本論文では以下の略語を使用した。 Ac acetyl Bn benzyl Boc tert-butoxycarbonyl

全文

(1)

(2) 本論文では以下の略語を使用した。 Ac Bn. acetyl benzyl. Boc t Bu. tert-butoxycarbonyl tert-butyl. DIPEA DMF. N,N-diisopropylethylamine N,N-dimethylformamide. EDT ESI. 1,2-ethanedithiol electrospray ionization. Et Fm. ethyl 9-fluorenylmethyl. Fmoc Gn·HCl HATU. 9-fluorenylmethoxycarbonyl guanidine hydrochloride O-(7-aza-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N’,N’-tetramethyluronium hexafluorophosphate O-(1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N’,N’-tetramethyluronium hexafluorophosphate 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid high-performance liquid chromatography high resolution mass spectrometry human RFamide-related peptide-1 isopropyl low resolution mass spectrometry acetonitrile 4-methylbenzhydrylamine 4-mercaptophenylacetic acid mass spectrometry native chemical ligation N-methylpyrrolidone nuclear magnetic resonance Na phosphate buffer phenyl bis(sulfanylethyl)amide N-sulfanylethylanilide solid-phase peptide synthesis. HBTU HEPES HPLC HRMS hRFRP-1 i Pr LRMS MeCN MBHA MPAA MS NCL NMP NMR NPB Ph SEA SEAlide SPPS.

(3) TCEP·HCl TFA. tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride trifluoroacetic acid. THF TMSOTf. tetrahydrofuran trimethylsilyl triflate. TOF Trt. time-of-flight triphenylmethyl. VA-044. 2,2’-azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane]dihydrochloride. アミノ酸の一文字および三文字表記 A Ala alanine C D. Cys Asp. cysteine aspartic acid. E F G H I K L M N P Q R S T V W Y. Glu Phe Gly His Ile Lys Leu Met Asn Pro Gln Arg Ser Thr Val Trp Tyr. glutamic acid phenylalanine glycine histidine isoleucine lysine leucine methionine asparagine proline glutamine arginine serine threonine valine tryptophan tyrosine.

(4) 目次理論の部緒言 ................................................................................................................................. 1 第一章 N–Sulfanylethylanilide ペプチドを利用したペプチドチオカルボン酸合成法の開発第一節研究背景 ...................................................................................... 3 第二節第三節. ヒドロチオリシス反応の条件検討 ............................................... 8 エピメリ化の評価 ...................................................................... 13. 第四節第五節. C 末端アミノ酸の影響評価 ............................................................... 14 結論 ............................................................................................ 16. 第二章. ラジカル的脱チオ炭酸反応を介した C 末端ペプチド N–アルキルアミド合成法の開発第一節研究背景 .................................................................................... 17 第二節ラジカル的脱チオ炭酸反応の条件検討 ...................................... 20 第三節ラジカル的脱チオ炭酸反応を用いた ABT–510 の合成 ............... 23 第四節結論 ............................................................................................ 24 結語 ............................................................................................................................... 25 謝辞 ............................................................................................................................... 26. Experimental Section General Methods ........................................................................................................... 28 Chapter 1 ....................................................................................................................... 29 Chapter 2 ....................................................................................................................... 35 引用文献 ....................................................................................................................... 37 論文目録 ....................................................................................................................... 40.

(5) 緒言チオカルボン酸は、カルボン酸の一つの酸素原子が硫黄原子に置換された化合物で、thiol 型と thiooxo 型の間で互変異性を示し 1、thiol 型がより安定な互変異性体である。. チオカルボン酸. この thiol 型のチオカルボン酸は種々の化学選択的な反応に関与するため低分子はもとよりペプチド・タンパク質化学における有用な合成素子となっている。チオカルボン酸を利用したアミド結合形成反応としては、ホスファゼン 2 あるいは電子求引性アジド 3 との選択的反応がある。また、チオカルボン酸（pKa ~3）とペプチド中の各種官能基（アミノ基 pKa ~11; グアニジノ基 pKa ~13; イミダゾイル基 pKa ~6; カルボキシル基 pKa ~4; チオール基 pKa ~8; ヒドロキシ基 pKa ~14）間の酸性度および求核性の差を利用した酸性条件下でのチオカルボン酸選択的 S–アルキル化を経由したチオエステルへの変換反応もアミド結合形成反応に利用されている 4。すなわち、ペプチドチオエステルと N 末端システインとの化学選択的アミド結合形成反応である Native Chemical Ligation（NCL）法へ展開されており、ペプチド・タンパク質合成化学におけるその有用性が認められている 5。しかし、ペプチドチオカルボン酸の実用的合成法は少数であり、その大半が tert-butoxycarbonyl （Boc）型固相合成法を利用している 6。現在ペプチド固相合成法の主流は 9-fluorenylmethoxycarbonyl （Fmoc）型固相合成法に移っている。これは Fmoc 法の実験操作が簡便であり、かつ利用する種々反応条件も温和であることに起因する。このため Fmoc 法を利用したペプチドチオカルボン酸合成法の確立が求められてきた 7。著者の所属する研究室では、N–sulfanylethylanilide（SEAlide）8,9 を利用した手法を開発してきた 10。本手法ではペプチドチオエステル前駆体である SEAlide ペプチドを酸性条件下で N–S アシル基転移反応と続くヒドロチオリシス反応を用いペプチドチオカルボン酸を調整している。しかし、この合成法では酸性条件下での N–S アシル基転移反応時に C 末端アミノ酸のエピメリ化の併発が問題とな 1.

(6) っており、より実用的方法論とするためにはエピメリ化の抑制が課題となっていた。. 以前に報告された SEAlide ペプチドを用いたペプチドカルボン酸合成法 7. 第一章では、前述したペプチドチオカルボン酸合成法において課題となったエピメリ化を抑制できる新たなペプチドチオカルボン酸合成法を著者は開発した。具体的には、リン酸ナトリウム緩衝液を利用した中性条件下 N–S アシル基転移反応とそれに続くヒドロチオリシス反応を行うことで、酸性条件下 N–S アシル基転移反応を行った系に比べエピメリ化が抑制された。第二章では、第一章で得られたペプチドチオカルボン酸をラジカル的脱硫反応条件 11 に付すことで C 末端ペプチド N–アルキルアミドが生成する副反応を、著者は偶然にも発見した。このラジカル的脱チオ炭酸反応を用いた C 末端ペプチド N–アルキルアミドの新規合成法について記す。. 2.

(7) 第一章. N–Sulfanylethylanilide ペプチドを利用したペプチドチオカルボン酸合成法の開発. 第一節. 研究背景. チオカルボン酸は、1854 年に Kekulé によって初めて報告されたカルボン酸の一つの酸素原子を硫黄原子に置換した化合物であり、thiol 型と thiooxo 型の間で互変異性を示し、thiol 型がより安定な互変異性体である（Scheme 1-1）1。. Scheme 1-1 チオカルボン酸. この thiol 型のチオカルボン酸はさまざまな化学選択的な反応に関与するため、低分子のみならずペプチド・タンパク質化学における有用な合成素子となっている。チオカルボン酸を利用したアミド結合形成反応としては、ホスファゼン 2 あるいは電子求引性アジド 3 との選択的反応がある（Scheme 1-2）。. Scheme 1-2 チオカルボン酸を利用したアミド結合形成反応。（A）チオ酢酸とホスファゼンとの反応 2 （B）チオ酢酸と電子求引性アジドとの反応 3. また C 末端ペプチドチオカルボン酸（pKa ~3）とペプチド中の種々側鎖官能基（アミノ基 pKa ~11; グアニジノ基 pKa ~13; イミダゾイル基 pKa ~6; カルボキシル基 pKa ~4; チオール基 pKa ~8; ヒドロキシ基 pKa ~14）間の酸性度および求核性の差を利用した酸性条件下でのチオカルボン酸選択的 S–アルキル化を経由したペプチドチオエステルへの変換反応もアミド結合形成反応に適用されている（Scheme 1-3）4。 3.

(8) Scheme 1-3 C 末端ペプチドチオカルボン酸の酸性条件下でのチオカルボン酸選択的 S–アルキル化. すなわち、中性水系溶媒中にて進行する S–S アシル基転移反応とそれに続く S– N アシル基転移反応を介した、ペプチドチオエステルと N 末端システインとの化学選択的アミド結合形成反応である NCL 法へ展開されており、ペプチド・タンパク質合成化学においてその有用性が示されている（Scheme 1-4）5。. Scheme 1-4 NCL 法. しかし、C 末端ペプチドチオカルボン酸の実用的合成法は少数であり、その大半は Boc 固相合成法を利用している。Boc 固相合成法では固相担体からの切り出しおよび側鎖保護基の除去に毒性の高いフッ化水素あるいは強酸の使用が必要である 6。近年、Crich らにより、Boc 固相合成法に適応可能な 9-fluorenylmethyl （Fm）チオエステルリンカーを用いたペプチドチオカルボン酸合成法が報告された 12。この手法では、固相担体からの切り出しおよび保護基の除去にフッ化水素や強酸を使用する必要がなく、ピぺリジン処理により目的とするペプチドチオカルボン酸を得ることが可能である（Scheme 1-5）。本手法では脱保護工程が改良されているものの、Fm 型側鎖保護基を有するアミノ酸ビルディングブロックを別途合成する必要があることから、汎用性が高いとは言えない。 4.

(9) Scheme 1-5 Fm チオエステルリンカーを用いたペプチドチオカルボン酸合成法 12. 現在ペプチド固相合成法の主流は Fmoc 固相合成法に移っている。これは、 Fmoc 法の実験操作が簡便であり、かつ利用する種々反応条件も温和であることに起因する。このため Fmoc 法を利用したペプチドチオカルボン酸合成法の確立が求められてきた 7。著者の所属する研究室では、SEAlide8,9 を利用した手法を開発した 10。本手法では、まず Fmoc 固相合成法により SEAlide ペプチド担持樹脂 1 を合成する（Scheme 1-6）。続いて得られた樹脂 1 を 1%（w/v）の TCEP·HCl 存在下 4 M HCl/DMF で処理し、N–S アシル基転移反応を経てペプチドチオエステル担持樹脂 2 とする。最後に NaSH によるヒドロチオリシス反応により、目的のチオカルボン酸 3 を得る手法である。この合成法では酸性条件下での N– S アシル基転移反応時に C 末端アミノ酸のエピメリ化の併発が問題となっており、より実用的方法論とするためにはエピメリ化の抑制が課題となっていた。. Scheme 1-6 SEAlide を用いたペプチドチオカルボン酸合成法 10. 5.

(10) 近年著者の所属する研究室では、リン酸ナトリウム緩衝液を含む中性水系溶媒中において、SEAlide ペプチド 4 が相当するチオエステル 5 と平衡関係にあることを見出した（Scheme 1-7）9b。本平衡関係において、リン酸はアシル基転移反応の促進に寄与しているものと推測されている。. Scheme 1-7 リン酸による N–S アシル基転移反応の促進 9b. さらに SEAlide ペプチド 6 を直接 NCL に利用した場合、生成したペプチド 7 の縮合部位でのエピメリ化がほとんど進行しないことを確認した（Scheme 1-8） 9c 。. 6.

(11) Scheme 1-8 SEAlide ペプチドを用いた NCL9c. 著者は、上述の中性リン酸ナトリウム緩衝液中での平衡反応を利用することで、エピメリ化を伴うことなくペプチドチオカルボン酸を得ることができるのではないかと考えた（Scheme 1-9）。そこで本仮説を実証するために、著者は研究に着手した。. Scheme 1-9 中性条件下でのペプチドチオカルボン酸の合成戦略. 7.

(12) 第二節. ヒドロチオリシス反応の条件検討. まずリン酸塩存在下、SEAlide ペプチドをヒドロチオリシス反応に付すことで、目的とするペプチドチオカルボン酸が得られるか検証することとした。SEAlide ペプチド 10 は文献既知法に従い、Fmoc 固相合成法を用いて調製した（Scheme 1-10）13。なお本研究では、ヒト RFamide 関連ペプチド-1 （hRFRP-1）のＮ末端フラグメント（1-11）をモデル配列として選択した 14。. Scheme 1-10. Fmoc 固相合成法を用いた SEAlide ペプチド 10 の合成. 得られた SEAlide ペプチド 10a のペプチドチオカルボン酸 11a への変換について検討した（Table 1）。反応は、120 mM NaSH–100 mM TCEP·HCl –250 mM アスコルビン酸ナトリウム–0.0-1.0 M リン酸ナトリウム緩衝液（pH 約 7）/ NMP = 90:10（v/v）中で実施した。なお TCEP·HCl はジスルフィド形成阻害のため、アスコルビン酸ナトリウムは NCL の際に通常加えるチオール添加物の代替として使用した 15。まず初めに、リン酸塩の濃度の影響について検証した（entries 18.

(13) 4）。この結果、予測通りリン酸濃度の上昇に伴いペプチドチオカルボン酸 11a の収率が向上した。すなわち、SEAlide のヒドロチオリシス反応においても、リン酸の存在が重要であることが明らかとなった。続いて有機溶媒である NMP の影響について検証した（entries 4 and 5）。この結果、NMP 非存在下において、わずかではあるものの収率が低下した。この理由は、有機溶媒非存在下では中間体のチオエステルが不安定なため加水分解を受けやすくなり、その結果、収率が低下したものと推測される 16 。次にペプチドの濃度の影響を検証したところ、 SEAlide ペプチド 10a が高濃度になるにつれ収率が低下した（entries 4, 6, and 7）。このことは、ペプチド濃度増加に伴い硫化水素アニオン源の当量が減少するために生成物の収率が低下したものと推測される。pH の影響についても検討したところ、特に酸性条件下で目的物の収率の低下が観測された（entries 4, 8, and 9）。最後に、硫化水素アニオン源の検証を行った（entries 4 and 10）。この結果、アミノリシスによる副生成物 13a が観測されたものの、SEAlide ペプチド 10a のヒドロチオリシス反応において硫化アンモニウム (NH4)2S17 を使用した方が生成物の収率が高く原料の回収率も低いため、本反応に適していることが明らかとなった（Figure 1-1）。最後に、(NH4)2S を使用した場合についても、リン酸ナトリウム緩衝液の有無による影響を検証した（entries 10 and 11）。この結果、本系においてもリン酸ナトリウム緩衝液を用いない場合には原料の回収率が高く生成物の収率が低くなったことから、(NH4)2S を使用した系においてもリン酸が反応を促進していることが確認された。. 9.

(14) Table 1. SEAlide ペプチド 10 のヒドロチオリシス条件検討. SEAlide Entry. Peptide [mM]. NPB [M]. Sulfide. (salt). reagent. pH. Yield of 11aa [%]. Yield of the. Recovery. byproductb. of 10ac. [%]. [%]. 1. 1.0. 0.0d. NaSH. 6.9. 12. 9. 79. 2. 1.0. 0.2. NaSH. 6.9. 35. 18. 48. 3. 1.0. 0.5. NaSH. 6.9. 39. 23. 38. 4. 1.0. 1.0. NaSH. 6.9. 49. 20. 31. e. 1.0. 1.0. NaSH. 6.9. 43. 24. 33. 6. 2.0. 1.0. NaSH. 6.9. 28. 27. 45. 7. 5.0. 1.0. NaSH. 6.9. 8. 27. 65. 8. 1.0. 1.0. NaSH. 5.9. 6. 16. 78. 9. 1.0. 1.0. NaSH. 8.3. 31. 49. 21. 10. 1.0. 1.0. (NH4)2S. 7.1. 74. 12. 14. 1.0. d. (NH4)2S. 7.0. 18. 10. 72. 5. 11. 0.0. Yield of 11a, yields of the byproducts and recovery of 10a were determined by HPLC analysis (detection at 220 nm) using the following equations (integ. = peak area). a Yield of 11a = integ. 11a/(integ. 10a + integ. 11a + integ. 12a + integ. 13a)×100 b Yields of the byproducts = (integ. 12a + integ. 13a) /(integ. 10a + integ. 11a + integ. 12a + integ. 13a)× 100 c Recovery of 10a = integ. 10a/(integ. 10a + integ. 11a + integ. 12a + integ. 13a)×100 d HEPES buffer (0.2 M) was used instead of sodium phosphate buffer. e This reaction was implemented without the addition of NMP.. 10.

(15) Figure 1-1 SEAlide ペプチド 10a の(NH4)2S を用いたヒドロチオリシス反応の HPLC 追跡（Table 1, entry 10）。（A）反応時間 = 0 h。（B）反応時間 = 24 h。 HPLC 条件は実験の部に記載している。*は反応溶液由来の非ペプチド化合物ピークを示す。. 近年、Melnyk らにより bis(sulfanylethyl)amide （SEA）ペプチドを用いた中性条件下でのペプチドチオカルボン酸合成法が報告された（Scheme 1-11）7b。彼らの報告では、中性水系溶媒中、TCEP および MPAA 存在下において SEA ペプチドを NaSH で処理したものの、目的とするチオカルボン酸が得られなかった。このため、トリイソプロピルシリルチオールを共存させることでシリルチオエステルを経由してペプチドチオカルボン酸を得る方法を開発した。しかしながら、本反応で使用しているトリイソプロピルシリルチオールは高価な試薬である 7c。これに対し、今回著者が開発した方法では、SEAlide ペプチドと安価な (NH4)2S の中性条件下での反応により、直接的に目的のペプチドチオカルボン酸 11.

(16) を得ることが可能である点は大きな特長と言える。. Scheme 1-11. SEA ペプチドを用いたペプチドチオカルボン酸合成 7b. 12.

(17) 第三節. エピメリ化評価. 続いて著者は、C 末端アミノ酸のエピメリ化の評価を行った。第一節で述べた通り、塩化水素により誘起される N–S アシル基転移反応では、C 末端アミノ酸残基の 20%がエピメリ化した 9a。これに対し、著者が新たに開発した方法は温和な条件下で反応が進行することから、C 末端アミノ酸のエピメリ化が抑制できると期待した。本実験では C 末端に Ala を有する SEAlide ペプチド 10b を用い、 Table 1 の entry 10 と同条件にてヒドロチオリシス反応を行った。得られた生成物の HPLC チャートを、別途調製した C 末端 L-Ala 体 11b および D-Ala 体 11b’ のそれと比較したところ、エピメリ化は 2%しか進行していないことが明らかとなった（Figure 1-2）。すなわち当初の計画通り、中性リン酸ナトリウム緩衝液中でのヒドロチオリシス反応を用いることにより、従来法の問題であった C 末端アミノチオカルボン酸のエピメリ化を大幅に抑制することに成功した。. Figure 1-2 SEAlide ペプチド 10b のヒドロチオリシス反応中における HPLC を用いたエピメリ化評価（A）チオカルボン酸 11b と C 末端 Ala 残基のエピマー（11b’）の混合物。（B）SEAlide ペプチド 10b のヒドロチオリシス反応後の粗反応混合物。反応条件は Table 2 の entry 2 に記載している。 13.

(18) 第四節. C 末端アミノ酸の影響評価. 本手法の適用範囲を明らかとするため、C 末端アミノ酸残基の影響を評価した（Table 2）。C 末端アミノ酸残基として、典型的なアミノ酸である Ala、 Ser、 Lys、Arg、Leu もしくは Tyr を導入したペプチドを基質として用いた。 Table 2 SEAlide ペプチド 10b-h のヒドロチオリシス反応における C 末端アミノ酸残基の影響. SEAlide Entry. peptide. X. [mM]. Sulfide reagent. pH. Reaction. Yield of. Yield of the. Recovery. 11a. byproductsb. of 10c. [%]. [%]. [%]. time [h]. 1. 1.0. Ala. NaSH. 6.9. 24. 12. 39. 50. 2. 1.0. Ala. (NH4)2S. 7.0. 24. 79. 3. 19. 3. 1.0. Ser. NaSH. 6.9. 24. 23. 20. 57. 4. 1.0. Ser. (NH4)2S. 7.2. 24. 44. 8. 48. 5. 1.0. Lys. NaSH. 6.9. 24. 18. 5. 77. 6. 1.0. Lys. (NH4)2S. 7.1. 24. 60. <1. 40. 7. 1.0. Arg. NaSH. 6.9. 24. 5. 34. 62. 8. 1.0. Arg. (NH4)2S. 7.1. 24. 58. 6. 34. d. 9. 1.0. Asn. NaSH. 6.9. 24. -. 10. 1.0. Asn. (NH4)2S. 7.1. 24. -d. 11. 1.0. Leu. (NH4)2S. 7.0. 76. 12. 1.0. Tyr. (NH4)2S. 6.9. 24. Complex mixture 33. 2. 65. Yield of 11, yields of the byproducts and recovery of 10 were determined by HPLC analysis (detection at 220 nm) using the following equations (integ. = peak area). a Yield of 11 = integ. 11/(integ. 10 + integ. 11 + integ. 12 + integ. 13)×100 b Yields of the byproducts = (integ. 12 + integ. 13) /(integ. 10 + integ. 11 + integ. 12 + integ. 13)×100 c Recovery of 10 = integ. 10/(integ. 10 + integ. 11 + integ. 12 + integ. 13)×100 d Not detected.. 14.

(19) C 末端アミノ酸残基が Ala、Ser、Lys、Arg もしくは Tyr の場合（10b-e および 10h）、目的とするペプチドチオカルボン酸 11b-e および 11h を得ることに成功した。また(NH4)2S を使用した場合、先述の C 末端 Gly 体 10a の場合と同様、NaSH を用いた場合よりも収率が向上した（entries 1-8）。Ser 体 10c の場合、ペプチドチオカルボン酸 11c と同じ質量を有する化合物のピークが HPLC において 2 つ観測された（主ピーク/副ピーク=95:5）（entry 4）。Ser チオエステルは他のアミノ酸チオエステルに比べ、エピメリ化しやすいことが知られている 18。このことから、副ピークはペプチドチオカルボン酸 11c の C 末端残基部分のエピマーであると考察した。他方、C 末端アミノ酸が Ala、Lys、Arg もしくは Tyr（10b、 10d、10e もしくは 10h）の反応では、同様のピークは観測されなかった（entries 2, 6, 8, and 12）。C 末端アミノ酸残基が Asn の場合（10f）、目的とするペプチドチオカルボン酸 11f は得られず、アスパルチミド副生成物 14 の生成が観測された（Figure 1-3）19。また C 末端アミノ酸残基が Leu の場合、反応は非常に遅く、複雑な混合物が得られた。本混合物を HPLC および MS にて分析したところ、加水分解体およびアミノリシス体以外にも様々な副生成物が観測された。同様の現象は、C 末端アミノ酸残基が Lys あるいは Arg の際には観測されなかったことから、Leu の γ 位のメチル基による立体障害によりヒドロチオリシス反応が遅くなり、TCEP·HCl が消費されることにより酸化反応等副反応が起こり、複雑な副生成物を与えたものと推測される。. Figure 1-3 アスパルチミド副生成物 14 の構造. これまでの実験では、収率を HPLC でのピーク面積を元に算出してきた（Table 1 および 2）。続いて、ペプチドチオカルボン酸 11a-e の単離収率を求めた（Table 3）。単離収率の傾向は、HPLC を元に算出した結果と同様であった。特に C 末端アミノ酸残基が Ala および Lys の場合、他のアミノ酸残基に比べ単離収率が高かった。このことは、C 末端部分に適切なアミノ酸残基を選ぶ必要はあるものの、今回開発したペプチドチオカルボン酸合成法は、以前に報告されたペプチドチオカルボン酸合成法に比べエピメリ化が抑制可能な、より実践的な合成法であることを示唆している。. 15.

(20) Table 3. チオカルボン酸 11a-ea の単離収率 Entry. peptide thioacid. X. Isolated yield [%]. 1. 11a. Gly. 30. 2. 11b. Ala. 45. 3. 11c. Ser. 10. 4. 11d. Lys. 47. 5. 11e. Arg. 16. a. Peptides 10a-e（1.0 mM）, 120 mM (NH4)2S, 100 mM TCEP·HCl and 250 mM sodium ascorbate in 1.0 M NPB（pH 7）, 10%（v/v）NMP, 37 °C, 24 h.. 第五節. 結論. SEAlide ペプチドを利用した、Fmoc 固相合成法を基盤としたペプチドチオカルボン酸の新たな合成法を開発した。今回著者が開発したペプチドチオカルボン酸合成法では、以前に報告された同様のペプチドチオカルボン酸合成法に比べ C 末端アミノ酸残基のエピメリ化が大幅に抑制されることを確認した。また C 末端アミノ酸残基変更により本手法の適応性を評価したところ、Asn と Leu を除く、本研究で検討した C 末端アミノ酸残基に適応できることが判明した。以上のことより、今回開発したペプチドチオカルボン酸合成法は実用的合成法であると著者は確信している。. 16.

(21) 第二章. ラジカル的脱チオ炭酸反応を介した C 末端ペプチド N–アルキルアミド合成法の開発. 第一節. 研究背景. C 末端に修飾を有するペプチドは、医薬品としても生物学的ツールとしても魅力的である。特に C 末端 N–アルキルアミド化は、未修飾のペプチドに比べ生物学的活性および代謝安定性が大きく変化することから、精力的に研究されている 20-24。C 末端 N–アルキルアミド化ペプチドはすでに医薬品にもなっており、その代表例として前立腺癌治療薬として上市されたリュープロレリンが挙げられる（Figure 2-1）。. Figure 2-1 リュープロレリンの構造式. C 末端ペプチド N–アルキルアミドの化学合成法は、数多く報告されている。これら方法は、大きく二つに分けることができる。すなわち、樹脂上にてアルキル部分を導入する方法、および液相にて導入する方法である。前者の典型的合成法では、N–アルキルアミノ樹脂上にペプチドを伸長したのち、樹脂からの切り出しおよび側鎖脱保護を経て目的とするペプチドを得る。本手法では N– アルキルアミノ樹脂の調製が必須であり、また反応性の低い第二級アミンと C 末端アミノ酸の縮合が不可避である（Scheme 2-1）25。. Scheme 2-1 N–アルキルアミノ樹脂を用いたペプチド N–アルキルアミド合成. 17.

(22) そこで、第二級アミンと C 末端アミノ酸の縮合を避けるための手法として、求電子的リンカーを用いた方法が考案された（Scheme 2-2）26。すなわち、ペプチド鎖を樹脂上で伸長したのち、求電子性部分と第一級アミンの反応を経て N– アルキルアミド体を得る方法である。. Scheme 2-2 樹脂上でのアミノリシスによるペプチド N–アルキルアミド合成. 一方液相法は、ペプチドの C 末端カルボン酸とアルキルアミンとの縮合反応を用いているため、固相法に比べより簡便である（Scheme 2-3）。. Scheme 2-3 液相中での保護ペプチドとアルキルアミンとの縮合反応によるペプチド N–アルキルアミドの合成. しかしながら液相法では、C 末端カルボン酸を除く反応性官能基を保護する必要があり、C 末端カルボン酸とアミンとの縮合後にこれら保護基を除去する工程が必須である。近年、吉見ら 27 および他グループ 28-30 により、側鎖保護ペプチドから相当するペプチド N–アルキルアミドを合成する光誘起ラジカル的脱炭酸反応が報告された（Scheme 2-4）。この方法では、側鎖脱炭酸および光に誘起される副反応を避けるため、C 末端カルボン酸を除く側鎖官能基の多くを保護する必要がある。. Scheme 2-4 光誘起ラジカル的脱炭酸反応によるアルキルアミド合成 18.

(23) これに対し著者は、光照射を必要としない、側鎖無保護のペプチドに適用可能な C 末端選択的脱炭酸反応が開発できれば、脱炭酸後の脱保護不要な、ペプチド N–アルキルアミドの実践的な合成法になり得ると考えた。第一章で述べたとおり、著者は SEAlide ペプチドからペプチドチオカルボン酸を合成する方法を開発した（Scheme 2-5）。. Scheme 2-5 SEAlide ペプチドを用いたペプチドチオカルボン酸合成. 本研究の過程において、ペプチドチオカルボン酸を、システインをアラニンへと変換するために広く用いられているラジカル的脱硫反応に付したところ、ラジカル的脱チオ炭酸反応がおこり、C 末端 N–アルキルアミド化ペプチドが得られることを偶然に見出した（Scheme 2-6）。本ラジカル的脱硫反応は無保護タンパク質にも適用可能であることから 11、著者らの発見したラジカル的脱チオ炭酸反応がシステインを含まない無保護ペプチドチオカルボン酸の N–アルキルアミド体への変換法になり得ると考え、本研究に着手した。. Scheme 2-6 ペプチドチオカルボン酸のラジカル的脱硫反応条件下での C 末端 N–アルキルアミド生成. 19.

(24) 第二節. ラジカル的脱チオ炭酸反応の条件検討. 第一章で確立したペプチドチオカルボン酸合成法を利用し、基質 11 を合成した。続いて、11 のラジカル的脱チオ炭酸反応の検討を行った。本ペプチド配列は、先述した光誘起ラジカル的脱炭酸反応において保護基が必要なアミノ酸が含まれるよう設計した 27-30。具体的には Asp、Glu、Lys および Trp を含むよう設計した。反応追跡は HPLC および MS を用いて行い、結果を Table 4 に記載した。ペプチドチオカルボン酸 11 のラジカル的脱チオ炭酸反応. Table 4. Entry. Peptide thioacid. Reaction time [h]. Ratio of 15b [%]. Ratio of 12c [%]. 1. 11a. 6. 74. 26. 2. 11b. 6. 94. 0. 3. 11c. 4. 100. 0. d. 11d. 4. 100. 0. 5. 11e. 2. 92. 8. 6. 11h. 6. 92. 8. 4. The ratios of 12 and 15 were determined by HPLC analyses (detection at 220 nm) and subjected to the following equation (integ. = peak area). b Ratio of 15 = integ. 15/(integ. 11 + integ. 12 + integ. 15) × 100 c Ratio of byproduct 12 = (integ. 12)/(integ. 11 + integ. 12 + integ. 15) × 100 d A small peak its retention time was identical to that of 11d was observed by HPLC. However, MS analysis suggested that this peak was not 11d but some other peptide derivative (LRMS: calcd for [11d + 2H]2+, 712.9; obs. 640.32+; Relative peak area after 4 h of the reaction: 11d/the peptide derivative = 94/6).. ペプチドチオカルボン酸 11a を用いた場合、6 時間以内に目的とするペプチドアルキルアミド 15a が生成された（Table 4, entry 1）。また本反応において、ペプチドチオカルボン酸の加水分解体が主な副生成物として観測された（Figure 2-2）。続いて、種々のアミノ酸を C 末端に有するペプチドチオカルボン酸 11b-e および 11h のラジカル的脱チオ炭酸反応を検討した（Table 4, entries 2-6）。なお前章にて、C 末端に Asn を有するチオカルボン酸が合成困難であったことを踏まえ、Asn およびその類縁体の Gln については、検討を行わなかった。また、C 末端アミノ酸残基として Asp を有する SEAlide ペプチドの NCL 反応では、目 20.

(25) 的物であるα–ペプチド（7j）に加え、副生成物としてβ–ペプチド（7j-β）が得られた（Scheme 2-7）9c。この結果を踏まえ本研究では、C 末端に Asp およびその類縁体である Glu を有するペプチドついても、検討は行わなかった。. Scheme 2-7 C 末端 Asp を含む SEAlide ペプチドの NCL 反応まず、C 末端残基として Ala を含むペプチドチオカルボン酸 11b をラジカル脱チオ炭酸反応に付した結果、エチルアミド 15b が高収率で得られた。C 末端が Gly の時に比べ、Ala の場合にはペプチドチオカルボン酸の加水分解反応が抑制された。これは、アラニンα位のメチル基の立体障害によると推測した（Table 4, entries 1 and 2）。C 末端アミノ酸として Ser、Lys、Arg もしくは Tyr を有するペプチドチオカルボン酸（11c-e および 11h）においても、Gly の時に比較し加水分解が抑制され、高収率でアルキルアミド（15c-e および 15h）が生成された（Table 4, entries 3-6）。. 21.

(26) Figure 2-2 ペプチドチオカルボン酸 11a のラジカル的脱チオ炭酸反応の HPLC 追跡（Table 4, entry 1）。（A）反応時間 = 0 h。（B）反応時間 = 6 h。内部標準（IS） = ベンズアミド。*は緩衝液由来の非ペプチド化合物のピークである。. 22.

(27) 第三節. ラジカル的脱チオ炭酸反応を用いた ABT–510 の合成. 今回開発したペプチドチオカルボン酸のラジカル的脱チオ炭酸反応の有用性を実証するため、C 末端にエチルアミドを有する抗がん剤候補化合物である ABT–510 の合成に挑戦した（Figure 2-3）31。. Figure 2-3 ABT–510 の構造前駆体であるペプチドチオカルボン酸 17 は、相当する SEAlide ペプチド 16 のヒドロチオリシス反応により調製した（Scheme 2-8）。. Scheme 2-8 ペプチドチオカルボン酸 17 の調製. 23.

(28) 得られたペプチドチオカルボン酸 17 をラジカル的脱チオ炭酸反応に付したところ、目的とする ABT–510 18 を 47%と高い単離収率で得ることができた（Figure 2-4）。本結果は、著者が今回開発した合成法が C 末端 N–アルキルアミド化ペプチドの合成において実用的な手法であることを示唆している。. Figure 2-4 ラジカル的脱チオ炭酸反応による ABT–510 合成。（A）反応時間 = 0 h。（B）反応時間 = 2 h。内部標準（IS） = ベンズアミド。*は緩衝液由来の非ペプチド化合物。. 第四節. 結論. 今回著者は、ラジカル的脱チオ炭酸反応を利用した、ペプチドチオカルボン酸から C 末端 N–アルキルアミド化ペプチドを合成する新たな手法を開発した。本手法の特長は、システイン以外のアミノ酸の側鎖に保護基を必要としない点にある。さらに、C 末端アミノ酸を置換するのみで様々なアルキル基を導入可能な点も大きな特長と言える。本ラジカル的脱チオ炭酸反応は抗がん剤候補化合物 ABT–510 合成にも適応可能であり、C 末端ペプチド N–アルキルアミドの調製に有用な合成法であると著者は考えている。. 24.

(29) 結語本研究の成果を以下にまとめる。 1). ペプチドチオカルボン酸合成法の開発リン酸ナトリウム緩衝液を用いた中性条件下 SEAlide ペプチドを利用するこ. とで、Fmoc 固相合成法を基盤としたペプチドチオカルボン酸の新たな合成法を開発することに成功した。本手法は、以前の塩化水素を用いた系に比べ、C 末端アミノ酸のエピメリ化が抑制されることを証明した。さらに、本手法が適応できる C 末端アミノ酸の種類についても明らかにした。この結果、C 末端アミノ酸を適切に選択することで、本手法がペプチドチオカルボン酸の合成法として実用可能であることを実証した。 2). ラジカル的脱チオ炭酸反応を用いたペプチド N–アルキルアミド合成法開発ペプチドチオカルボン酸をラジカル的脱硫条件に付すことで、高効率的にペプチド N–アルキルアミドへ変換できることを見出した。さらに本手法が、システイン以外のアミノ酸側鎖に保護基を必要としない、ペプチドチオカルボン酸の化学選択的 C 末端脱チオ炭酸反応であることを明らかにした。最後に本手法を抗がん剤候補化合物である ABT–510 合成に適用し、その有用性を示した。. 今後、著者の開発したペプチドチオカルボン酸合成法およびペプチドチオカルボン酸のペプチド N–アルキルアミドへの変換法が、ペプチド医薬品創製の一助になることを期待したい。. 25.

(30) 謝辞本研究に際し、終始御懇篤なる御指導ならびに御鞭撻を賜りました徳島大学大学院医歯薬学研究部大高章教授に心から深く感謝の意を表します。また、多くの有益な御助言ならびに様々な御討議を頂きました徳島大学大学院医歯薬学研究部重永章講師、猪熊翼特任助教および根本尚夫准教授に厚く御礼申し上げます。本研究を行うに当たり、御協力を頂きました佐藤浩平博士、粟飯原圭佑修士、坂本健修士、北未来修士、宮島凜学士、成瀬公人学士および山岡浩輔氏をはじめとする徳島大学大学院薬科学教育部機能分子合成薬学分野の諸氏に心より感謝致します。多方面から実験のサポートをしてくださいました徳島大学大学院医歯薬学研究部総合研究支援センター中央機器室（薬学系分室）北池秀次技術専門職員に拝謝致します。最後に、精神的、経済的な支えとなり、終始温かい目で見守ってくれた両親ならびに家族に心より深謝致します。. 26.

(31) Experimental Section.

(32) General Methods All of the reactions involving small molecules were implemented under an atmosphere of argon at room temperature. For column chromatography, silica gel (KANTO KAGAKU N-60) was used. Mass spectra were recorded on a Waters MICROMASS® LCT PREMIERTM (ESI-TOF) or a Bruker Esquire200T (ESI-Ion Trap). NMR spectra were recorded using a Bruker AV400N at 400 MHz frequency for 1H and a JEOL JNM-AL300 at 75 MHz frequency for 13C. For HPLC separations, a Cosmosil 5C18-AR-II analytical column (Nacalai Tesque, 4.6 × 250 mm, flow rate 1.0 mL min-1), a Cosmosil 5C18-AR-II semi-preparative column (Nacalai Tesque, 10 × 250 mm, flow rate 3.0 mL min-1), or a Cosmosil 5C18-AR-II preparative column (Nacalai Tesque, 20 × 250 mm, flow rate 10 mL min-1) was used, and eluting products were detected by UV at 220 nm. Mobile phases consisting of 0.1% TFA aqueous solution (v/v, solvent A) and 0.1% TFA in MeCN (v/v, solvent B) was utilized for HPLC elution. The HPLC system was eluted with a liner gradient of solvent A in solvent B over 30 min unless otherwise noted. Optical rotation was measured using a JASCO P-2200 polarimeter (concentration in g dL-1).. 28.

(33) Chapter 1 Typical Procedure for preparation of the 4-[(Fmoc-Xaa){2-(triphenylmethylsulfanyl)ethyl}amino]benzoic acid. To a solution of allyl 4-[{Fmoc-Lys(Boc)}{2-(triphenylmethylsulfanyl)ethyl}amino]benzoate 19d (260 mg, 279 mmol) in THF (6.2 mL) were added N-methylaniline (303 µL, 2.79 mmol) and Pd(PPh3)4 (32.3 mg, 27.9 µmol). The resulting mixture was stirred overnight and was then concentrated to dryness. The residue was treated with monohexylamine (32 µL, 28 µmol) and EtOAc. The resulting mixture was stirred for 5 min and concentrated to dryness to give a solid, which was washed with Et2O. The solid was partitioned between EtOAc and saturated aqueous citric acid. Then, the organic layer was collected, washed with 5% (w/v) aqueous citric acid, and dried over MgSO4. The organic layer was subsequently concentrated under reduced pressure to give the benzoic acid 8d (211 mg) in 85% isolated yield. 4-[{Fmoc-Lys(Boc)}{2-(triphenylmethylsulfanyl)ethyl}amino]benzoic acid 8d. Pale yellow amorphousness; [α]19D +71.0 (c 1.00, CHCl3); 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ = 1.01-1.30 (4H, br m), 1.31-1.52 (2H, m), 1.41 (9H, s), 2.29 (1H, m), 2.54 (1H, m), 2.95 (2H, br s), 3.31 (1H, m), 3.60 (1H, m), 4.12-4.27 (1H, m), 4.19 (1H, t, J = 7.0 Hz), 4.35 (2H, d, J = 7.0 Hz), 4.54 (1H, s), 5.68 (1H, br d, J = 8.2 Hz), 7.05-7.44 (19H, m), 7.39 (2H, t, J = 7.4 Hz), 7.59 (2H, dd, J = 5.6 and 7.7 Hz), 7.75 (2H, d, J = 7.5 Hz), 8.07 (2H, d, J = 8.3 Hz); 13C NMR (CDCl3, 75 MHz) δ = 22.3, 28.5, 29.3, 29.3, 32.6, 40.1, 47.2, 49.2, 51.6, 67.1, 67.2, 79.3, 120.1, 125.3, 126.8, 127.2, 127.8, 128.0, 128.4, 129.6, 29.

(34) 129.9, 131.9, 141.4, 143.9, 143.9, 144.6, 145.0, 145.0, 156.2, 168.9, 172.3; HRMS (ESI-TOF) m/z calcd for C54H55N3NaO7S ([M+Na]+) 912.3658, found 912.3617. 4-[{Fmoc-Arg(Pbf)}{2-(triphenylmethylsulfanyl)ethyl}amino]-benzoic acid 8e. Pale yellow amorphousness; 861 mg, (77%); [α]19D +52.4 (c 1.00, CHCl3); 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ = 1.27-1.35 (2H, m), 1.38 (3H, s), 1.39 (3H, s), 1.42-1.52 (2H, m), 2.03 (3H, s), 2.22-2.34 (1H, m), 2.32 (3H, s), 2.38-2.58 (2H, m), 2.52 (3H, s), 2.71-2.92 (1H, br m), 2.71-2.92 (2H, m), 3.20 (1H, ddd, J = 13.1, 9.1, 5.7 Hz), 3.73 (1H, br m), 4.16 (1H, t, J = 6.9 Hz), 4.18-4.25 (2H, m), 4.30-4.40 (2H, m), 5.96 (1H, br d, J = 8.0 Hz), 6.25 (2H, br s), 7.06 (2H, d, J = 8.0 Hz), 7.09-7.44 (20H, m), 7.54 (1H, d, J = 7.4 Hz), 7.58 (1H, d, J = 7.4 Hz ), 7.75 (2H, d, J = 7.5 Hz), 8.02 (2H, d, J = 8.0 Hz); 13C NMR (CDCl3, 75 MHz) δ = 12.6, 17.9, 19.4, 24.7, 28.7, 29.2, 30.8, 40.1, 43.3, 47.2, 49.1, 50.7, 67.2, 67.5, 86.5, 117.6, 120.2, 120.2, 124.8, 125.2, 126.9, 127.3, 127.9, 128.0, 128.4, 129.6, 130.5, 131.9, 132.6, 138.7, 141.4, 143.6, 143.7, 144.4, 144.5, 156.7, 156.8, 158.9, 168.5, 171.4; HRMS (ESI-TOF) m/z calcd for C62H63N5O8S2 ([M+H]+) 1070.4196, found 1070.4196. 4-[(Fmoc-Leu){2-(triphenylmethylsulfanyl)ethyl}amino]benzoic acid 8g. Pale yellow amorphousness; 1.27 g, (77%); [α]19D +95.3 (c 1.00, CHCl3); 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ = 0.37 (3H, d, J = 6.0 Hz), 0.72 (3H, d, J = 6.1 Hz), 1.09-1.20 (1H, m), 1.34-1.51 (2H, m), 2.27-2.35 (1H, m), 2.49-2.60 (1H, m), 3.24-3.35 (1H, m), 3.57-3.68 (1H, m), 4.20 (1H, t, J = 7.1 Hz), 4.23-4.39 (3H, m), 5.50 (1H, d, J = 9.1 Hz), 7.10-7.36 (19H, m), 7.39 (2H, t, J = 7.4 Hz), 7.59 (1H, d, J = 7.2 Hz), 7.60 (1H, d, J = 30.

(35) 7.2 Hz), 7.76 (2H, d, J = 7.5 Hz), 8.11 (2H, d, J = 8.1 Hz); 13C NMR (CDCl3, 75 MHz) δ =20.9, 23.4, 24.5, 29.4, 42.3, 47.3, 49.2, 50.5, 67.2, 120.1, 125.3, 126.8, 127.2, 127.8, 128.0, 128.6, 129.3, 129.7, 131.9, 141.5, 143.9, 144.0, 144.7, 145.5, 156.4, 169.4, 172.9; HRMS (ESI-TOF) m/z calcd for C49H46N2NaO5S ([M+Na]+) 797.3025, found 797.3036. General procedure for preparation of SEAlide peptides 10. NovaSyn TGR resin (Rink amide type: 0.22 mmol amine/g, 0.46 g, 0.10 mmol) was coupled with Fmoc-Leu-OH (106 mg, 0.30 mmol) using HBTU (110 mg, 0.29 mmol) and DIPEA (52 µL, 0.30 mmol) in DMF at room temperature for 30 min. The subsequent removal of the Fmoc group with 20% (v/v) piperidine in DMF afforded the corresponding Leu-incorporated resin. This resin was then treated with a mixture of 8 (0.20 mmol, preparation of 8a-c, 8f and 8h is described in reference 9a, 9c and 32, respectively), HATU (72 mg, 0.19 mmol) and DIPEA (0.20 mmol) in DMF at room temperature for 2 h to produce the Fmoc-aminoacyl SEAlide-incorporated resin. The resulting resin was subjected to a standard Fmoc SPPS (coupling: Fmoc aminoacid/HBTU/DIEPA (3.0/2.9/3.0 equiv), 0.5 h; Fmoc removal: 20% (v/v) piperidine in DMF, 10 min) for the elongation of the peptide chain to obtain the protected peptide resin. The completed resin (30 or 200 mg) was exposed to a TFA-based mixture of reagents (i.e., TFA/thioanisole/m-cresol/EDT/H2O-82:5:5:3:5 (v/v), 50 µL/1 mg of the resin) at room temperature for 120-150 min. The reaction mixture was filtered and treated with cold Et2O to give a precipitate, which was collected by centrifugation and purified by preparative HPLC to give the SEAlide peptide . 10a, 15.6 mg (25% as 10·2TFA); Analytical HPLC conditions: 20-40%, retention time = 24.8 min, LRMS (ESI-Ion Trap) m/z calcd. for [M+H]+ 1628.8, found 1628.2. 10b, 22.9 mg (36% as 10b·2TFA); Analytical HPLC conditions: 20-40%, retention time = 25.6 min, LRMS (ESI-Ion Trap) m/z calcd. for [M+H]+ 1642.8, found 1643.1. 10c, 21.4 mg (34% as 10c·2TFA); Analytical HPLC conditions: 20-40%, retention time = 23.4 min, LRMS (ESI-Ion Trap) m/z calcd. for [M+H]+ 1658.8, found 1659.0. 10d, 13.6 mg (18% as 10d·3TFA); Analytical HPLC conditions: 20-40%, retention time 31.

(36) = 22.7 min, LRMS (ESI-Ion Trap) m/z calcd. for [M+H]+ 1699.8, found 1700.3. 10e, 19.4 mg (22% as 10e·3TFA); Analytical HPLC conditions: 20-40%, retention time = 23.2 min, LRMS (ESI-TOF) m/z calcd. for [M+H]+ 1727.8, found 1727.9. 10f, 0.5 mg (5% as 10f·2TFA); Analytical HPLC conditions: 20-40%, retention time = 22.1 min, LRMS (ESI-Ion Trap) m/z calcd. for [M+H]+ 1685.8, found 1686.1. 10g, 17.3 mg (33% as 10g·2TFA); Analytical HPLC conditions: 20-50%, retention time = 23.0 min, LRMS (ESI-TOF) m/z calcd. for [M+2H]2+ 842.9, found 842.7. 10h, 20.9 mg (32% as 10h·2TFA); Analytical HPLC conditions: 20-50%, retention time = 21.4 min, LRMS (ESI-TOF) m/z calcd. for [M+2H]2+ 867.9, found 867.6. General procedure for the preparation of C-terminal peptide thioacids 11. To a solution of SEAlide peptide 11 (1.0 µmol) in NMP (100 µL) were added 1.0 M NPB (900 µL) containing 120 mM NaSH or (NH4)2S, 100 mM TCEP·HCl and 250 mM Na ascorbate. The resulting mixture was incubated at 37 °C. Aliquots of the reaction mixture (5.0 µL) were withdrawn at regular time intervals and analyzed by analytical HPLC. To determine the isolated yields, an entire reaction mixture was fractionated by semi-preparative HPLC following 24 h of the reaction and the product was acquired after lyophilization. 11a. Analytical HPLC conditions: 20-40%, retention time = 20.3 min, LRMS (ESI-TOF) m/z calcd. for [M+2H]2+ 677.3, found 677.3. 12a. Analytical HPLC conditions: 20-40%, retention time = 16.7 min, LRMS (ESI-TOF) m/z calcd. for [M+2H]2+ 669.3, found 669.3. 13a. Analytical HPLC conditions: 20-40%, retention time = 15.8 min, LRMS (ESI-TOF) m/z calcd. for [M+2H]2+ 668.8, found 668.8. Thioester of 10a. Analytical HPLC conditions: 20-40%, retention time = 25.6 min, LRMS (ESI-TOF) m/z calcd. for [M+2H]2+ 814.9, found 814.9. SEAlide deriv. Analytical HPLC conditions: 20-40%, retention time = 21.7 min, LRMS (ESI-TOF) m/z calcd. for [M+H] + 310.2, found 310.4. 11b. Analytical HPLC conditions: 20-40%, retention time = 21.3 min, LRMS (ESI-TOF) m/z calcd. for [M+2H]2+ 684.3, found 684.2. 32.

(37) 12b. Analytical HPLC conditions: 20-40%, retention time = 16.8 min, LRMS (ESI-TOF) m/z calcd. for [M+2H]2+ 676.3, found 676.2. 13b. Analytical HPLC conditions: 20-40%, retention time = 15.8 min, LRMS (ESI-TOF) m/z calcd. for [M+2H]2+ 675.8, found 675.8. 11c. Analytical HPLC conditions: 20-40%, retention time = 19.0 min, LRMS (ESI-TOF) m/z calcd. for [M+2H]2+ 692.3, found 692.5. 12c. Analytical HPLC conditions: 20-40%, retention time = 16.1 min, LRMS (ESI-TOF) m/z calcd. for [M+2H]2+ 684.3, found 684.5. 13c. Analytical HPLC conditions: 20-40%, retention time = 15.2 min, LRMS (ESI-TOF) m/z calcd. for [M+2H]2+ 683.8, found 683.9. 11d. Analytical HPLC conditions: 20-40%, retention time = 16.0 min, LRMS (ESI-TOF) m/z calcd. for [M+2H]2+ 712.9, found 712.8. 12d. Analytical HPLC conditions: 20-40%, retention time = 13.0 min, LRMS (ESI-TOF) m/z calcd. for [M+2H]2+ 704.9, found 704.8. 13d. Analytical HPLC conditions: 20-40%, retention time = 12.1 min, LRMS (ESI-Ion Trap) m/z calcd. for [M+2H]2+ 704.4, found 704.6. 11e. Analytical HPLC conditions: 20-40%, retention time = 16.3 min, LRMS (ESI-TOF) m/z calcd. for [M+2H]2+ 726.8, found 726.7. 12e. Analytical HPLC conditions: 20-40%, retention time = 13.5 min, LRMS (ESI-TOF) m/z calcd. for [M+2H]2+ 718.9, found 718.8. 13e. Analytical HPLC conditions: 20-40%, retention time = 12.7 min, LRMS (ESI-TOF) m/z calcd. for [M+2H]2+ 718.4, found 718.4. 11g. Analytical HPLC conditions: 15-45%, retention time = 26.6 min, LRMS (ESI-TOF) m/z calcd. for [M+2H]2+ 705.3, found 705.2. 12g. Analytical HPLC conditions: 15-45%, retention time = 23.0 min, LRMS (ESI-TOF) m/z calcd. for [M+2H]2+ 697.3, found 697.3. 13g. Analytical HPLC conditions: 15-45%, retention time = 22.2 min, LRMS (ESI-TOF) m/z calcd. for [M+2H]2+ 696.9, found 696.8. 11h. Analytical HPLC conditions: 20-50%, retention time = 17.4 min, LRMS (ESI-TOF) m/z calcd. for [M+2H]2+ 730.3, found 730.2. 12h. Analytical HPLC conditions: 20-50%, retention time = 14.6 min, LRMS (ESI-TOF) m/z calcd. for [M+2H]2+ 722.3, found 722.3. 13h. Analytical HPLC conditions: 20-50%, retention time = 13.6 min, LRMS (ESI-TOF) m/z calcd. for [M+2H]2+ 721.8, found 721.8. 14. Analytical HPLC conditions: 20-40%, retention time = 15.8 min, LRMS (ESI-TOF) m/z calcd. for [M+2H]2+ 688.8, found 688.8. 33.

(38) Evaluation of the C-terminal epimerization Analyte 11b was synthesized using the protocol described above and analyzed by HPLC using two analytical columns, which were connected tandemly. The analytical HPLC conditions were as follows: 22-32% over 2 h, retention times = 74.3 min (11b) and 72.7 min (11b’: epimer of 11b at the C-terminal Ala residue).. Analyte 11b’, which was the epimer of 11b at the C-terminal Ala residue, was prepared as follows. Peptide thioester 20 was synthesized via a Boc-SPPS method using an in situ neutralization protocol33 on HSCH2CH2CO-Leu-MBHA resin (0.70 mmol amine/g, 0.14 g, 0.10 mmol). The resulting resin was treated with a mixture of 1.0 M TMSOTf/thioanisole (50 µL/1 mg resin), m-cresol and EDT (100:5:5, (v/v)) at 0 °C for 2 h. The reaction mixture was filtered and treated with cold Et2O to give a precipitate, which was collected by centrifugation and dissolved in a mixture of 0.1% (v/v) TFA in H2O and 0.1% TFA (v/v) in MeCN (5.0 mL, 1:1 (v/v)). The solution was lyophilized to obtain crude 19, which was dissolved in 5.0 mL of 1.0 M NPB containing 120 mM NaSH (pH 9.1). The reaction mixture was held at room temperature for 1 h before being purified by preparative HPLC to afford pure 11b’ after lyophilization. Analytical HPLC conditions: 20-40%, retention time = 22.7 min, LRMS (ESI-Ion Trap) m/z calcd. for [M+H] + 1367.6, found 1368.0.. 34.

(39) Chapter 2 Preparation of C-terminal peptide thioacids 11 and 17. C-Terminal peptide thioacids 11 and 17 were synthesized from corresponding SEAlide derivatives according to the above-mentioned protocol in Chapter 1. 16, 11.6 mg (18% as 16·TFA); Analytical HPLC conditions: 20-50%, retention time = 19.4 min, LRMS (ESI-TOF) m/z calcd. for [M+2H] 2+ 665.4, found 665.3. 17, 2.3 mg (25% as 17·TFA); Analytical HPLC conditions: 20-50%, retention time = 17.3 min, LRMS (ESI-TOF) m/z calcd. for [M+2H] 2+ 527.8, found 527.9. Typical procedure for the preparation of peptides with C-terminal N-alkylamide 15 To peptide thioacid 11 (0.20 µmol) was added 6.0 M solution of Gn·HCl in 0.10 M NPB (200 µL, pH 7) containing 10 mM of glutathione and 40 mM of TCEP·HCl. The mixture was treated sequentially with an aqueous solution of VA-044 (0.20 M, 25.2 µL) as a radical initiator and a 1% (w/v) aqueous benzamide solution (10 µL) as an internal standard. The resulting reaction mixture was incubated at 37 °C. Aliquots of the reaction mixture (2.0 µL) were periodically collected and analyzed using analytical HPLC to check the progress of the reaction. 15a. Analytical HPLC conditions: 10-40%, retention time = 22.7 min, LRMS (ESI-TOF) m/z calcd. for [M+2H] 2+ 647.3, found 647.3. 35.

(40) 15b. Analytical HPLC conditions: 10-40%, retention time = 24.8 min, LRMS (ESI-TOF) m/z calcd. for [M+2H] 2+ 654.3, found 654.4. 15c. Analytical HPLC conditions: 10-40%, retention time = 22.4 min, LRMS (ESI-TOF) m/z calcd. for [M+2H] 2+ 662.3, found 662.4. 15d. Analytical HPLC conditions: 10-40%, retention time = 20.6 min, LRMS (ESI-TOF) m/z calcd. for [M+2H] 2+ 682.9, found 682.8. 15e. Analytical HPLC conditions: 10-40%, retention time = 21.6 min, LRMS (ESI-TOF) m/z calcd. for [M+2H] 2+ 696.9, found 696.8. 15h. Analytical HPLC conditions: 10-40%, retention time = 26.6 min, LRMS (ESI-TOF) m/z calcd. for [M+2H] 2+ 700.3, found 700.3. Preparation of ABT-510 18. ABT-510 18 was synthesized from the corresponding peptide thioacid 17 according to the above-mentioned protocol. 18, 1.0 mg (47% as 18·TFA); Analytical HPLC conditions: 10-40%, retention time = 23.9 min, LRMS (ESI-TOF) m/z calcd. for [M+H] + 994.6, found 994.4.. 36.

(41) 引用文献 1.. Niyomura, O.; Kato, S. Top. Curr. Chem. 2005, 251, 1-12.. 2. 3.. Park, S.-D.; Oh, J.-H.; Lim, D. Tetrahedron Lett. 2002, 43, 6309-6311. (a) Shangguan, N.; Katukojvala, S.; Greenberg, R.; Williams, L. J. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 7754-7755; (b) Kolakowski, R. V.; Shangguan, N.; Sauers, R. R.; Williams, L. J. J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 5695-5702; (c) Zhang, X.; Li,. 4. 5.. F.; Lu, X.-W.; Liu, C.-F. Bioconjugate Chem. 2009, 20, 197-200. Lemieux, G. A.; Bertozzi, C. R. Trens Biotechnol. 1998, 16, 506-513. For reviews of NCL, see: (a) Kang, J.; Macmillan, D. Org. Biomol. Chem. 2010, 8, 1993-2002; (b) Mende, F.; Seitz, O. Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50, 1232-1240; (c) Macmillan, D.; Adams, A.; Premdjee, B. Isr. J. Chem. 2011, 51, 885-899; (d) Raibaut, L.; Ollivier, N.; Melnyk, O. Chem. Soc. Rev. 2012, 41, 7001-7015; (e) Zheng, J.-S.; Tang, S.; Huang, Y.-C.; Liu, L. Acc. Chem. Res. 2013, 46, 2475-2484; (f) Kawakami, T. Top. Curr. Chem. 2015, 362, 107-135; (g) Tailhades, J.; Patil, N. A.; Hossain, M. A.; Wade, J. D. J. Pept. Sci. 2015, 21, 139-147.. 6.. (a) Blake, J. Int. J. Pept. Protein Res. 1981, 17, 273-274; (b) Black, J.; Li, C. H. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1981, 78, 4055-4058; (c) Cheng, H.-C.; Yamashiro, D. Int. J. Pept. Protein Res. 1991, 38, 70-78; (d) Schwabacher, A. W.; Maynard, T. L. Tetrahedron Lett. 1993, 34, 1269-1270; (e) Canne, L. E.; Walker, S. M.; Kent, S. B. H. Tetrahedron Lett. 1995, 36, 1217-1220; (f) Goldstein, A. S.; Gelb, M. H. Tetrahedron Lett. 2000, 41, 2797-2800; (g) Gaertner, H.; Villain, M.; Botti, P.; Canne, L. Tetrahedron Lett. 2004, 45, 2239-2241, (h) Zhang, X; Lu, X. W.; Liu, C.-F. Tetrahedron Lett. 2008, 49, 6122-6125.. 7.. (a) Raz, R.; Rademann, J. Org. Lett. 2012, 14, 5038-5041; (b) Pira, S. L.; Boll, E.; Melnyk, O. Org. Lett. 2013, 15, 5346-5349; (c) Chen, C.; Huang, Y.; Xu, L.; Zheng, Y.; Xu, H.; Guo, Q.; Tian, C.; Li, Y.; Shi, J. Org. Biomol. Chem.. 8.. 9.. 2014, 12, 9413-9418. For reviews of SEAlide, see: (a) Otaka, A.; Sato, K.; Ding, H.; Shigenaga, A. Chem. Rec. 2012, 12, 479-490; (b) Otaka, A.; Sato, K.; Shigenaga, A. Top. Curr. Chem. 2015, 363, 33-56. (a) Tsuda, S.; Shigenaga, A.; Bando, K.; Otaka, A. Org. Lett. 2009, 11, 823-826; (b) Sato, K.; Shigenaga, A.; Tsuji, K.; Tsuda, S.; Sumikawa, Y.; Sakamoto, K.; Otaka, A. ChemBioChem 2011, 12, 1840-1844; (c) Sakamoto, 37.

(42) K.; Sato, K.; Shigenaga, A.; Tsuji, K.; Tsuda, S.; Hibino, H.; Nishiuchi, Y.; 10.. Otaka, A. J. Org. Chem. 2012, 77, 6948-6958. (a) Shigenaga, A.; Sumikawa, Y.; Tsuda. S.; Sato. K.; Otaka. A. Tetrahedron 2010. 66. 3290-3296; (b) Tsuji, K.; Shigenaga, A.; Sumikawa, Y.; Tanegashima, K.; Sato, K.; Aihara, K.; Hara, T.; Otaka, A. Bioorg. Med. Chem. 2011, 19, 4014-4020.. 11.. Dawson, P. E. Isr. J. Chem. 2011, 51, 862-867.. 12. 13.. Crich, D.; Sana, K. J. Org. Chem. 2009, 74, 7383-7388. Tsuji, K.; Tanegashima, K.; Sato, K.; Sakamoto, K.; Shigenaga, A.; Inokuma,. 14.. T.; Hara, T.; Otaka, A. Bioorg. Med. Chem. 2015, 23, 5909-5914. For review of hRFRP-1, see: Pertovaara, A.; Ostergard, M.; Anko, M.-L.; Lehti-Koivunen, S.; Brandt, A.; Hong, W.; Kopri, E. R.; Panula, P. Neurosci.. 15.. 2005, 134, 1023-1032. Rohde, H.; Schmalisch, J.; Harpaz, Z.; Diezmann, F.; Seitz, O. ChemBioChem. 16.. 2011, 12, 1396-1400. Payne, R. J.; Ficht, S.; Greenberg, W. A.; Wong, C.-H. Angew. Chem. Int. Ed.. 17. 18. 19. 20. 21.. 22. 23. 24.. 2008, 47, 4411-4415. Tan, X.-H.; Yang, R.; Wirjo, A.; Liu, C.-F. Tetrahedron Lett. 2008, 49, 2891-2894. Kawakami, T.; Aimoto, S. Tetrahedron 2009, 65, 3871-3877. Sunbirós-Funosas, R.; El-Faham, A.; Albericio, F. Tetrahedron 2011, 67, 8595-8606. Coy, D. H.; Coy, E. J.; Schally, A. V.; Vilchez-Martinez, J.; Hirotsu, Y.; Arimura, A. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1974, 57, 335-340. Fujino, M.; Fukuda, T.; Shinagawa, S.; Kobayashi, S.; Yamazaki, I.; Nakayama, R.; Seely, J. H.; White, W. F.; Rippel, R. H. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1974, 60, 406-413. Karten, M. J.; River, J. E. Endocr. Rev. 1986, 7, 44-66. Li, Q.; Moutiez, M.; Charbonnier, J.-B.; Vaudry, K.; Ménez, A.; Quéméneur, E.; Dugave, C. J. Med. Chem. 2000, 43, 1770-1779. Tamamura, H.; Hiramatsu, K.; Mizumoto, M.; Ueda, S.; Kusano, S.; Terakubo, S.; Akamatsu, M.; Yamamoto, N.; Trent, J. O.; Wang, Z.; Peiper, S. C.;. 25.. Nakashima, H.; Otaka, A.; Fujii, N. Org. Biomol. Chem. 2003, 1, 3663-3669. For review of preparation of peptide N-alkylamide on-resin, see: Alsina, J.;. 26.. Albericio, F. Biopolymers (Pept. Sci.) 2003, 71, 454-477. Lin, H.; Yang, X. X.; Wang, D. X. Chinese Chem Lett. 2012, 23, 565-568. 38.

(43) 27.. Maeda, K.; Saito, H.; Osaka, K.; Nishikawa, K.; Sugie, M.; Morita, T.; Takahashi, I.; Yoshimi, Y. Tetrahedron 2015, 71, 1117-1123.. 28.. Saavedra, C.; Hernández, R.; Boto, A.; Álvarez, E. J. Org. Chem. 2009, 74, 4655-4665.. 29.. Cassani, C.; Bergonzini, G.; Wallentin, C.-J. Org. Lett. 2014, 16, 4228-4231.. 30.. Chu, L.; Ohta, C.; Zuo, Z.; MacMillan, D. W. C. J. Am. Chem. Soc. 2014, 136, 10886-10889.. 31. 32.. Sorbera, L. A.; Bayes, M. Drugs Future 2005, 30, 1081-1086. Miyajima, R.; Tsuda, Y.; Inokuma, T.; Shigenaga, A.; Imanishi, M.; Futaki, S.; Otaka, A. Biopolymers (Pept. Sci.) in press (doi: 10.1002/bip.22757). 33.. (a) Schnölzer, M.; Alewood, P.; Jones, A.; Alewood, D.; Kent, S. B. H. Int. J. Pept. Protein Res. 1992, 40, 180-193; (b) Hackeng, T. M.; Griffin, J. H., Dawson, P. E. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96, 10068-10073.. 39.

(44) 論文目録公刊論文 1.. Facile synthesis of C-terminal peptide thioacids under mild conditions from N-sulfanylethylanilide peptides Tatsuhiko Shimizu, Rin Miyajima, Kohei Sato, Ken Sakamoto, Naoto Naruse, Miku Kita, Akira Shigenaga, and Akira Otaka Tetrahedron 2016, 72, 992-998.. 2.. Facile. preparation. of. peptides. with. C-terminal. N-alkylamide. via. radical-initiated dethiocarboxylation Tatsuhiko Shimizu, Rin Miyajima, Naoto Naruse, Kosuke Yamaoka, Keisuke Aihara, Akira Shigenaga, and Akira Otaka Chem. Pharm. Bull. in press.. 40.

(45)