-1-体外診断用医薬品 この添付文書をよく読んでから使用してください。
＊2018年 2 月改訂 (第 2 版) 製造販売承認番号:22900EZX00002000
2017年 3 月作成 (第 1 版)
ROS1融合遺伝子検出キット ８４０９００００
OncoGuide®
AmoyDx® ROS1融合遺伝子検出キット
【全般的な注意】
1．本製品は、体外診断用医薬品であり、それ以外の目的に は使用しないでください。 2．判定結果に基づく、診断、使用目的欄に記載の医薬品の 適用については、本キットの結果、及び他の関連する検 査結果、臨床症状とあわせて、担当医師が総合的に判断 してください。 3．添付文書に記載された使用目的及び用法・用量に従って、 使用してください。記載された使用目的及び用法・用量 以外での使用については、結果の信頼性を保証しかねま す。 4．使用の前に添付文書をよく読み、本製品の各構成試薬及 びその使用方法をよく理解してください。また、使用す る機器の添付文書及び取扱説明書をよく読み、記載に従 って使用してください。 5．本製品は14種類のROS1融合遺伝子から発現されたmRNA を検出するものです。未知のROS1融合遺伝子や低頻度で 存在する14種類以外のROS1融合遺伝子は検出できませ ん。 6．本製品は1反応あたり125コピーのプラスミドDNAがあれ ば融合遺伝子が検出できることを確認していますが、逆 転 写 反 応 の 効 率 な ど も 考 慮 す る と125 コ ピ ー の 融 合 mRNAが検出できないことも考えられます。 7. 検査をする際には、本品の使用目的欄に示される医薬品の 最新の添付文書を参照してください。【形状・構造等（キットの構成）
】
1. ROS1反応Mix① 1,100μL×1本 (1) デオキシヌクレオシド三リン酸(dNTP)混合物1 2'-デオキシアデノシン-5'-三リン酸(dATP) 2'-デオキシシチジン-5'-三リン酸(dCTP) 2'-デオキシグアノシン-5'-三リン酸(dGTP) 2'-デオキシチミジン-5'-三リン酸(dTTP) 2'-デオキシウリジン-5'-三リン酸(dUTP) (2) ROS1-M1-F2-tag-EAフォワードプライマー (3) ROS1-M2-F2-tag-EAフォワードプライマー (4) ROS1-M3-F2-tag-EAフォワードプライマー (5) ROS1-M4-F2-tag-EAフォワードプライマー (6) ROS1-M5-F2-tag-EAフォワードプライマー (7) ROS1-M1-R2-tag-EAリバースプライマー (8) Tag-EAプライマー (9) ROS1-M1-P2プローブ 2. ROS1反応Mix② 1,100μL×1本 (1) デオキシヌクレオシド三リン酸(dNTP)混合物1 2'-デオキシアデノシン-5'-三リン酸(dATP) 2'-デオキシシチジン-5'-三リン酸(dCTP) 2'-デオキシグアノシン-5'-三リン酸(dGTP) 2'-デオキシチミジン-5'-三リン酸(dTTP) 2'-デオキシウリジン-5'-三リン酸(dUTP) (2) ROS1-M6-F2-tag-EAフォワードプライマー (3) ROS1-M7-F2-tag-EAフォワードプライマー (4) ROS1-M8-F2-tag-EAフォワードプライマー (5) ROS1-M9-F2-tag-EAフォワードプライマー (6) ROS1-M10-F2-tag-EAフォワードプライマー (7) ROS1-M6-R2-tag-EAリバースプライマー (8) Tag-EAプライマー (9) ROS1-M6-P1プローブ 3．ROS1反応Mix③ 1,100μL×1本 (1) デオキシヌクレオシド三リン酸(dNTP)混合物1 2'-デオキシアデノシン-5'-三リン酸(dATP) 2'-デオキシシチジン-5'-三リン酸(dCTP) 2'-デオキシグアノシン-5'-三リン酸(dGTP) 2'-デオキシチミジン-5'-三リン酸(dTTP) 2'-デオキシウリジン-5'-三リン酸(dUTP) (2) ROS1-M11-F2-tag-EAフォワードプライマー (3) ROS1-M12-F2-tag-EAフォワードプライマー (4) ROS1-M13-F2-tag-EAフォワードプライマー (5) ROS1-M11-R2-tag-EAリバースプライマー (6) Tag-EAプライマー (7) ROS1-M11-P2プローブ 4．ROS1反応Mix④ 1,100μL×1本 (1) デオキシヌクレオシド三リン酸(dNTP)混合物1 2'-デオキシアデノシン-5'-三リン酸(dATP) 2'-デオキシシチジン-5'-三リン酸(dCTP) 2'-デオキシグアノシン-5'-三リン酸(dGTP) 2'-デオキシチミジン-5'-三リン酸(dTTP) 2'-デオキシウリジン-5'-三リン酸(dUTP) (2) ROS1-M14-F2-tag-EAフォワードプライマー (3) ROS1-M14-R2-tag-EAリバースプライマー (4) Tag-EAプライマー (5) ROS1-M14-P2プローブ (6) HPRT1-F12フォワードプライマー (7) HPRT1-R11リバースプライマー (8) HPRT1-P23プローブ 5．ROS1逆転写酵素 20μL×1本 (1)ROS1逆転写酵素 6．ROS1逆転写反応Mix 550μL×1本 (1) デオキシヌクレオシド三リン酸(dNTP)混合物2 2'-デオキシアデノシン-5'-三リン酸(dATP) 2'-デオキシシチジン-5'-三リン酸(dCTP) 2'-デオキシグアノシン-5'-三リン酸(dGTP) 2'-デオキシチミジン-5'-三リン酸(dTTP) (2) ROS1-M1-R2プライマー (3) ROS1-M6-R2プライマー (4) ROS1-M11-R2プライマー (5) ROS1-M14-R2プライマー (6) HPRT1-R11プライマー 7．ROS1陽性コントロール 250μL×1本 8．ROS1酵素Mix 50μL×1本 (1) HS-Taq DNAポリメラーゼ (2) ウラシル-N-グリコシラーゼ(UNG)-2-【使用目的】
癌組織または細胞診検体から抽出したRNA中のROS1融合 遺伝子mRNAの検出（クリゾチニブの非小細胞肺癌患者へ の適応を判定するための補助に用いる）【測定原理】
本製品は、逆転写反応（RT）及び蛍光標識加水分解プロー ブ法を用いたリアルタイムPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）を 連続して行うツーステップRT-PCRを原理として、ホルマリ ン固定パラフィン包埋（FFPE）組織、新鮮凍結組織、細胞 診検体、または細胞診検体由来FFPEセルブロックなどの各 種ヒト非小細胞肺癌検体から抽出したRNA中の14種類の ROS1融合遺伝子mRNAを検出するキットです。本製品によ るROS1融合遺伝子mRNAの検出は、主に以下のプロセスで 行います。 1. RNAの抽出 検体から任意の方法でRNAを抽出します。 2. 逆転写反応 逆転写酵素及び配列特異的プライマーの働きにより逆転 写反応を行い、cDNA（相補DNA）を合成します。 3. PCR ROS1の遺伝子融合によって形成された各融合部位を標的 領域とした2段階のPCRを行います。2段階の反応は、異な る温度設定により全自動装置内で連続して行われます。原 理図は図1の通りです。 第1段階のPCRは、高い特異性を維持しながら反応液中の 標的配列の濃度を高めることを目的としています。非特異 的な増幅を抑え高い特異性を維持するために、高い温度 （アニーリング温度）帯で反応させるとともに、検出対象 の融合遺伝子から得られたcDNAに対して相補的である、 2種類の配列特異的なプライマー（フォワードプライマー 及びリバースプライマー）を用いています。 第2段階のPCRは、第1段階のPCRで得られた産物を対象と して、第1段階で特異的に増幅したものを、効率よく遺伝 子増幅させ、その増幅の際に得られる蛍光強度を検出し、 蛍光強度が一定量に達した際のサイクル数であるCycle threshold（Ct）値を算出することを目的としています。効 率よく遺伝子増幅させるために、第1段階より低い温度帯 を設定するとともに、それぞれの融合遺伝子を共通に増幅 させる共通プライマーを用いています。この共通プライマ ーの配列は、第1段階で用いたフォワードプライマー及び リバースプライマーに付加した標的配列とは異なる配列 と同じです。従って、この共通プライマーはフォワード及 びリバースプライマーとして機能します。また、配列特異 的プライマーより低い温度帯で働くように設計されてい るため、第2段階のPCRでのみ機能します。 4. 蛍光強度のモニタリングとCtの算出 Ct値の算出には、蛍光標識プローブを用います。この蛍光 標識プローブは、標的配列に対して相補的であり、配列の 両端にそれぞれ、蛍光物質（FAM）と消光物質（BHQ1） が標識されています。この蛍光標識プローブは、反応前は 消光されていますが、融合遺伝子の伸長反応に伴い、蛍光 を発します。従って、この融合遺伝子の増幅に伴い蛍光強 度は増大します。その蛍光強度をPCRのサイクルごとに測 定し、Ct値に応じて結果を判定します。 図1 原理 本製品の検査は各検体につき4本のチューブを用いて行い ます。各チューブでは、使用するROS1反応Mix（①～④） に応じてそれぞれ5種（ROS1エキソン32）、5種（ROS1エキ ソン34）、3種（ROS1エキソン35）、1種（ROS1エキソン36） のROS1融合遺伝子mRNAを対象とし、そのいずれかが検出 された場合に陽性と判定します。本製品で検出可能なROS1 融合遺伝子mRNAは表1の通りです。 表1. 検出対象のROS1融合遺伝子mRNA チューブ No. 融合パートナー及びエキソン エキソン ROS1 ① SLC34A2 エキソン4 SLC34A2 エキソン 13del2046 CD74 エキソン6 32 SDC4 エキソン2 SDC4 エキソン4 - ② SLC34A2 エキソン4 SLC34A2 エキソン 13del2046 CD74 エキソン6 34 SDC4 エキソン4 EZR エキソン10 - ③ TPM3 エキソン8 LRIG3 エキソン16 GOPC エキソン8* 35 ④ GOPC エキソン4* - - 36 *GOPC-ROS1とFIG-ROS1は同じ融合を示します。【操作上の注意】
1. 測定試料の性質、採取方法 ・本製品の検査には、腫瘍細胞の存在が確認されたFFPE組織、 新鮮凍結組織、細胞診検体、または細胞診検体由来FFPEセ ルブロックから抽出したRNAを使用してください。 1-1 FFPE検体（FFPE組織、及び細胞診検体由来FFPEセルブ ロックを含む）、及び新鮮凍結組織 ・ホルマリン固定処理により組織中の核酸（RNA）の断片 化を伴いますので、FFPE検体を用いる際は、医療機関の 定める方法、または、各種のFFPE取扱いガイドライン （例：肺癌患者におけるALK融合遺伝子検査の手引き； 日本肺癌学会バイオマーカー委員会、遺伝子関連検査 検 体品質管理マニュアル；日本臨床検査標準協議会作成、 乳癌診療ガイドライン2 病理組織検体の適切な取扱いに ついて；日本乳癌学会作成、等）に記載の条件に基づい て、適切に取り扱ってください。検体の乾燥、核酸分解 防止のために速やかに十分量の固定液で固定開始し、固 定完了後は、水洗い、脱水、脱アルコール、保存等を行 ってください（例：患者から採取された生検検体や手術 材料を、10％中性緩衝ホルマリン十分量にて速やかに固 定開始し、室温（20℃前後）にて、短時間（48時間以内） の固定完了、作製後2年以内の検体使用）。
-3-・5～10μmの厚さの切片を使用して、適切なスライド枚数
を用いて、RNAを抽出してください。
・FFPEスライドとして保存した検体を用いる場合は、通常
は4～6週間以内に使用してください。やむを得ず長期間
保存した検体を用いる場合でも、最長2年以内のものを使
用することを推奨します。
・RNA抽出の前に、検体中に腫瘍細胞が30%以上あること
の確認を推奨します。
・新鮮凍結組織を用いる際は、医療機関の定める方法、ま
たは、各種規定（例：日本病理学会 ゲノム研究用病理
組織検体取扱い規程）などを参照し、適切に取り扱って
ください。（例：手術検体を用いる際は5ミリ立方以上、
気管支鏡による生検検体を用いる際は遺伝子解析が実施
可能と考えられる充分量（生検検体2～3個以上が望まし
い）の組織を-80℃凍結保存。ただし、組織内の腫瘍細胞
の存在を病理学的に確認する）
1-2 細胞診検体
・細胞診検体（胸水、気管支洗浄液またはこのペレット、
気管支洗浄に用いた器具洗浄液またはこのペレット、な
ど）を用いる際は、FFPE検体及び新鮮凍結組織を用いる
際と同様に、腫瘍細胞が存在するかどうかを確認するこ
とが重要です。医療機関の定める病理学的な方法（例：
セルブロック、塗抹標本、などを用いた細胞診検査）や、
EGFR遺伝子変異検査の手引き 最新版；日本肺癌学会 バ
イオマーカー委員会 などを参照し、腫瘍細胞の存在を
適切に確認してください。
1-3 全検体種（FFPE検体、新鮮凍結組織、細胞診検体）
・検査には、質及び量の良好なRNAを使用することが大切
です。検体からRNAを抽出後、分光光度計により吸光度
（OD）を測定して、RNA濃度を算出してください。
以下の基準を満たすRNA溶液を使用することを推奨し
ます。
総RNA濃度 50～800ng/μL
OD260/OD280値 1.9～2.1
・RNAは分解されやすいため、採取、保管、運搬などにつ
いて、注意してください。
・検体からRNAを抽出後、すぐに検査を行わない場
合は-70℃で保管し、1週間以内に使用してください。
・RNAの逆転写反応の後、すぐにPCRを行わない場
合はcDNA溶液を-20±5℃で保管し、1週間以内に使
用してください。
2. 検体の調製法
2-1 総RNA抽出
・検体の種類に応じた任意のRNA抽出キットを用いて検
体 よ りRNA を 抽 出 し ま す （ 推 奨 RNA 濃 度 は 50 ～
800ng/μL）。操作方法は使用するRNA抽出キットの取扱
説明書に従ってください。
・RNAの抽出操作はPCR増幅物などを取り扱う区域とは
区別された区域で行ってください。
・RNA抽出を行う区域は、DNA抽出のためのRNaseを取
り扱う区域とは厳密に区別し、作業者の移動などにも配
慮してください。
・区別された区域ごとに、区別された専用のピペット及び
フィルター付きピペットチップを用いることを推奨しま
す。
・RNAは、試料や操作者に由来するヒトの皮膚、唾液など
に含まれるRNaseにより容易に分解され、測定結果に誤
りが生じることが考えられます。RNA抽出及び取り扱い
の作業時は必ず手袋、専用の作業着、マスク及び帽子を
着用してください。
・クロスコンタミネーションに十分注意し、エアロゾルの
発生やキャップの開閉時の手袋からの汚染を避けるなど
に注意してください。特に、複数の検体を同時に取り扱
う際は、1検体ごとにキャップの開閉、分注を完了してく
ださい。
2-2吸光度の測定
(4)・吸 光 度 測 定 はNanoDrop UV-Vis Spectrophotometer (ND-2000)を使うと少ない検体量での測定が可能です。 正確な検査のため2重測定を行ってください。 3. 妨害物質・妨害薬剤 ・ROS1野生型、GOPC-ROS1融合型、及びSLC34A2-ROS1融 合型の細胞株を用いて作製したFFPE検体由来のRNA、及 び非小細胞肺癌患者のFFPE検体由来のRNAを用いて検討 を行ったところ、トリグリセライド74mmol/Lまで影響は 認められませんでした。また、オキシヘモグロビン4 g/L まで検討したところ最大1程度のCt値の上昇が観察されま したが、検討した条件下では検査結果への影響はありませ んでした。
【用法・用量（操作方法）
】
1. 試薬の調製方法 ・各試薬は解凍後、十分に混和してから、そのまま使用して ください。 2. 別途必要な器具・器材・試薬等 ・RNA抽出キット [推奨品]AmoyDx FFPE RNA Kit（アモイ ダイアグノスティクス 社、Cat. No. ADx-FF04）、RNeasy FFPE Kit（株式会社キ アゲン、Cat. No. 73504）；ただしFFPEの場合、
AllPrep DNA/RNA Mini Kit（株式会社キアゲン、Cat. No. 80204など）；ただし未固定凍結検体、細胞診検体の場合 ＊・リアルタイムPCR装置 ・マイクロ遠心機 ・ボルテックスミキサー ・プレート遠心機（プレートを使用する場合） ・反応用チューブ（ヌクレアーゼフリー）：逆転写反応、試薬 混合用 ・PCR用のチューブあるいはプレート型チューブ及びキャッ プあるいはシール（各リアルタイムPCR装置に適合するも の） ・試薬の混合及び反応液調製に用いるピペット、ピペットチ ップ（フィルター付きヌクレアーゼフリー） ・ 水 （PCR専用水）：コントロール（NTC :No Template Control）として用います。 3. 操作方法 3-1 RNAの抽出 ・「【操作上の注意】2-1 総RNA抽出」を参考に、生体由来 の検体から総RNAを抽出します。 3-2 逆転写反応 (1) 1検体あたり、ROS1逆転写反応Mix 18.5μL及びROS1逆転 写酵素0.5μLをチューブに取り、試薬をよく混和します。 (2) 試薬が入ったチューブに、RNA溶液を6μL添加し、よく 混和します。 (3) チューブを42℃で1時間反応させます。 (4) チューブを95℃に加熱して5分間静置した後、氷冷します。 ボルテックスミキサーで器壁についた水滴を混ぜ合わせ 遠心してチューブの底に溶液を集めます。この反応によ って得られたcDNA溶液をPCRの検体とします。
-4-3-3 PCR
(1) 下表2の割合で必要量の試薬をチューブに取り、試薬混合
液①～④を調製します。
表2. 試薬混合液①～④の調製 (1検体分)
ROS1 反応 Mix（①～④） 35μL
ROS1 酵素 Mix 0.3μL
(2) ボルテックスミキサーなどで軽く混ぜ合わせ（5秒以内）、
遠心により溶液をチューブの底に集めます。
(3) 各検体とコントロール（陽性コントロール： PC、No
Templateコントロール：NTCの2種）につき、4本のPCR
用チューブを準備し（1検体の場合は合計12本、1検体増
えるごとに4本ずつ増えます）、手順(1)で調製した4種類
の試薬混合液①～④を35μLずつ添加します。（以降、試薬
混合液①～④を入れたチューブを「チューブ①」～「チ
ューブ④」と呼びます。）
(4) チューブ①～チューブ④に検体のcDNA溶液を5μLずつ
添加します。PCには陽性コントロールを5μL添加します。
またNTCにはPCR専用水を5μL添加します。
注：この時、各チューブに添加した溶液の全量が40μL
（ 試 薬 混 合 液 ① ～ ④35μL+検体 またはコントロール
5μL）あることを確認してください。
(5) 各チューブに蓋をしてボルテックスミキサーなどで穏や
かに攪拌し試薬液とcDNA液とをよく混ぜ合わせます。遠
心操作により溶液全体をチューブの底に集めてください。
注：試薬及び検体をここでよく混和することが大切です。
(6) 各チューブを使用するリアルタイムPCR装置内にセット
します。
表3. プレート配置の例（12テストの場合）
チューブ
No. 1 2 3 4 5 6 7
① 検体1 検体3 検体5 検体7 検体9 検体11 NTC
② 検体1 検体3 検体5 検体7 検体9 検体11 NTC
③ 検体1 検体3 検体5 検体7 検体9 検体11 NTC
④ 検体1 検体3 検体5 検体7 検体9 検体11 NTC
① 検体2 検体4 検体6 検体8 検体10 検体12 PC
② 検体2 検体4 検体6 検体8 検体10 検体12 PC
③ 検体2 検体4 検体6 検体8 検体10 検体12 PC
④ 検体2 検体4 検体6 検体8 検体10 検体12 PC
(7) 使用するリアルタイムPCRの取扱説明書に従って、以下
の条件でリアルタイムPCRを行います。
95℃、5 分
95℃、25 秒
64℃、20 秒
72℃、20 秒
93℃、25 秒
60℃、35 秒（※）
72℃、20 秒
※の箇所で、下表4の波長でFAM及びHEX（VIC）の蛍光
強度を測定します。
表4.測定波長
注：サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社のリア
ルタイムPCR装置を使用する場合は、以下のように設定し
てください。
(5)・Reporter Dye: FAM及びVIC ・Quencher Dye: TAMRA ・Passive Reference: NONE
(8) 判定方法に従い、結果を判定します。
【測定結果の判定法】
1. 増幅曲線の作成と判定の準備 第2段階のPCRの各サイクルで測定した蛍光強度に基づき、 リアルタイムPCR装置により増幅曲線が作成されます。チ ューブ①～チューブ④のFAMの蛍光はROS1融合遺伝子 の状態を、チューブ④のHEX（VIC）の蛍光は検体中の参 照遺伝子（HPRT1）の状態を表します。 2. Ct値の算出と結果の判定 チューブ①～チューブ④のFAMチャネル、及びチューブ ④のHEX（VIC）チャネルの増幅曲線において蛍光強度が 一定量以上となるサイクル数であるCycle threshold（Ct） 値を求め、この値に応じて以下のように結果を判定します。 (1) NTC及びPCのCt値が以下の基準を満たすことを確認 します。満たさない場合は、再検査を行ってください。 ・NTCのチューブ④のHEX（VIC）チャネル、及びチ ューブ①～チューブ④のFAMチャネルのCt値は全 て30以上であること。 ・PCのチューブ④のHEX（VIC）チャネル、及びチュ ーブ①～チューブ④のFAMチャネルのCt値は全て 24未満であること。 (2) 検体のチューブ④のHEX（VIC）チャネルのCt値に応 じて参照遺伝子の検査結果を確認します。 ・Ct値が20以下の場合、次の手順に進みます。 ・Ct値が20超の場合は再検査を推奨します。ただし、 次の手順でFAMチャネルのCt値が30未満であった 場合は陽性と判定します。 (3) 検体のチューブ①～チューブ④のFAMチャネルのCt 値に応じて検査結果を判定します。 ・Ct値が30未満の場合、陽性と判定します。 ・Ct値が30以上の場合、陰性と判定します。 ［判定上の注意］ ・NTCにおいてCt値が30未満であった場合はコンタミネー ションの可能性がありますので、データは全て破棄して再 検査を行ってください。 ・PCのCt値が24以上の場合、ROS1陽性コントロールや他の 試薬の入れ忘れの可能性、及びキットの品質劣化の恐れが ありますので、データは全て破棄し、再検査を行ってくだ さい。キットの品質劣化が疑われる場合は、キットを取り 換えて再検査を行ってください。 ・参照遺伝子のCt値が20超であった場合、RNA量が不十分で あったり断片化などにより増幅が十分に行われていない 可能性があります。この場合、検体から再度RNAを抽出し て再検査を行うことを推奨しますが、いずれかのチューブ のFAMチャネルのCt値が30未満であれば反応は正常に進 行したとみなし、陽性と判定します。【臨床的意義】
本品はRT-PCR法を原理として、検体から抽出したRNA中 のROS1融合遺伝子mRNAを検出するキットです。本品は、 クリゾチニブの非小細胞肺癌患者への適応を判定するため の補助を目的として用います。 ROS1融合遺伝子陽性非小細胞肺癌に関するクリゾチニブ の治験成績概略： ・国際共同第Ⅱ相試験（OO12-01試験） 本品を用いてROS1融合遺伝子陽性と判定された非小細 胞肺癌患者127例（うち日本人患者26例）にクリゾチニブ を投与した結果、主要評価項目である奏効率（RECIST） は69%（95%信頼区間：61%、77%）であり、臨床的に意 義のある抗腫瘍効果を示した（独立判定委員会による評 価）。 FAM 494nm の励起光から得られた 518nm における蛍光強度 HEX 535nm の励起光から得られた 556nm における蛍光強度 VIC 538nm の励起光から得られた 554nm における蛍光強度 15サイクル 31サイクル-5-【性能】
1. 性能 【用法・用量（使用方法）】欄記載の方法に従って感度、正 確性、同時再現性試験を行った時、以下の結果となります。 1-1 感度試験 ・14種の陽性DNA管理検体を用いて検査を行うとき、HEX （VIC）チャネルのCt値は30以上である。また各ROS1融 合型塩基配列を検出するROS1反応Mix（①～④）のFAM チャネルのCt値は30未満である。 1-2 正確性試験 ・14種の陽性RNA管理検体を用いて検査を行うとき、HEX （VIC）チャネルのCt値は30以上である。また各ROS1融 合型塩基配列を検出するROS1反応Mix（①～④）のFAM チャネルのCt値は30未満である。 ・陰性DNA管理検体を用いて検査を行うとき、HEX（VIC） 及びFAMチャネルのCt値は30以上である。 ・陰性RNA管理検体を用いて検査を行うとき、HEX（VIC） チャネルのCt値は20以下である。またFAMチャネルのCt 値は30以上である。 1-3 同時再現性試験 ・弱陽性コントロール及び強陽性コントロールを用いて、 それぞれ10回同時に検査を行うとき、弱陽性コントロー ルのHEX（VIC）及びFAMチャネルのCt値は全て27未満 であり、強陽性コントロールのHEX（VIC）及びFAMチ ャネルのCt値は全て24未満である。またCt値の変動係数 （CV%）は10%以下である。 管理検体 ・陽性DNA管理検体：検出対象のROS1融合型塩基配列を 含有する14種の精製プラスミドDNA（濃度：1検査反応 あたり125コピー） ・陽性RNA管理検体：検出対象のROS1融合型塩基配列を 含有する14種のタンパク被覆一本鎖RNA ・陰性DNA管理検体：本品陰性のヒト由来DNA ・陰性RNA管理検体：本品陰性のヒト由来RNA ・弱陽性コントロール：検出対象のROS1融合型塩基配列を 含有する14種の精製プラスミドDNAと、HPRT1遺伝子 由来の標的配列を含有する精製プラスミドDNAの混合 液（各成分の濃度：1検査反応あたり500コピー） ・強陽性コントロール：検出対象のROS1融合型塩基配列を 含有する14種の精製プラスミドDNAと、HPRT1遺伝子 由来の標的配列を含有する精製プラスミドDNAの混合 液（各成分の濃度：1検査反応あたり5000コピー） 2. 最小検出感度 2-1 ROS1融合型塩基配列を含有する精製プラスミドDNA ・検出対象のROS1融合型塩基配列を含有する14種の精製 プラスミドDNAを用いて検討を行ったところ、1検査反 応あたり125コピーで安定的に検出されました。 2-2 ROS1融合RNA含有率 ・ROS1野生型、及びGOPC-ROS1融合型の細胞株からRNA を抽出して一定濃度に調製し、様々な比率でROS1融合型 細胞由来のRNAを含有するように混合したものを検体 として用いて検討を行ったところ、本品により95%の確 率 で 陽 性 判 定 が 可 能 な 検 体 のROS1 融 合 RNA 含 有 率 （LoD C95）は下表5の通りでした。 表5. 各RNA濃度におけるGOPC-ROS1検出のLoD C95 RNA 濃度 [ng/μL] LoD C95（融合RNA 含有率）0.1 8.084% 1 1.184% 10 0.146% 20 0.154% 200 0.007% 400 0.003% 注：本試験は、本品の検出対象の ROS1融合のうちGOPC-ROS1融合を有する新鮮な細胞株を用いて行ったもので す。臨床検体を用いた実使用時には、検体中の細胞の融 合RNAの発現量や総RNAの発現量は本試験で用いた培 養細胞のものとは異なることが予想されます。また、 RNAの品質等の条件によっては本試験の結果よりも実際 の感度が低くなる場合があります。 3. 臨床性能試験結果 3-1 クリゾチニブの国際共同第Ⅱ相試験（OO12-01試験） 【臨床的意義】欄を参照。 3-2 FISH法との一致率 クリゾチニブの国際共同第Ⅱ相試験（OO12-01試験）の スクリーニングを目的として採取された非小細胞肺癌患 者53例のFFPE検体を用いて、本品と事前に性能確認され たROS1 FISH法による検査を行った結果、ROS1融合遺伝 子または転座の有無に関する結果判定は全て一致しまし た。 表6. 本品とFISH法の一致率 FISH 法 陽性 陰性 判定不可 合計 本品 陽性 10 0 9 19 陰性 0 32 2 34 合計 10 32 11 53 両法の結果が得られた42例における一致率： ・陽性一致率：100%（10/10） ・陰性一致率：100%（32/32） ・全体一致率：100%（42/42） 3-3 海外臨床性能試験 中国において肺癌患者1007例のFFPE検体を用いて本品 とSanger DNAシーケンス法による検査を行った結果、 ROS1融合遺伝子の有無に関する結果判定は全て一致し ました。 表7. 本品とSanger DNAシーケンス法の一致率 Sanger DNA シーケンス法 陽性 陰性 合計 本品 陽性 40 0 40 陰性 0 967 967 合計 40 967 1007 検査結果の一致率： ・陽性一致率：100%（40/40） ・陰性一致率：100%（967/967） ・全体一致率：100%（1007/1007） 陽性40例において本品で陽性判定されたチューブ（①～④） は、Sanger DNAシーケンス法により判定された融合型と 全て一致しました（下表8）。
-6-表8. 陽性40例の判定結果
本品 （括弧内の数字はエキソンを示す） Sanger DNA シーケンス法 症例数
① SLC34A2(13del2046)- ROS1(32) 2
① CD74(6)- ROS1(32) 1
① SDC4(2)- ROS1(32) 3
② SLC34A2(13del2046)- ROS1(34) 1
② CD74(6)- ROS1(34) 20
② EZR(10)- ROS1(34) 6
③ TPM3(8)- ROS1(35) 1
③ LRIG3(16)- ROS1(35) 4
③ GOPC(8)- ROS1(35) 1
④ GOPC(4)- ROS1(36) 2
合計 40※
※40 例 中 1 例 に お い て 、 CD74(6)- ROS1(32) と CD74(6)-
ROS1(34)の双方が陽性判定されました。
3-4 新鮮凍結組織または細胞診検体での試験成績
日本において、新鮮凍結組織または細胞診検体を用いて
本品陽性と判定された非小細胞肺癌患者50例に対し、医
療機関にて構築されたROS1 FISH法による検査を行った
結果、ROS1融合遺伝子または転座の有無に関する結果判
定は良好な一致率を示しました。
表9. 新鮮凍結組織または細胞診検体での試験成績
医療機関のFISH 法
陽性 陰性 判定不可 合計
本品陽性 42 3※ 5 50
両法の結果が得られた45例における一致率：
・陽性一致率：93.3%（42/45）
※FISH法陰性の3例中2例は、設定された判定カットオフ
値(15%以上の陽性細胞)付近でした。残り1例ではごく
一部の細胞でのみ分離シグナルが観察されました。いず
れもカットオフ値未満で陰性と判定されました。両法で
の結果判定の相違は、感度の違いによるものと考えられ
ます。
