.3% C) Bio-Rad, Hercules, USA プレシジョンPlusデュアルスタンダード Bio-Rad, Hercules, USA ECL Prime Western Blotting Detection System GE Healthcare, Buckinghamshire, UK Amercham HyperfilmTM MP High performance autoradiography film
GE Healthcare, Buckinghamshire, UK protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich, St. Louis, Mi, USA Lane Marker Reducing Sample Buffer Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 4-15% precast polyacrylamide gel Bio-Rad, Hercules, CA, USA Pierce BCA Protein Assay kit Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 4-15% precast polyacrylamide gel Bio-Rad, Hercules, CA, USA Tris/Glycine/SDS Buffer Bio-Rad, Hercules, CA, USA プレシジョン Plus プロテイン™オールブルースタンダード
Bio-Rad, Hercules, CA, USA iBlot® Dry Blotting System Invitrogen, Carlsbad, CA, USA iBlot® Gel Transfer Stacks, PVDF Invitrogen, Carlsbad, CA, USA 0.1% Tween-20 in Tris-buffered saline (TBST), pH 7.4 Nacalai Tesque, Kyoto, Japan
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Blocking one Nacalai Tesque, Kyoto, Japan SuperSignal West femto Maximum Sensitivity Substrate
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA
免疫染色試薬
ヒストファイン SAB-PO®キットブロッキング試薬Ⅱ10%ヤギ正常血清
Nichirei, Tokyo, Japan VECTASHIELD Mounting Medium
VECTOR LABORATORIES INC. Burlingame, CA, USA Propidium iodide Molecular Probes, Eugene, OR, USA
定量用ペプチド
膜タンパク質及び酵素タンパク質の定量用に用いた標準及び安定同位体標識ペプチドは、
Thermo-electron Corporation (Sedanstrabe, Germany)から購入した。ペプチドの純度は Thermo-electron Corporationにおいて、RP-
high-performance liquid chromatography
(
HPLC)-UV (detection wavelength 215 nm)とMALDI-TOF-MSにより95 %以上であることを確 認している。- 89 - 培養細胞
FATP1発現HEK293細胞及びmock HEK293細胞は本研究室の相澤 三四郎氏の研究により ヒト胎児由来腎臓細胞株であるHEK293細胞を宿主細胞として以下の方法で、構築された細胞 を用いた(Aizawa S., Master thesis, 2010)。
Open Biosystems Inc. (Palo Alto, CA, USA)から入手したヒトFATP1 cDNAを発現ベクター pcDNA5/FRT (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)にサブクローニングし、FATP1-pcDNA5/FRT構 築物の配列が、DNA配列決定により報告されているFATP1の配列(NCBI: NM_198580)と同一 であることを確認した。Lipofectamine試薬(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)を標準プロトコール に従って使用し、HEK細胞Flp-InTM-293(Invitrogen, Carlsbad, CA, US)に、構築した FATP1-pcDNA5/FRT発現ベクターまたはからempty-pcDNA5/FRTベクターをトランスフェクトし た。安定なcloneを、10%ウシ胎児血清および200μg/mLのhygromycin Bを含むDulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)で培養し、選択した。hCMEC/D3細胞はParis Descartes University Pierre-Olivier Couraud先生からご提供いただいたものを用いた。
実験動物
6-7週齢のC57BL/6雄マウスを日本SLC (Hamamatsu, Japan)から購入した。マウスは12 時間明暗周期でコントロールされている東北大学大学院薬学研究科動物舎で自由に水及び標準 固形飼料CRF-1 (Charles Liver)を摂取させて飼育した。8-10週齢まで飼育し、実験前日に16 hr絶食を行った。実験動物の取り扱いについては、東北大学薬学部動物実験委員会が作成した
「実験動物取り扱いに関する指針」に従って行った。
- 90 - 第2節細胞培養
HEK293細胞の培養
FATP1発現HEK293細胞及びmock HEK293細胞は加湿された5% CO2/air下、37°Cで培 養した。培地には10% FBS, 200 μg/mL hygromycin Bを含むDMEMを用いた。培養容器とし てTissue culture dish 100 × 20 mm Style Standard Dishes (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)を用いた。細胞を長期使用しないときはセルバンカーに3×106 cells/mLとなるように懸濁 し、クライオチューブ (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)に1 mLずつ分注して液体窒素 中で保存した。冷蔵保存した細胞は、立ち上げ時には3×106 cells/75 cm2の割合で培養し、3回 継代を行った後に実験に使用した。細胞の継代はsubconfluentに達したときに0.05% trypsin-0.53 mM EDTAを用いて細胞を回収し、3~5倍希釈して新しい培養容器に播き直した。
hCMEC/D3細胞の培養
Human BBB in vitroモデル細胞としてcochin研究所にて樹立された不死化ヒト脳毛細血管内 皮細胞であるhCMEC/D3細胞を用いた。培地は5 % FBS、10 mM HEPES、1 ng/mL bFGF、
1.4 μM Hydrocortisone、5 μg/mL Ascorbic acid、1% Penicillin-Streptomycinを含むEBM-2培地 もしくは、EGMTM-2MV singleQuaotsTM kit (2.5% fetal bovine serum, 0.025% VEGF, 0.025%
R3-IGF, 0.025% hEGF and 0.01% hydrocortisone)、5 μg/mL bFGF, 10 mM HEPES、1%
penicillin−streptomycinを添加したEBM-2培地を用いた。培養は加湿された5% CO2/air下、
37゜Cで行い、培養容器として細胞を播種する直前にCollagen type Iによって1 hrコラーゲン コートした10 cm dish (Corning Incorporated, NY, USA)、collagen type I coated 10 cm dish (IWAKI, Tokyo, Japan)を用いた。細胞の継代は、confluentに達した時に0.25% trypsin-EDTAを
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用いて細胞を回収し、1.0~1.5×106 cells/dishになるように新しい容器に播き直すことで行っ た。細胞を長期間使用しない場合は5% DMSO, 95% FBSに3.0×106cells/mLの割合で懸濁し た細胞をクライオチューブに分注し、液体窒素中で保存した。凍結した細胞は立ち上げ後、
2~3継代を行った後に実験に使用した。継代数は35以下になるように使用した。
insulin処理
insulin from Bovine serum (Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation, Osaka, Japan)をEBM-2 培地し、50 nM又は5 μM insulin含有EBM-2培地を調製し、その溶液をhCMEC/D3細胞に添 加し、加湿された5% CO2/air下、37°Cで30 min培養し、実験に用いた。
Aβ25-35 peptide処理
Aβ25-35 peptideは超純水で1 mMとなるように調製し、使用まで-80℃で保存
した。使用時にAβ25-35 peptideの凝集した不溶解性オリゴマーを形成するた
め、Aβ25-35 peptide 1 mM溶液を37°Cで7日間インキュベートした。EBM-2培地
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で0.1 μM、1 μM又は10 μMに希釈し、その溶液をhCMEC/D3細胞に添加し、加 湿された5% CO2/air下、37°Cで24 hr培養し、実験に用いた。
第3節 培養細胞からの各画分(Whole cell lysate、crude membrane画分、
plasma membrane画分)の調製 密度勾配遠心法による調製
FATP1発現HEK293細胞、mock HEK293細胞及びhCMEC/D3細胞を第2節で 述べた方法で培養し、3継代後、confluentに達した細胞の培地を取り除き、細 胞表面をPBS溶液で2回洗浄した。さらにPBS溶液2 mLを加え、細胞をスクレ ーパーによってdishから剥がしとって回収し、遠心した(230 g, 5 min, 4゜C)。
遠心後、PBS溶液を取り除き、2 mLのsuspension buffer [10 mM Tris-HCl (pH7.4), 85.6 g/L sucrose]を加えて懸濁し、protease inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich) 20 μLを加えてwhole cell lysateとした。Whole cell lysateを窒素ガス細 胞粉砕器に移しnitrogen cavitation 法(450 psi, 15 min, 4゜C)によって細胞を破 砕した。この破砕組織懸濁液を遠心(10,000 g, 10 min, 4゜C)することでdebris 画分を取り除き、上清を回収した。回収した上清は超遠心(100,000 g, 40 min, 4゜C)を行い、得られたpelletをcrude membrane画分とし、ice-cold suspension buffer (250 mM sucrose, 10 mM Tris-HCl, pH 7.4)で懸濁した。この懸濁液を 38% sucrose buffer(10 mM Tris-HCl, pH 7.4)の上に重層して超遠心(100,000 g, 40 min, 4゜C)し、中間層を回収した。これを再度超遠心(100,000 g, 40 min, 4゜C)し、得られたpelletをplasma membrane画分とした。このplasma
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membrane画分 はice-cold suspension bufferに懸濁した。DC protein assay kit
(Bio-Rad) を用いて各サンプルのタンパク質濃度を測定した。検量線はbovine
serum albumin (BSA)で作成し、吸光度の測定にはModel 680 microplate reader (Bio-Rad)を用いた。
Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) bufferによるWhole cell lysate調製
hCMEC/D3細胞を第2節で述べた方法で培養し、3継代後、confluentに達した細胞の培地を取 り除き、PBS溶液で2回洗浄した。RIPA buffer (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan)の標準プロトコー ルに従ってWhole cell lysateを調製した。
Cell Surface Protein Isolation Kitによるplasma membrane画分調製
hCMEC/D3細胞を第2節で述べた方法で培養し、3継代後、confluentに達した細胞の培地を取 り除き、PBS溶液で2回洗浄した。Cell Surface Protein Isolation Kitの標準プロトコールに従って plasma membrane画分を調製し、Lane Marker Reducing Sample Buffer (Thermo Fisher Scientific)を加え、95゜Cで5 minインキュベーションした。インキュベーション後、使用するま で-20゜Cで保管した。
第4節Western blot
密度勾配遠心法によって調製された画分のWestern blot
第3節で述べた密度勾配遠心法によって方法で調製したFATP1発現HEK293細胞、mock HEK293細胞及びhCMEC/D3細胞のwhole cell lysate画分に、終濃度5%となるように還元剤と
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して2-mercaptoethanolを加えた2×sample buffer [10% 2-mercaptoethanol, 4% sodium dodecyl sulfate (SDS), 125 mM Tris-HCl (pH6.8) 10% Sucrose, 0.004% Bromophenol blue in water]を等 量加えた後、95゜C で5 minインキュベーションした。インキュベーション後、直ちに氷冷 し、泳動サンプルとした。8% acryl amide gelに泳動サンプルを16 μg protein/laneの量をアプラ イし、泳動バッファー[25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS in water]中でゲル1枚当たり
20 mAで1 hr電気泳動を行い、タンパク質をサイズ別に分画した。泳動後のゲルを転写バッフ
ァー [25 mM Tris. 192 mM glycine, 0.1% SDS in buffer]に5 min浸した後、PVDF膜に、PVDF膜 1 cm2当たり2 mAで30 min 転写した。PVDF膜をブロッキングバッファー[25 mM Tris-HCl, 125 mM NaCl, 4% skim milk in 0.1% Tween 20 PBS溶液, pH8.0]に浸し、室温で1 hrインキュベ ートすることでブロッキングを行った。1次抗体として抗FATP1抗体(1.0 μg/mL rabbit anti-FATP1 antibody, MAB3304)及び抗β-actin抗体(0.5 μg/mL mouse anti-β-actin antibody, AC-74)を それぞれ含むブロッキングバッファーで4゜C、16 hr振とうした。0.1% Tween20含有PBS溶液 で6回洗浄した後、2次抗体であるHRP標識抗rabbit IgG抗体(Chemicon)及びHRP標識抗mouse IgG抗体(Chemicon)をブロッキングバッファーで5000倍希釈し、室温にて1 hr振とうした。2次 抗体反応後、0.1% Tween20含有PBS溶液で6回洗浄した。免疫反応はenhanced
chemiluminescence kit ECL plus (Pierce, Rockford, IL, USA)に5 min反応させ可視化し、
Amersham HyperfilmTM MP (GE Healthcare)に露光して検出を行った。Densitometric imagesは ImageJによって解析した。
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RIPA buffer及びCell Surface Protein Isolation Kitによって調製された画分のWestern blot 第3節で述べたRIPA bufferを用いて調製した、hCMEC/D3細胞のwhole cell lysate画分を Pierce BCA Protein Assay kitを用いてタンパク質濃度を測定した。タンパク質濃度の検量線は BSAで作成し、吸光度を測定した。5 minの1量のLane Marker Reducing Sample Bufferを加 えた後、95゜Cで5 minインキュベーションした。直ちに氷冷し、泳動サンプルとした。Cell Surface Protein Isolationを用いて調整したhCMEC/D3細胞のplasma membrane画分を95゜
Cで5 minインキュベーションし、泳動サンプルとした。4-15% precast polyacrylamide gelに 泳動サンプルを12又は24 μg/lane(whole cell lysate画分)、15 μL/lane (plasma membrane画 分)をアプライし、Tris/Glycine/SDS Buffer (Bio-rad)中でゲル1枚当たり30 mAで30 min～1 hr 電気泳動を行い、タンパク質をサイズ別に分画した。分子量マーカーとして、プレシジョン Plusプロテイン™オールブルースタンダードを5 μL/laneでアプライし、泳動を行った。泳動 後のゲルをiBlot® Dry Blotting System (Invitrogen)を用いて、iBlot® Gel Transfer Stacks, PVDF に転写した。PVDF膜を0.1% Tween-20 in Tris-buffered saline, pH 7.4 (TBST, Nacalai Tesque) に浸し、室温で5 min洗浄した。洗浄は2回行った。PVDF膜、Blocking oneに浸し、室温で 40 min振盪し、ブロッキングを行った。TBSTで室温で5 min洗浄し、1次抗体として抗 FATP1抗体(1.0 μg/mL rabbit anti-FATP1 antibody, ab81875)、抗β-actin抗体(0.5 μg/mL mouse anti-β-actin antibody, AC-74)、抗Na+ K+-ATPase抗体(0.5 μg/mL mouse anti-Na+ K+-ATPase antibody, ab7671 [464,6])をBlocking oneで調製し、4゜C、16 hr振盪した。TBSTで室温で 5 min間4洗浄した後、2次抗体であるHRP標識抗rabbit IgG抗体(ab97051)及びHRP標識抗 mouse IgG抗体(A24524)を20倍希釈Blocking oneでそれぞれ20000倍、5000倍に希釈し、
室温にて1 hr浸漬、振盪した。2次抗体反応後、TBSTで5 min間、4回洗浄した。免疫反応
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はSuperSignal West femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Fisher Scientific)に遮光、室 温で5 min反応させ、ImageQuant LAS 4000mini (GE Healthcare, Milwaukee, WI, USA)で検出 した。Densitometric imagesはImageJによって解析した。
第5節 LC-MS/MSによるタンパク質絶対定量法 定量用ペプチドの設計
定量対象とするタンパク質のアミノ酸配列情報はExPasy Proteomic Server
(http://au.expacy.org/)のSwiss-prot/TrEMBL (UniProt)データベースから入手した。Trypsin消化 して得られると考えられるpeptide配列に対して、当研究室で確立したprobe peptide選択基準 を満たす配列(以下の1~4の条件を必ず満たし、かつ5~12の条件をより多く満たす配列)を定 量probe peptideとして選択した(Kamiie et al. 2008)。
1.対象とするタンパク質に特異的な配列であること 2.メチオニン(M)およびシステイン(C)を含まないこと 3.Trypsin消化部位が連続していないこと
4.トリプシン消化部位の次のアミノ酸がプロリン(P)ではないこと 5.アミノ酸残基数が7~15 merであること
6.膜貫通部位ではないこと
7.N型糖鎖修飾を受ける配列を含まないこと 8.修飾・変異・SNPsが報告されていないこと
9.グルタミン酸(E)およびヒスチジン(H)を含まないこと 10.プロリン(P)を含むこと
- 97 - 11.細胞内領域でセリン(S)が連続しないこと
12.細胞内領域でチロシン(Y)、セリン(S)、スレオニン(T)、システイン(C) を含まないこと
選択した定量ペプチド配列について、非標識ペプチドおよび内標準としての安定同位元素標 識(13C, 15N)ペプチドを合成した。合成したペプチドは約1 mg/mLとなるようにMilliQ水を用い て溶解した後、アミノ酸分析法(日立高速液体クロマトグラフLaChrom Elite:アミノ酸(NIN法) 分析システム, 日立ハイテク, Tokyom Japan)によって濃度決定した。ペプチド溶液はアミノ酸 分析法によって濃度を決定した後、もしくは決定する前の溶液を100-1000倍希釈し、約 0.1 μM (50%acetnitlile, 0.1% formic acid)に調製し、5 μL/minでMS/MSへinfusionして SRM/MRM測定条件の最適化を行った。ESIによるイオン化は全てpositive modeとし、
SRM/MRM transitionはy ion またはb ion系列から強度が強いものから4つずつ選択した。
還元アルキル化及び酵素消化(methanol-chloroform沈殿法)ールクロロホルム沈殿法による前処 理(還元アルキル化、酵素消化)
FATP1安定発現系Plasma membrane画分、crude membrane画分及びwhole cell lysate 及 びhCMEC/D3 whole cell lysateサンプル100 μg proteinを等量以上のalkylation buffer (7 M Guanidine hydrochloride, 0.5 M Tris-HCl (pH 8.5), 10 mM EDTA-Na) 210 μLに添加し全量
220 µLとした。タンパク質重量と等量のDTTを添加し、1分間窒素置換を行った後、室温で1
hr攪拌した。タンパク重量の2.5倍量のiodoacetoamideを添加し、遮光下で1 hr攪拌した。
Cold methanol 600 µL、cold chloroform 150 µL、cold Milli-Q water 450 µLを添加後、遠心操作
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(15,000 rpm, 4oC, 5 min)を行った。上清を除き、cold methanol 450 µLを添加後、遠心操作 (15,000 rpm, 4oC, 5 min)を行った。上清を除きタンパク質試料を回収した。回収したタンパク 質試料を6 M urea in 0.1 M Tris-HCl (pH8.5)溶液に溶解し、最終濃度1.2 M ureaとなるように 0.1 M Tris-HCl (pH 8.5)を添加し超音波洗浄器を用いて分散させた。最終濃度0.05%となるよう に1% Protease MAXを添加し、タンパク質重量の1/100量のLys-Cを添加し、室温で3 hr消 化反応を行った。さらにタンパク質重量の1/100量のtrypsinを添加し、37oCで16 hr消化反 応を行った。
絶対定量解析
Trypsin消化したペプチド試料に一定量の内標準ペプチド混合溶液を添加し、最終濃度0.1%
となるようにformic acidを添加し、遠心(15,000 rpm, 4oC, 5 min)をし、その上清をLC-MS/MS にアプライした。LC-MS/MSの装置条件は次項に示したものを使用し、SRM/MRM条件は
Table 3に示したものを使用した。絶対定量解析においては以下の条件を用いて検量線を作成し
た。いずれも非標識ペプチドと安定同位元素標識ペプチドのpeak area ratioから検量線を作成 した。
MS injectionサンプル
Standard peptide 5, 10, 25, 50, 100, 500, 1000 fmolに対してinternal standard peptide 500 fmol を添加して測定した。