厚生労働科学研究費補助金（創薬基盤推進研究事業）
分担研究報告書
癌特異的分子に基づく癌個別化治療の開発
研究分担者 大内田研宙 （九州大学 先端医療イノベーションセンター 講師）
研究要旨
最近の解析技術の進歩により、腫瘍内の特定の微小細胞集団ががん患者の予後を規定することが 明らかとなった。今後は細胞レベルの個別性を評価してその中でも特に悪性度が高い細胞集団を標 的とした真の癌個別治療の開発が必要である。本研究ではウイルス治療と従来のドラッグデリバリ ーシステム（DDS）を融合した新規人工ウイルスを診断、治療選択に用いて、細胞レベルの個別診 断の画像化とそれに基づく真の癌個別治療を実現することを目的とした。各種癌に対する標的細 胞・分子の同定あるいは分子標的マーカーの絞り込みのための発現解析を終了し、各関連分子の機 能解析を進めた。人工ウイルス改変MRI造影剤の作成に関して人工ウイルスの基盤技術は確立し、
特定の細胞集団を選択的に検出するMRI造影剤を作成しており、その機能解析をin vivoで行うため の自然発癌モデルマウスの導入をすすめて、その実験系を確立した。
共同研究者
井上 重隆（INOUE SHIGETAKA） 九州大学・医学研究院・共同研究員
難波江 俊永(NABAE TOSHINAGA)
九州大学・医学研究院・共同研究員
白羽根 健吾(SHIRAHANE KENGO)
九州大学・医学研究院・共同研究員
森山 大樹(MORIYAMA TAIKI) 九州大学・医学研究院・共同研究員
A.研究目的
膵癌など早期診断が困難な癌や進行消化管癌の 予後は不良である。最近の解析技術の進歩によ
り、腫瘍内の特定の微小細胞集団ががん患者の 予後を規定することが明らかとなった。今後は 細胞レベルの個別性を評価してその中でも特に 悪性度が高い細胞集団を標的とした真の癌個別 治療の開発が必要である。本研究ではウイルス 治療と従来のドラッグデリバリーシステム（DD S）を融合した新規人工ウイルスを診断、治療選 択に用いて、細胞レベルの個別診断の画像化と それに基づく真の癌個別治療を実現することを 目的とする。さらに、膵癌は非常に予後不良な 癌腫であり、特にその治療法の開発は強く望ま れているが、その悪性度の原因として、高い浸 潤・転移能がある。膵癌原発巣に特徴的な des
moplasia と呼ばれる過剰な間質増生は、癌生存 に有意な微小環境を提供するだけでなく、癌細 胞の進化を促進し、原発巣での転移臓器指向性 を有した癌細胞集団のセレクションに寄与して いる可能性が指摘されている。しかし、desmop lasiaを形成する間質細胞集団のheterogeneityの 観点から、転移臓器指向性を有した癌細胞の決 定機序を説明した報告はない。本研究では、膵 癌微小環境の多様性が転移臓器指向性を有した 癌細胞を選択・決定する機序を明らかにするこ とで、この機序に着目して、新たなDDSによる 膵癌治療戦略を開発することを目的とする。
本研究では、まず癌根治に関わる標的細胞に特 異的に輸送する人工ウイルスを作成する。作成 した人工ウイルスにMRI造影剤を内包し、標的 癌細胞評価のためのMRI分子イメージングによ る画像診断システムを構築する。作成した人工 ウイルスに標的細胞特異的な治療薬剤を封入し、
個別癌細胞治療システムを構築する。さらに膵 癌間質と各転移巣間質の遺伝子発現プロファイ ルの類似性を検討し、膵癌原発巣の特定間質因 子が臓器指向性を有した癌細胞集団を誘導する 機序を解明する。それに基づき既存の薬剤と新 規のDDS治療薬の併用による臓器特異的転移の 抑制効果を検討する。
B, 研究方法と結果
① 人工ウイルス改変MRI造影剤の作成：既 にNEDOおよび厚労科研の支援により人工ウイ ルスの基盤は確立しており、また改変手法も遺 伝子組み換え等、複数の方法を確立している。
膵癌、大腸癌、胃癌、食道がんにおける培養細 胞株、手術切除標本を用いた発現解析において、
新規の治療標的候補として複数の分子を同定し た。その中でもCD146, CD166, Nodal,MAL2に 関してさらなる詳細な発現解析をFACSやセル ソーター、免疫組織化学染色にて進め，その特 異的な発現パターンを明らかにした。さらに機 能解析も平行して施行し、invasion assayやmigr ation assayによってそのCD146やCD166の発現 状況によって癌細胞の悪性度が異なる可能性を 見いだした。さらに癌の微小環境を形成してい る間質細胞における発現パターンも同時に解析
をすすめNodalが膵癌細胞にも周囲の間質細胞
にも同様に発現していて、臨床病理学的な因子 との相関関係を認めた。また、MAL2は膵癌の 転移形成と関連していることが高転移株の解析 から同定され，またin vitroの実験でもその浸潤 能や遊走能への関与が示された。
② 癌細胞の生存に有意な微小環境は、原発 巣と転移巣で類似した性質を有しているという コンセプトから、ヒト膵癌切除組織における原 発巣間質と各転移巣間質の網羅的遺伝子発現解 析を行い、共通する発現パターンを示す間質因 子を検討した。次にその間質因子から、転移臓 器指向性を有した癌細胞クローンを作成、また、
切除組織より樹立した膵星細胞からターゲット 間質因子を過剰に発現する膵星細胞集団の同定 及び分取を行なった。これによりさらに癌の微 小環境に含まれる癌間質の主体である間葉系の 細胞も標的細胞として解析することが可能とな った。特に膵癌間質に含まれる膵星細胞は膵癌 の浸潤や転移に深く関わっている。この細胞の 制御に抗線維薬であるピルフェニドンが有効か
を検討した。その結果、ピルフェニドンは著明 に間質細胞の活性を低下させ、癌間質の形成を 抑制し、ひいては膵癌の腫瘍形成性を低下させ ることが明らかになった。
③ 大規模化合物ライブラリーから間質標 的治療薬を同定するための評価系の条件設定を おこなった。PSCの特殊な色素でマーキングす ることによってその活性状態を評価できた。こ の評価系により化合物ライブラリーの各化合物 がPSCの活性化に及ぼす影響を今後網羅的に評 価していき、PSC特異的な標的治療薬を同定し ていく。
④ ヒトと類似した間質構造と転移能を持 つ遺伝子改変膵癌自然発生モデルマウスを用い て、既存の抗癌剤との併用治療実験を行い、そ の臓器特異的転移抑制効果を検証するために、
変異k-rasを導入したマウス、変異ｐ５３を導入
したマウス,Tgf-betaRノックアウトマウスおよ びCreマウスを輸入して、繁殖し、それぞれかけ あわせることにより膵癌自然発生マウスを作成 した。k-ras/creマウス(KCマウス)もセルレインの 継続投与により慢性膵炎の状態を維持すると膵 癌の前癌病変であるPanIN病変を認め、一部のマ ウスで肝転移や肺転移を含む遠隔転移を伴う膵 癌が発生した。一方、k-ras/p53/creマウス(KPC マウス)ではセルレインの投与なしに肝転移を 伴う自然発生膵癌が発生することが確認できた。
これらの転移腫瘍部位でもHE染色での観察に よると癌細胞周辺にdesmoplasiaが誘導されてい ることが確認できた。
以上の成果により、現在進めている人工ウイル スの標的化および 内封する薬剤の候補として
既存のマーカーや薬剤に並んで新規の分子や薬 剤を追加できた。これまでに我々は、厚生労働 省科学研究費の支援のもと古細菌が作るsmall heat shock protein(Mj285)を用いて容易に改変 可能な被殻をもち、細胞内プロテアーゼによる 脱殻機能を備えた細胞選択性の高い薬剤輸送に 適した独自の人工ウイルス粒子作成に成功して おり、本研究においてはこれを基盤技術として 用いて人工ウイルスの改変をおこなっている。
C.考 察
今後、今回開発した改変人工ウイルスに新た に同定した標的用マーカーに特異的な抗体、ペ プチドを用いて更なる特異性を向上させ、本研 究成果である治療薬の一つを内封した新規のD DSの効果を今回導入した自然発生マウスを用 いて評価していく予定である
D.健康危険情報
なし
E.研究発表
〔学会発表〕（計 9 件）
① 赤川進、大内田研宙、大塚隆生、寅田信博、
江口大樹、藤原謙次、小薗真吾、崔林、池 永直樹、水元一博、田中雅夫 腹膜繊維芽細 胞の作用に着目した膵癌腹膜藩種メカニズ ムの解明 第113回日本外科学会定期学術集 会 2013/4/11-13
② 崔林、大内田研宙、鄭彪、趙茗、小薗真吾、
寅田信博、植木隆、水元一博、田中雅夫 大 腸癌および組織由来繊維芽細胞のがん関連 遺伝子の発現解析 第113回日本外科学会定 期学術集会 2013/4/11-13
③ 江口大樹、大内田研宙、小薗真吾、崔林、
藤原謙次、趙茗、赤川進、寅田信博、Cases
Ana Ines、大塚隆生、上田純二、高畑俊一、
水元一博、田中雅夫 膵癌の遠隔転移に関与 す る 新 規 遺 伝 子 MAL2(myelin and lymphocyte protein2)の同定 第113回日本外 科学会定期学術集会 2013/4/11-13
④ 小薗真吾、大内田研宙、進藤幸治、江口大 樹、藤原謙次、趙茗、崔林、高畑俊一、水 元一博、田中雅夫 膵癌におけるNodal発現 の特徴とその臨床的意義 第113回日本外科 学会定期学術集会 2013/4/11-13
⑤ 藤原謙次、大内田研宙、進藤幸治、赤川進、
江口大樹、小薗真吾、崔林、大塚隆生、高 畑俊一、相島慎一、水元一博、田中雅夫 Ｃ Ｄ166陰性膵癌細胞は強い浸潤能・遊走能を 有する 第113回日本外科学会定期学術集会 2013/4/11-13
⑥ 趙茗、大内田研宙、鄭彪、崔林、小薗真吾、
江 口 大 樹 、 水 元 一 博 、 田 中 雅 夫 The investigation of CD146 in pancreatic cancer associated fibroblast 第 113 回日本外科学会 定期学術集会 2013/4/11-13
⑦ 佐田政史、大内田研宙、藤原謙次、赤川進、
江口大樹、小薗真吾、趙茗、崔林、大塚隆
生、水元一博、田中雅夫 膵癌間質における CD90とα-SMA発現の意義第113回日本外 科学会定期学術集会 2013/4/11-13
⑧ 田中友晴、小薗真吾、佐田政史、堀岡宏平、
赤川進、江口大樹、藤原謙次、大内田研宙、
水元一博、田中雅夫 膵癌細胞株における Histon deacetylase1の放射線耐性に関する評 価 第 113 回 日 本 外 科 学 会 定 期 学 術 集 会 2013/4/11-13
⑨ 寅田信博、赤川進、崔林、大内田研宙、小 薗真吾、水元一博、相島慎一、小田義直、
田中雅夫高品質かつ簡便な凍結組織アレイ 作製法-手術切除組織を効率よく保存する 保存組織タブレット法を活用して- 第 113 回日本外科学会定期学術集会 2013/4/11-13
〔雑誌/論文発表〕 (計 15 件)
1. Kohei Nakata, Kenoki Ohuchida, Kazuhiro Mizumoto, Taiki Moriyama, Eishi Nagai, and Masao Tanaka MicroRNA-373 is down-regulated in pancreatic cancer and represses cancer cell invasion via induction of mesenchymal-epithelial transition, Annals of Surgical Oncology, in press
2. Shin Akagawa, Kenoki Ohuchida*, Nobuhiro Torata, Masami Hattori, Daiki Eguchi, Kenji Fujiwara, Shingo Kozono, Lin Cui, Naoki Ikenaga, Takao Ohtsuka, Shinichi Aishima, Kazuhiro Mizumoto, Yoshinao Oda, Masao Tanaka Peritoneal Myofibroblasts at Metastatic Foci Promote Dissemination of Pancreatic Cancer, International Journal of Oncology, in press
3. Yoshinori Fujimura, Naoki Ikenaga, Kenoki
Ohuchida, Daiki Setoyama, Miho Irie, Daisuke Miura, Hiroyuki Wariishi, Masaharu Murata, Kazuhiro Mizumoto, Makoto Hashizume and Masao Tanaka Mass Spectrometry-based Metabolic Profiling of Gemcitabine-sensitive and Gemcitabine-resistant Pancreatic Cancer Cells, Pancreas, in press
4. Tadashi Kayashima, Masafumi Nakamura, Kenoki Ohuchida, Syunichi Takahata, Kohei Nakata, Naoki Ikenaga, Lin Cui , Kazuhiro Mizumoto, Masao Tanaka Impact of ABO blood types on chemosensitivity and prognosis after pancreatectomy for pancreatic cancer, Journal of Cancer Therapy, in press
5. Kenoki Ohuchida, Takao Ohtsuka, Kazuhiro Mizumoto, Makoto Hashizume, and Masao Tanaka, Pancreatic cancer: Clinical significance of biomarkers, Mini review, Gastrointestinal Tumors, 1:33-40, 2014
6. Shindo Koji, Aishima Shinichi, Ohuchida Kenoki, Fujiwara Kenji, Mizumoto Kazuhiro, Tanaka Masao, Oda Yoshinao Fibroblasts expressing podoplanin enhance the tumor progression of invasive ductal carcinoma of pancreas, Molecular Cancer, 12(1):168, 2013 7. Daiki Eguchi, Kenoki Ohuchida*, Shingo
Kozono, Naoki Ikenaga, Koji Shindo, Lin Cui, Kenji Fujiwara, Shin Akagawa, Takao Ohtsuka, Shunichi Takahata, Shoji Tokunaga, Kazuhiro Mizumoto, Masao Tanaka MAL2 expression predicts distant metastasis and short survival in pancreatic cancer, Surgery, 154(3) 573-82, 2013 8. Shingo Kozono, Kenoki Ohuchida*, Takao Ohtsuka, Lin Cui , Daiki Eguchi , Kenji Fujiwara, Ming Zhao, Kazuhiro Mizumoto, Masao Tanaka S100A4 mRNA expression
level is a predictor of radiosensitivity of pancreatic cancer cells, Oncology Reports, 30(4) 1601-8, 2013
9. Kenji Fujiwara, Kenoki Ohuchida*, Takao Ohtsuka, Kazuhiro Mizumoto, Koji Shindo, Naoki Ikenaga, Lin Cui, Shunichi Takahata, Shinichi Aishima, and Masao Tanak Migratory activity of CD105+ pancreatic cancer cells is strongly enhanced by pancreatic stellate cells, Pancreas, 42(8)1283-90, 2013
10. Nobuhiro Torata, Kenoki Ohuchida, Shin Akagawa, Lin Cui, Shingo Kozono, Kazuhiro Mizumoto, Shinichi Aishima, Yoshinao Oda, Masao Tanaka, Tissue Tablet Method: An Efficient Tissue Banking Procedure Applicable to Both Molecular Analysis and Frozen Tissue Microarray, Human Pathology, 45(1) 143-52, 2014
11. Ana Ines Cases, Takao Ohtsuka, Minoru Fujino, Noboru Ideno, Shingo Kozono, Ming Zhao, Kenoki Ohuchida, Shinichi Aishima, Masatoshi Nomura, Yoshinao Oda, Kazuhiro Mizumoto, Masao Tanaka Expression of Glucagon–Like Peptide 1 Receptor and Its Effects on Biological Behavior in Pancreatic Neuroendocrine Tumors, Pancreas, 43(1) 1-6, 2014
12. Riki Toita, Masaharu Murata, Kana Abe, Sayoko Narahara, Jing Shu Piao, Jeong-Hun Kang, Kenoki Ohuchida, Makoto Hashizume Biological evaluation of protein nanocapsules containing doxorubicin, International Journal of Nanomedicine, 8:1989-1999, 2013
13. Shingo Kozono, Kenoki Ohuchida*, Daiki Eguchi, Naoki Ikenaga, Kenji Fujiwara, Ming Zhao, Lin Cui, Koji Shindo, Kazuhiro
Mizumoto, and Masao Tanaka Pirfenidone inhibits desmoplasia of pancreatic cancer by regulating stellate cells. Cancer Research, 73:2345-56, 2013
14. Prawej Mahawithitwong, Kenoki Ohuchida*, Naoki Ikenaga, Hayato Fujita, Ming Zhao, Shingo Kozono, Koji Shindo, Takao Ohtsuka, Shinichi Aishima, Kazuhiro Mizumoto, Masao Tanaka Kindlin-2 expression in peritumoral stroma is associated with poor prognosis in pancreatic ductal adenocarcinoma.
Pancreas,42:663-9, 2013
15. Daiki Eguchi , Naoki Ikenaga , Kenoki Ohuchida*, Shingo Kozono , Lin Cui, Fujiwara Kenji, Koji Shindo, Takao Ohtsuka, Shunichi Takahata, Kazuhiro Mizumoto and Masao Tanaka. Pancreatic stellate cells in hypoxia enhance pancreatic cancer invasiveness via secretion of connective tissue growth factor.
Journal of Surgical Research, 181:225-33, 2013
H.知的財産権の出願・登録状況
1.特許取得 なし
2.実用新案登録 なし
3.その他 なし
