ヒト乳ガン・胃ガン細胞特異的ヒトモノクローナル 抗体の作製

九州大学学術情報リポジトリ

Kyushu University Institutional Repository

ヒト乳ガン・胃ガン細胞特異的ヒトモノクローナル 抗体の作製

秋山, 浩一

https://doi.org/10.11501/3098986

出版情報：Kyushu University, 1994, 博士（農学）, 論文博士 バージョン：

権利関係：

--

第 5 章 ヒ ト モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 H 1

っ て 認 識 さ れ る 乳 ガ ン 関 連 抗 原 の 分

離 精 製

第 1 節 緒 己

第

ニ耳己 正L

で ヒ ト

b H 1

M C F ^- 7 と

特 異 的 反 応 す る

た M ^a

b H 1

の 認 識 す る

め M C F ^{- 7}

細 日包 ^の 細 胞 破 砕 液

ツ

ト

る

て 分 析

特 異 的

^ン

_{が 多 く 検 出} ^さ

と lま

で き な か

た

そ ^{し、 τー，}

で

第

_{Zコ士t で 行 な}

抽出 方 法 _{で 得 た}

細 胞

ル j慮 過

_{分 画 し た}

し、竺，ー

反応 す る 画 分 を 得 る

を さ

ら 種

の

ク ロ

よ つ

て 分 画 し

b H 1

分離 精 製 す る

を 試 み た

56

は

乳 ガ ン 細 胞 株

しー ?_ー と

を 明 ら か し

抗 原 を 検 出 す る た を

ン

ロ し た

し か し

非

れ 抗 原 を 特 定 す

た 方 法

_{は 異 な} ^る の 細 胞 抽 出

を

ろ ^、 M ^a

b H 1

で き た

の 画 分

マ ト グ ^{フ フ イ 一} に

の き口J刃し、 三 口割 昭 � _す る 抗 原 を

。

...-

第 2 節 実 験 材 料 お よ び 方 法

第 1 項 試 薬 の 調 製

抗 原 抽 出 用 緩 衝 液 : ¹

M M

¹

M

C a C 1 2 m

M

^{e n}

^{e t}

^{n e}

^u 1

^{0 n}

1

flu o ride (PMSF)

^/

r 0 t i n i n

む 1 5

M

^{r i}

-

(

.

)緩 ^{律? f佼}

P

F 、

0 r 0

n は

ず れ も ^S

入 し た

M _a b H 1

5 F

^{は 、}

ド

キ

ー7 ノて タ

て 精 製 し た も の

早

xr.

参

ゲ ル 鴻 過 用 担 体

陰 イ オ ン 交 換 体 ヒドロキシアパタイト

鑑

イ を

血 清 培 養 後 の

ト お よ び ^{ゲ jレ}

用

た 第 1 1

S ^e

^r

S -

養

i慮、

ニ耳c.:._主

( フ ァ ル マ シ ア 社

D E A E

- ⁵ P

(東 ソ ー )

H A

- 1

(東 ソ 一 )

57

社 よ

f佼

を

過

、

第

を

り 購

、 ヒ

よ

1 ²

...

SDS-PAGE用 x 2 サ ン プ ル バ ッ フ ァ ー

o .

5

(

8 )

1

0覧 S

S ( S

⁾

2ーメルカブトエタノール

和 光 純 薬 、 生 化 学 用) グリセロ ール

1 %

l'ロモ7ェ} -ルl'ルー/メタノール

以 上 を よ く 混 合 し 使 用 し た

第 2 項 抗 原 の 抽 出

ヒ

ト 手し ^{tJ ン} 細 胞 株

を 添 加 ^{し た E}

:t音 I也 を 用 て

の 大 量 培 養 は

ボ ト

o .

25 m

o . 4

o . 1

o . 3

式z; ^_E三主

刃型 亘呈

lま 、 養 ^し

m

m

m

1

0

た

(Belc o

c m X

2 8

5 c m )を 用

で 培 養 ^{し た}

フ ^一

ボ ト

内 壁 に t普 殖 ^{し た} 系回 胞 ^を か き と

完F C

S

細 胞

1 1

ロ ^一

り

P B

S

濁 し 遠 心 チ

と り 100 0

m

5分 間 遠

す る

と ^よ り 細 日包 ^を 集 め ^た

の 細 胞 ^{を P B} S で 回 洗 j争 後 ^{使 用} 日寺 ま で

2

C

l乙 {呆 存 ^{し た}

58

...-

抗 原

f由 出 は

a r

ら

方 法 準 じ

て?丁 な

た

109 (固

細 胞 を 抗 原 f由 出 用 緩 衝 液2 0 m 1 懸 濁 し

型

フ ロ

ホ モ

ナ イ ザ

で ホ モ

ナ イ ズ し 800

で 1 0 分

聞 の 遠 心 分 離 よ り f号 ら れ た 上 清 画 分 を さ ら に 100 ， 000

で

0 分 間 遠 心 し

f専 ら れ た 上

清 函 分 を カ

ム ク ロ マ ト グ

フ

よ り 分 画 し た

第 3 項 カ ラ ム ク ロ マ ト グ ラ フ ィ

M C F - 7

細 胞 f由 出

しま

で 平 衡 化 さ れ た

Sepha c r yl

0 0 c m

0 c m )に よ る ゲ

j慮 過 で 分 画 さ れ た

出

は

m 1ず

分 取 し

た

a b H 1

反 応、 す る 抗 原 を

むる 画 分 を

1 0 m

酸 緩 衝

( p H

0 )で 透 析 し た f麦

同 じ 緩 律1

で 平 衡 イヒ し た

1

m m

c m ) 吸 着 さ せ

の N

a

1直 線 濃 度 勾 自己 で

出 し た

出

は

m

1ず

分 取 し た

a b H 1

反 応 す る 抗

--

原 を

^む 画 分 を

0

M

酸 緩 衝

( p

7 .

0 ) で 平 {奥1 イヒ し た T S

1 H A

000

× 7 . 5 c m

)に 日及 着 さ せ

0

400

Mの

酸

( p

0 )直 線 濃 度 勾 自己 で

出 し た

出

は

m

1ず

分 取 し た

T S

1 D E A E

P Wお よ び

HA-1000 カ

ム ク

ト グ

フ

は フ

ル マ シ ^ーノァ F

P L

ム を 用 ^い て 行 な

た

第 4 項 抗 原 の 検 出

カ

ム ク

グ

フ

よ

て f辱 ら れ

た 画 分 中 の 抗 原 の 検 出 l乙 lま

以 下 の E L

S A を

用 た

各 画 分 を P B S 対 し て 透 析 後

0

μ l

を

6穴 イ ム ノ フ レ

ト の _各

_分

_し

3 7 oc で 時 問 保 温 し て 吸 着 さ せ た

次 に

o _. 0 5完

T

0を

む P B S (TPBS) で フ レ

ト

を 回 洗 浄 し た 後

非 特 異 的 吸 着 を _防 ぐ た め

2 0

0

の フ

ク

の 4 倍 希 釈 液 を _添

カ日 し 3 7 oc で 日寺 間 イ呆

し た

の ブ

キ

グ を 行 な

た フ レ

ト の _各

/

1の

60

�

精製 M ^a

5 F 2 あ る

しま 、 同 濃 度 の ヒ ト 血 清

1 g M ^{、、、、、.}

ド 十 字 社 を 5

l 添 加 ^し 3 7

℃ で 時 間 反 応 ^{さ せ T P B Sで} 3 _回 洗 浄 後 、 ペ ル

オ キ

ダ

ゼ 標 識 抗 ヒ ト 1

M ( T A G 0社 を

μ

添 加 し て 3 7

で 時 間 反 応 ^{さ せ} た

酵 素

標 識 抗 体 を 1小k士口

さ せ た フ

ト は T P B Sで 3

回 洗 浄 ^{し た} f麦 ^、 基 質 溶 液 を

力日

、 3 7

℃ で

5 分 間 反 応 ^{さ せ 、} 反 応 停 止 液 を

添加 し て 反 応 を 停 止 ^{さ せ た}

各 穴 中 存 在 す

る 酵 素 標 識 抗 抗 体 量 は

S A

ダ

で

5

n mの

吸 光 度 を 測 定 し 、 M a

1 5 F 2 の イ直 か ^{ら ヒ}

血 清

M の イ直 を ヲ|

た 値 を 抗 原 と の 反 応 性

の 値 と し 、 ク ロ

ト グ

ム

し た

第 5 項 ^S

^S - P A G E 、 プ ロ ッ テ イ ン グ お よ び イ ム ノ ス テ イ ニ ン グ

S D

S - P A G

は 、 抗 原 画 分 を x 2 サ ン フ ル バ ッ

フ ァ ー と 等 量 混 合 し 沸 騰 水 浴 中 に 3 分 間 煮 沸 し た も の を サ ン プ ル と し て La e mli (5 5 ) の 方

61

...-

法 に 準

^{て fÿ な}

^た

E後: の

ル の 染 色 は 銀 染 色

^{ト 和 光 純 薬 を 用}

^{て 行 な}

つ た ^。

フ ロ ツ ア イ ン グ お

よ

lま 第

第

節

第

準

て 行 な

抗 原 の 過

^ウ 素 酸 処 理

第

第

百行

第

準

^{て 行 な}

^た

第 6 項 電 気 溶 出 に よ る 抗 原 の 精 製

抗 原 の

溶 出

ら の 方 法

に 従

て

E後

抗 原 を 切 り 耳文

ぞ屯P

主ヌ<\ 的 f由 出 し た

f専 ら れ た

を

1 _- X 2ゲ jレ B i ^{0 R a d}

社

処 理 f麦

ン

酸 ナ ト ウ

緩 律i

対 し て 透 析 す る

lこ

よ り

を 除 去 し た

62

...--

第 3 節 結 果

第 l 項 _{カ ラ ム ク ロ マ ト グ ラ フ ィ}

S ^e p h ^{a c r} y 1 S - 300

よ る 分 画 の 結 果 を F

g .

5 - 1 刀ミ

し た

5 F 2 と 反 応 す _{る 物 質} lま

フ

ク

ン 2 4

2 7に か け て

い _{反 応 性} で 得

ら れ た

れ ら _フ

_ク

ン lご お しす る ヒ ト 血

清1

M と の 反 応 性 は

2

. 3 _と

い _{イ直 を}

し た 図 は

し て い な

次

れ ら _{の 画 分 を}

5 P W に よ

て

分 画 ^し た (Fig . 5-2)

の 結 果

タ ン ノヌ ク 質

の ピ

ク は 大 き く

分 か れ

5 F 2

と 反 応 す _{る 物 質} ^Lま _{初 め の タ} ^{ン ノて} _{ク 質 の ピ}

_ク

の 前 半 部 分 検 出 さ れ た

仁、τ，ー.

れ ら _{の 画 分 を}

よ

て _{分 画} し た

結果 (Fig . 5-3) _タ ^{ン ノて} _{ク 質 の ピ}

_{ク は 大 き}

つ

分 か れ

1 5 F 2 と 反 応、 す _{る 物 質}

lま

の ピ

ク 分 か れ た

ク

ン 1 4

lま タ ン ノ可 ク 量 あ た り _{の 反 応 性 が 細 胞 抽 出}

63

�←

比 べ て 約 2 600倍 に 上 昇 し た (

a

5 - 1 )

第 2 項 ^{プ ロ ッ テ ィ ン グ お よ び イ ム ノ}

ス テ イ ン グ

H A -

1 000 に よ る 分 画 で 得 ら れ た フ ラ ク シ ョ

ン 1 0と フ ラ ク シ ョ ン 1 4を ウ エ ス タ ン プ ロ ッ ト

分析 し た 結 果 フ ラ ク シ ョ ン 1 0に は 分 子 量 約

4

2 k D aと 4 0 k D aが フ ラ ク シ ョ ン 1 4に は 分 子

量 約 4 ^{0 k D aの 抗 原 が 検 出 さ れ た (Fig . 5- 4)}

第 3 項 電 気 溶 出

H A -

1 000 よ る 分 画 で f専 ^{ら れ た フ}

^ク

ン

1 0と

4を S D S

に か け る と フ

ク

1

0に l土 4 0 k D aお よ び 4 2 k D a以 タト も

}'\ ン

ド カま 確

さ れ た 均三 フ

ク

ン 1 4に は

k D

a の

ン ド の み で あ

た

タ Lま

て な

フ フ

ク

ン 1 4の 4 0 k

aの 抗 原 を

ぇ�

64

。

ヨ

ン

の

4 0

し

出

に よ っ て さ ら に 純 化 し た (Fig . 5-5)

こ れ に よ っ て 、 タ ン パ ク 質 の 回 収 率 は 約 60完 で 、 取

終的 に 、 3 6μ g /

1の 抗 原 溶 液 が o

1得 ら れ

第 4 項 抗 原 の 過 ヨ ウ 素 酸 処 理

H A - 1

000 よ る 分 画 で f専 ら れ た

ク

ン 1

4中 _の

0

の 抗 原 を 過

_ウ 素 酸 処 理 し

た 結 果 、

5

の 反 応 性 lま 治' 失 し な か

た

タ は

し て

な

の

と か ら

エ

ピ ト

フ Lま J文、 フ チ _ド 鎖 で は な い か _と 考

ら

れ た

65

S�!l!ArJ.:re�湿

�ço�v) ( T

�

zczdN」一エロ

- ωA MW h

Zω∞一-zd

Z03d」d(一ω∞mw一同 eI) 己

的コ

hh，

'山

υ甲ι』。

同，m c Z

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o 寸

cm…

o か辺

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o

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同.0 N.0 でT

o

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o

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)[.0

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'08ZV) (・

N.0

(一ーなぺ)・:)UOJ lJBN

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-.0 N.0

内.0

o

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同一.0 ドιυ2

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z 。

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67

.JUO:J (一一‘08ZV)

H.0

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o

-.0 N.0

内.0寸.0

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同一，m

\

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o

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68

(一一‘08ZV)

...-

MW (K Da)

94 ^{-一一・...}

67-ーー事』

43一一一事ー

30一一ー争 20.1一一一帯ー 14.4 ..

Lane

H uman Serum H15F2 19M

2 3 ⁴

La ne 1 3 Lane 2. 4

F ^{r .} 1 0 F ^{r .} 1 4

Fig.5-4 Western blotting of九fCF圃7 antigens recognized by Mab H15F2.

...-

MW KDa

94_一一' 67 •

43ー+

30ー+

20_ 1ー+

14.4ー+

ー-40K

Fig.5-5 SDS圃PAGEof MCF・7 antigen recognized by Mab H15F2 after electroelution.

... 斗

Table 5・1 Purification of MCF回7 antigen recognized by Mab H15F2

Step

Cell extract

Sephacryl S・300

DEAE-5PW

HAI000

Protein (mg)

23.5

0.9

0.32

0.02

Reactivity Specific Reactivity (A40S) - (A4os/mg of protein)

0.065 0.028

0.21 1.167

0.12 1.875

0.73 73.0

Purification (fold)

41.7

67.0

2607

...-

第 4 節 考 察

M

a

1 5 F 2 の 認 識 す る 分 子 量 約 40

aの 抗

原 を 、 乳 ガ ン 細 胞 株 M C F - 7 109 個 か ら 約 25. 2

μ g

1辱 る ご と が で き た 。 H A - 1 000 に よ る ク ロ

マ ト グ ラ フ ィ の フ ラ ク シ ョ ン 1 0と フ ラ ク

シ ョ ン 14中 に 検 出 さ れ た 42

aと 40

aの 物

質 が 同 じ も の か ど う か は さ ら に 詳 し く 検 討 し

な け れ ば な ら な い

E d w

a

ら は

マ ウ ス に 乳 ガ ン 細 胞 株

M C F -

7 を 免 疫 す る ご と に よ り 乳 ガ ン 組 織 と 特

異的 に 反 応 す る M a

3 2 3 / A 4を 作 製 し て い る

Mab

323/A4は 、 分 子 量 約 43

aの 糖 タ ン パ ク

質 を 認 識 し 、 こ の 43

a抗 原 は コ ン カ ナ パ

リ ン A

(Co n A) と 結 合 す る と 報 告 し て い る

Mab

H15F2 の 認 識 す る 抗 原 と C

n A が 結 合 す

る か ど う か ペ ル オ キ シ ダ ゼ 標 識 し た C

n A を 用 い て 試 験 し た が 、 反 応 性 は 認 め ら れ な か

っ た

デ ー タ は 示 し て い な い 。 ご の ご と カ〉

ら 、 乙 れ ら の 抗 原 は 異 な る も の で あ る と 考 え

72

�

ら れ る

K j _e 1 d _{s e}

nら は

) -Ea・

-(

ン パ 節 乳 ガ ン 患 者 の リ

リ ン パ 球 を 用 い て 、 乳 ガ ン 細 胞 と 特 異 的 に 反

応 す る ヒ ト M a

M

4 0/4 3 を 作 製 し 、 ご の M a

は 、 乳 ガ ン 細 胞 株 M

- 7 中 の 分 子 量 約 4 7

a

の 糖 タ ン パ ク 質 の 糖 鎖 部 分 を 認 識 す る と 報 告 し て い る

a m a

iら

乳 ガ ン 患 者 も ま た

の リ ン パ 節 リ ン パ 球 を 用 い て 乳 ガ ン 細 胞 と 反 応す る ヒ ト M a

4

3 3 を 作 製 し 、 M a

4 - 3 3

と M

- 7 細 胞 と の 反 応 性 が 細 胞 を 過 ヨ ウ 素 酸

処 理 す る 乙 と に よ り 低 下 す る ご と を 報 告 し て い る

ご れ ら の 他 、 多 く の 乳 ガ ン 関 連 抗 原 が 報 告

さ れ て い る (

a

4 - 2 )。 そ の ほ と ん ど は 糖 タ

ン パ ク 質 で あ り 、 分 子 量 200

a 以 上 の ム チ

ン 様 糖 タ ン パ ク 質 と 、 150

a 以 下 の 物 質 と に 大 別 で き る 。 ま た 抗 原 の エ ピ ト ー プ は 糖 鎖 お よ び ペ プ チ ド 鎖 の 両 者 が エ ピ ト ー フ と な り

う る 。 M a

5

2 の 認 識 す る 抗 原 は 、 分 子

的 に 見 て 後 者 の 範 鳴 に あ り エ ピ ト ー プ は べ

73

�

プチ ド 鎖 ^{で あ る と} 推 定 さ

認識 す ^{る 4}

aの 抗 原 が

抗原 ^{と 同 じ も} の か ど

討す る 必 要 が あ る

抗 原 の 性 質 ^を 5問

る 離 す る 必 要 が あ る

ヒ る 抗 原 の 精 製 法 が 確 立 抗原 の 研 究 上 有 益 で あ

第 5 節 小 活

乳 ガ

細 胞 株 M

ト M

の 認 識 す

か

た ト し る

と る

れ た

M a

の そ の 他 の ガ

関 連 は

さ ら に 詳 し く 検

め は そ の 抗 原 を 単

M

a

の 認 識 す

た

と は

今 後

の

，回

わ れ る

特 異 的 反 応 す ^{る ヒ}

抗 原 ^を

M

細 胞

の 細 胞 質 画 分 ^よ り 分 離 精 製 ^{し た}

抗 原 は 分 子

量4

aお よ び 4

aの

種 類 存 在 し

ピ

一 フ

は ペ プ チ ド 鎖 ^{で あ ろ}

^と 推 定 さ れ た

抗 原 の 精 製 法 が 確 立 ^{さ れ た}

^{と よ り} 更 な

る 研 究 の 発 展 が 期 待 ^{さ れ た}

�

第 6 章 胃 ガ ン 細 胞 特 異 的 ヒ ト モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 生 産 性 ヒ ト

ー マ の 作 製

第 l 節 緒 日

ヒ ト ハ イ ブ リ ド

X 線 検 査 内 視 鏡 検 査 の 進 歩 と 普 及 に よ り 胃 ガ ン の 早 期 診 断 や 治 療 成 績 は 向 上 し つ つ あ る が 、 胃 ガ ン は ガ ン に よ る 死 亡 数 に お い て 我

が 国 の 首 座 を 占 め て い る

。 胃 ガ ン に

対 す る 腫 場 マ ー カ と し て C E A ( _C a r c i n

embryo nic a ntige n)， AFP (α -

e t

r

t e i n )

CA 1

9 - 9な ど が あ げ ら れ る 。 し か し 陽 性 率 は 低

く 、 ご れ ら に よ っ て 胃 ガ ン の 診 断 を く だ す ご

と は 不 可 能 と 考 え ら れ て る

こ れ ら の ご

。

と か ら 胃 ガ ン に 対 す る M a _{b を 作 製 す る ご と} は 、 診 断 に 用 い る ご と の で き る 腫 場 マ ー カ ー を 見 つ け る と い う 意 味 に お い て 意 義 深 い と 考 え ら れ 、 実 際 に い く つ か の 研 究 室 で は 胃 ガ ン に 対 す る M a _{b を 作 製 し て い る}

_。

75

そ こ で ご の 章 で は ヒ ト ー ヒ ト ハ イ ブ リ ド ー マ を 作 製 す る ご と に よ り 胃 ガ ン 細 胞 株 に 反 応 す る ヒ ト M a b の 作 製 を 目 的 と し た

第 2 節 ^{実 験 材 料 お よ び 方 法}

第 ^{1 項 試 薬 の 調 製}

リ ン パ 球 分 離 培 地 ( L

M ) オ ル ガ ノ ン テ ク ー

カ 社

ヘ パ リ ン 入 り 真 空 採 血 管 積 水 化 学 工 業 そ の 他 の 試 薬 は 第 2

準 じ た

第 2 頂 ^{細 胞 の 調 製}

ニó:.

耳主

第

節 ^{第 1 項 に}

リ ン パ 球 の 胃 ガ ン 細 胞 株 で の ア ロ 免 疫 は Koya m a (6 2) に よ っ て 行 な わ れ た

血 液 か ら の リ ン パ 球 の 調 製 は 次 の よ う に し て 行 な っ た 。 15 m 1 容 の 遠 心 管 に L

M を

76

�

m

1入 れ 、 そ の 上 に

入 り ^{真 空 採 血 管}

で 採 取 ^{し た 血 液 を 重 層 し た}

400

0分

間遠 心 ^{し た} 後 境 界 層 あ る 細 胞 ^を 分 取 ^{し た}

ご れ を E R D F 培. ^{i也 で 2} 倍 以 上 ^{希 釈 し 、} 400

g

で

0分 間 遠 心 ^し 細 日包 ^を 集 め ^た

細 胞 ^を E R D F

培 地 懸、 濁 し 、 400

0分 間 遠 心 ^{し た}

」

、デ

の 操 作 を

回 繰 り 返 す

と よ り 細 胞 ^を 洗

つ

た

0

^{1 の 血 液 か} ら 約 107 {回 ^の

パ 球

を 分 離 ^{し た}

²

106 個 /

と な る ^よ

^に

E R

D F ^{培 I也 に} 懸 濁 し 細 胞 融 合 ^{に 用 い た}

^{そ の 他}

の 細 胞 ^{の 調 製} lま 第 2

、 第 2 節

第 2 頂 に 準

じ て 行 な

^た

第 3 項 ハ イ ブ リ ド ー マ の 作 製

親 細 胞 株 A 4

^{2 は 、 無 血 清 培 地 で 増 殖 で き}

る よ う に 改 良 さ れ た も の を 用 い た ( 7 )

^{そ の}

他 の 方 法 は 、 第 2 章 、 第 2 節 、 第 4 項 に 準 じ

た

77

JIII""""""

第 4 項 ス ク ン グ お よ び ク ロ ー ン グ

ス ク ン グ に は 4 種 の 胃 ガ ン 細 胞 株

M K N - 2

8 、 M K

4 5 、 K

T

III 、 T M K - 1 を 用 い た

方法 は 第 2 章 、 第 2 節 、 第 5 項、 に 準 じ た

ク ロ ン グ は 第 2 章 第 2 節 第 6 項 に

準 じ た

第 3 �.行 ^{結 果 お よ び 考 察}

E問自

ガ ン 細 胞 株 M K

5

M K

8 お よ び K

T

III

で

ロ 免 疫 さ れ た ン

球 lま 親 細 胞 株

と 細 日包 融

さ れ た

回 の 融 合 操 作 よ り 約

1 5

0 0個 の

イ

ド

ク ロ

ン が f専 ら れ た

( T

e

の 時 ^の 融 合 効 率 lま 平 均

clo n e/105

e n

e

sと 手し ガ ン の 時 と ほ ぼ

同 じ で あ

た 第 2 一音ートー

ー

れ ら

イ

マ

の

ち ス ク

ン グ よ り

ガ ン 細 _{胞 株 M K}

_{- 4 5 細 日包 ま た は} M K

8細 胞 対 し

て 反 応 陽 '性 _の M

を 生 産 し て い る

イ

ド

78

�

ー マ が 5 つ 得 ら れ た 。 1

M 型 の 抗 体 み を 分 泌

し て い る ハ イ フ リ ド ー マ を F M K -

3 、 K M K -

1 、

GMK-A3 、 G M K -

3と し た 。 残 り を E M K - F 7と し

乙 れ は 1

G と 1

M 型 の 抗 体 を 分 泌 し 細 胞

と の 反 応 性 は 1

G 型 の み に あ り 、 1

M 型 に 反

応性 は な か っ た 。 ハ イ ブ リ ド ー マ K M K

1の 抗

体 は K A T

III 細 胞 と も 反 応 し た

胃 ガ ン 細 胞 株 T M K - 1 で ア ロ 免 疫 さ れ た リ ン

パ 球 は A

2 を 親 細 胞 株 と し て 細 胞 融 合 さ れ

た 。 リ ン パ 球 が 活 性 化 さ れ て い た た め か 、 芽

球 化 し た 細 胞 が 多 く 観 察 さ れ 、 融 合 後 2 週 間

経 っ て も ほ と ん ど の 穴 で 生 き た 細 胞 が 観 察 さ

れ た 。 ご れ ら は ハ イ ブ リ ド ー マ か 活 性 化 さ れ

た リ ン パ 球 か 区 別 が 付 か な か っ た の で 融 合 効

率 は 分 か ら な か っ た

次 に 、 細 胞 を ま き ご ん だ す べ て の 穴 の 上 清

を T M K -

細 胞 と の 反 応 性 で ス ク リ ン グ し

た 結 果 、 5 回 の 融 合 に よ り 反 応 陽 性 の も の は

平均 7 . 1完あ っ た (Table6-2)。 ご れ ら の 穴 に あ

る 細 胞 を ス ケ ー ル ア ッ プ し 、 引 き つ づ き 反 応

r-

陽性

a b を 分 迎、 し て い

を 選 択 し

し- ョー^， の

よ

し て

安 定 し て 反 応、 陽 '性

M _{a b}

を 生 産 す

f専 ら れ た

」-7 の )\ イ フ ド ^一 マ

を

と し た

イ フ ド ^一 マ 6 - 3 C 8 Lま 1 g M 型 の M

a b _{を 分 泌}

し て い た

以 上 5十

(Table

は 限 界 希 釈 法 よ り ク

グ さ れ 第

7 ^早コ当ι で さ

ら 1手 し く 反 応 性 が i周

ら れ た

80

Table 6・1 Fusion efficiencies of HO・323 with lymphocytes derived from peripheral blood immunized with stomach cancer cell lines

a Efficiencies No. N o. of seeded well No. of hybridomas

(Clone/105parent cells)

1 480 388 3.9

2 480 229 2.3

3 480 202 2.0

4 480 280 2.8

5 480 172 1.7

6 288 104 2.1

7 288 103 2.1

8 192 54 1.8

9 288 40 0.8

Total 3456 1572 2.2 b

a No. of hybridomas showed the number of wells in which hybridomas emerged after fusion of I-IO・323as a parent cell with lynlphocytes derived from

peripheral blood immunized with stomach cancer cell lines.

b Average

81

r-

Table 6・2 Result of the first screening to establish monoclonal antibodies reactive to stomach cancer cell line，TMK-l

N o. N o. of seeded wells No. of hybridomas a

reacted toT恥'1K-l cells Percentage

1 480 18 3.8

2 480 50 10.4

3 480 33 6.9

4 480 48 10.0

戸。 480 22 4.6

Total

2400 171 7.1

a The reactivity was estimated by ELISA. Positive clones had an absorbance at 405 nm over 0.1.

b Average

82

."...

Table 6-3 Human圃human hybridomas producing mono­

clonal antibody reactive to stomach cancer cell lines.

a

Hybridoma

EMK-F7 F九1K圃H3 KMK圃41 GMK-A1 GMK-C3

6-3C8

Parent cell

HO圃323 HO-323

HO-323 HO-323 HO-323 A4H12

Ig type IgG(IgM) a

IgM

IgM IgM IgM IgM

This hybridoma produced both IgG and IgM. Reactive Ig was IgG type.

83

�

第 7 章

第 1 節

胃 ガ ン 細 胞 特 異 的 ヒ ト モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 の 細 胞 株 に 対 す る 反 応 性 の 検 討

緒 日

と の 章 で は 第 6 章 で 作 製 さ れ た ヒ ト M

b と 各種 細 胞 株 と の 反 応 性 を E

S A に よ っ て 検 討

し た

第 2 節

第 1 項

抗 体

し た 後

免 疫

5 0 m M

o

実 験 材 料 お よ び 方 法

試 薬 の 調 製

lま す

て 1 0

F C S 添 力日 E R D F 培 地 で 1音 養

の 上 清 を 用

た

Uオミu

色 用 基 質

( D A B溶

T

r i

H C 1 (

H

)中 lご o

0 1

H

と

3 ， 3 ^-

D i

i

b e

i d

e

e

r

d

chlo ride、( D A

同 人 イヒ

を 使 用 直

解

84

さ せ 使 用 し た

そ の 他 の 試 薬 は 第 3

第 2 節 第 1 項 に 準 じ た

第 2 項 実 験 方 法

第

で 作 製

た 各 M

の 各 種 ガ

細 胞 株 お よ び 正 常 繊 維 芽 細 胞 株 と の 反 応 性 の 検 討 は

第

第

賀行

第

準

^て 行

つ

た

E同_日

ガ

細 胞 株 の 免 疫 染 色

第 3

第 ²

節 第 2

の 方 法 従

て 細 胞 の 抗 原 を 調 製

し た

の 抗 原 M

を 反 応

i小k士口

^{し た}

M a b

を

ゼ 標 識 抗

IgG (IgM)

( T A

G

社 と 反 応

た

基 質 と し て

液を 用

と よ り 志小士口

^{し た 抗 抗 体 を 発 色}

た

抗 体 の 反 応 終 了 後 と 抗 抗 体 の 反 応 終 了後

添 加 P

1で

回 洗浄

た

抗 体 が 反 応 し た 部 位 は 赤 茶 色 に 染 色 さ

85

�

第 3 節 _{結 果}

T a

b 1

7 - 1

よ り 作 製 さ れ

、

た 3

親 細 胞 株 H

3 2 3と の 融 合

種 類 _の M

b と

各 種 ガ ^ン 細

胞株 お _よ び 正 常 繊 維 芽 細 胞 株 _{と の} 反 応 性 _を

E L 1 S A

よ

て 調

_{た 結 果 を}

_{し た}

M

b E M K

F 7は 種 類 _の

^{ガ、 ン} 細 胞 株 M K N

2 8

お よ び M K N

5と 5怠 く 反 応 _{し た}

_{そ の 他 の} 試 験

し た ガ、

細 胞 株 お _よ び 正 常 繊 維 芽 細 胞 株 _と は

反応 し な か

た

と か ら

ガ ン 特 異 的 _と 考

ら れ た

M

b F M K

H _3は

E同_日

ガ ン 細 胞 株 M K N

2 8お _よ び

M K

N

5と 5怠 く 反 応 _し

M K

細 胞 _と �� く 反 応

し た

そ の 他 の

ガ ン 細 胞 株 お _よ び 正 常 線 維

芽細 胞 株 _と lま 反 応 ^し な か

た

し か し

手し ガ

ン

肺 ガ、 ^ン

類 表 皮 ガ ン お _よ び 勝 脱 ガ ン と 反

応 し た

M

b K M K

1は 試 験 _{し た す}

_{て の} 細 胞 株 _と 反

応し た

の よ

ほ と ん ど す

て の 細 胞 _と

反応 す る よ

な M

b しま

の イ也 l乙 2 つ 得 ら れ た

M

b

M K - A 1お よ び M

b

M K - C 3、 デ ー タ に は

ポ し て い な い 。

T a

b

7 - 2 に 親 細 胞 株 A 4

1 2 と の 融 合 に よ

り 作 製 さ れ た M

b 6 - 3 C 8 と 各 種 ガ ン 細 胞 株 お

よ び 正 常 繊 維 芽 細 胞 株 と の 反 応 性 を 示 し た

Mab

6 - 3C8 は 胃 ガ ン 細 胞 株 TM K - 1 お よ び M K

-

7

4と 強 く 反 応 し た 。 胃 ガ ン 細 胞 株 M K

- 7 お よ

び肺 ガ ン 細 胞 株 A 5 4 9と は 弱 い 反 応 性 し か 見 ら

れ ず 、 そ の 他 の 試 験 し た ガ ン 細 胞 お よ び 正 常

繊維 芽 細 胞 株 と は 反 応 し な か っ た と と か ら 胃

ガ ン 特 異 的 と 考 え ら れ た

F i g .

7 - 1 に M

b

M K - F 7と 胃 ガ ン 細 胞 株 M K

2

8、 M K

4 5お よ び 正 常 線 維 芽 細 胞 株 F

2

と の 反 応 曲 線 を 示 し た 。 M

b

M K

F 7は ど ち ら

の 胃 ガ ン 細 胞 株 と も 濃 度 依 存 的 に 反 応 し た

F i g .

7 - 3 4 お よ び 5 に M

b

M K - F 7と FM K -

H

3お よ び KM K - 4 1そ れ ぞ れ の M

b の 胃 ガ ン 細 胞

株M K

2 8に 対 す る 反 応 性 を 免 疫 染 色 に よ っ て

検討 し た 写 真 を 示 し た 。 M

b が 結 合 し た 部 分

が 赤 茶 色 に 染 色 さ れ て い る の が わ か る

...

Table 7-1 Reactivities of human monoclonal antibodies to various human cell lines

時lonoclonal antibodies

EMK-F7 FMK-H3 KMK・41

Cell lines Ig type IgG IgM IgM

Stomach cancer

MKN-l →←

MKN・7 →←

九1KN-28 →仲 →仲 _NTb

MKN-45 →+← →仲 →←

MKN-74 →←

TNK・1 + +

N

U

2 十ト

NUGC-3 →十

NUGC-4 →←

KATO-ID →仲

Breast cancer

MCF圃7 + →←

Lung cancer

PC-8 →← →←

QG・56 →← →←

Epidermoid cancer

A圃431 →+ト →←

Bladder cancer

KU-l →+ト →←

Normal fibroblast

Flow2000 斗仲

a

Strength of reactivities of human monoclonal antibodies was expressed as follows the absorbance at 405 nm was below 0.1(ー)，

0.1圃0.2(+)，0.2・0.3(++)， and over 0.3(+++). Each of human momoclonal antibodies was prepared at 1μg/ml.

b NT: Not tested.

88

�

Table 7・2 Reactivities of monoclonal antibody 6・3C8 against various human cell lines

Cell lines Reactivities

Stomach cancer

T時lK-l

引十

MKN回74

引ト

MKN-45 ^{-・・圃・・}

MKN-28 ^圃園田園

時lKN-7

+

NUGC-3 Breast cancer

MCF-7 HBC-5 Lung cancer

PC圃9 ^-

A549

+

Nomal fibroblast

Flow2000 ^{-・・・・圃}

a Strength of reactivities was expressed as follows， the absorbance at 405 nm was below 0.5(ー)，0.5-0.7(+)，0.7・0.9(++) and over 0.9(+++).

可...-

-∞N，Zリv間宮 c -

(トFげ回目以豆凶)

.m {一ωυ

〔古川甲ι cccNhp c E勺 zd m 寸，ZV山宮 』cmω 吉 之ぢgN同で hh . S '山

F勺 o

'圃・4

(一戸四回\∞Z) -u zcυ。 MJ

そq o

-

。【

COON 診 。一 同

21zvロ\J~

∞N，ZリV同室

-・4

o

}一.0 N.0

sa!l!A !lJ�a証

同一.0

o

(ÇOÞV)

m .0

。.0 hh.0

Fig.7・2 Reactivity of human serum Ig against stomach cancer cell line， MKN-28， using

immunostaining methods.

91

v

Fig.7・3 Reactivity of Mab EMK圃F7 against stomach cancer cell line， MKN・28， using immunostaining methods.

92

�

Fig. 7-4 Reactivity of Mab FMK・H3 against stomach cancer cell line， MKN・.28， using immunostaining methods.

93

Fig.7・5 Reactivity of Mab KMK-41 against stomach cancer cell line， MKN-28， using immunostaining methods.

94

第 4 節 考 察

親 細 胞 株 H

- 323ま た は A

H

2 と 胃 ガ ン 細 胞 株 で ア ロ 免 疫 さ れ た 末 梢 血 リ ン パ 球 と を 細 胞 融合 す る こ と に よ り ヒ ト ー ヒ ト ハ イ ブ リ ド ー マ を 作 製 し 、 胃 ガ ン 細 胞 株 と 特 異 的 に 反 応 す る 2 つ の ヒ ト M

M

- F 7 (

g

) お よ び 、 6 - 3C8 (IgM)を f辱 る こ と が で き た 。 ま た 第 3 章 で 、 ほ と ん ど す べ て の 細 胞 株 と 反 応 す る よ う

な M

H

2 7

3 が 作 製 さ れ た ご と を 述

べ た が ご と で も 同 様 に 試 験 し た ほ と ん ど す べ て の 細 胞 株 と 反 応 す る 抗 体 が 得 ら れ た と れ は 、 細 胞 に 共 通 に 存 在 す る 抗 原 を 認 識 し て い る か 、 あ る い は 、 抗 原 抗 体 反 応 に よ ら な

い 非 特 異 的 吸 着 に よ る も の で あ る と 考 え ら れ る 。

M

M

- F 7 、 F M

- H 3お よ び 6 - 3

8 は そ れ ぞ れ 、 各 細 胞 に 対 す る 反 応 性 が 違 う こ と か ら そ れ ぞ れ 別 の 抗 原 を 認 識 し て い る ご と が 示 唆 さ れ た

95