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高活性リポフェクションエンハンサー
関西大学 化学生命工学部 生命・生物工学科
教授 長岡 康夫
動物細胞への遺伝子導入技術により成り立つ研究
遺伝子治療 ノックアウトマウス
RNAi
iPS細胞
遺伝病（4000種類以上）
がん、AIDS、心臓病、糖尿病
遺伝子研究 疾病モデル
医薬品スクリーニング
RNAi
医療への応用 生命科学研究
ES細胞 iPS細胞
再生医療
ヒトや動物の細胞内に外から遺伝子を入れて、それを働かせる技術は 生命科学や先進医療発展の切り札である。
がん細胞 正常ながん抑制遺伝子 正常細胞 ヒトや動物の細胞内に外から遺伝子を入れて、それを働かせる技術は 先進医療発展の切り札である。
がんの遺伝子治療
p53
Bax p21 Gadd45
アポトーシス がん細胞を 自殺させる
DNA修復 細胞周期停止
がん細胞の 増殖を抑える p53
変異して正常に働かない がん抑制因子p53
遺伝子治療により正常に働くようになったp53
iPS細胞の形成 (山中ら）
初期化遺伝子
Sox 2 Oct 4
Klf 4 C-Myc
体細胞
iPS細胞（万能細胞）
iPS 細胞の形成と再生医療への応用の流れ
iPS細胞（万能細胞） iPS細胞から再生した臓器
正電荷脂質
リポフェクション法
正電荷脂質で出来た正電荷ナノ粒子とDNAやRNAの複合体（Lipoplex）はエンドサイ トーシスにより細胞内に取り込まれる。
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リポプレックス
カベオリンやクラ スリンが関与する エンドサイトーシス
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H＋ Cl-
H2O
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エンドソーム内にH+が流入 することで、浸透圧が上昇 し、破裂する。
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エンドソームを形成する。
細胞膜
ウイルスベクターは効率が良いため従来より汎用されてきたが、安全性などに 問題がある。また、抗原性が有り、免疫ができるので、生体への直接投与の場 合、繰り返し使えない。一方、非ウイルスベクターは一般に安全性が高く抗原 性もほとんど無い。しかしながら、遺伝子の導入・発現効率が悪い。
ウイルスベクター
正電荷ナノ粒子 ベクター
遺伝子導入 発現効率
高
低
安全性
低
高
抗原性
有る
ほとんど無い 細胞内への遺伝子の運び屋（ベクター）
－ウイルスベクターと非ウイルスベクターの特性の比較－
ベクター
非ウイルスベクター
これを高くしたい！
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正電荷ナノ粒子（＋） DNA(－）
NP+DNA 複合体 エンドサイ
トーシス
エンドソームの形成 DNA
核内
DNAが転写され働く
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NH2 N NH2
+ +
+
NP(+）
DNA 輸送↑
DNAの転写↑
遺伝子が細胞内に導入されて働くまでの経路
NP
細胞膜
正電荷コレステロール(OH-Chol)
＋ Tween 80
DNAの微小管上での移動
Ondřej V et al. Acta. Biochim. Pol. 54, 2007, 657–663
DNA は輸送タンパク質により微小管の上を運ばれて核に到達する
核 核 核
開始点
DNA 微小管
DNA
開始点 開始点
微小管 輸送タンパク質
DNA ＋
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Deacetylated microtubules
HDAC6
Ac Ac
Ac Ac NH2
NH2 NH2
NH2
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N Ac N
Ac NH2
NH2
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HDAC
核内
HAT
ヒストン脱アセチル化酵素 (HDAC) 阻害剤が DNA の輸送と転写を促進する
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kinesin
dynein
細胞質
Reed, NA et al. Curr. Biol. (2006) Vaughan, EE et al. Mol. Therapy (2009)
Deacetylated histone Complexation with DNA Low transfection efficency
Acetylated histone High
transfection efficency 1
HDAC 阻害剤
ヒストン脱アセチル化酵素（ HDAC)
HDACはヒストンアセチル転移酵素（HAT)とともにタンパク質のリシン側鎖の アセチル化の度合いを調節して、そのタンパク質の機能を制御する。
histone
NH3
Lys histone
Lys NH + Ac
HAT HDAC ヒストン
ヒストン以外の
タンパク質 DNAの転写 DNAの転写
HDAC 阻害剤を作用させるとタンパク質のアセチル化が亢進する。
タンパク質
NH3 Lys
タンパク質
Lys NH + HAT Ac
HDAC
HDAC阻害剤
Chemical & Engineering News Zn2+
Vorinostat (SAHA) eN-Ac-Lys
Zn2+
HDAC阻害剤
HDACの基質
HDAC阻害剤はHDACの酵素活性ポケットに結合し アセチル化リシン側鎖の脱アセチル化を拮抗阻害する。
亜鉛結合部位
HDAC 阻害の機構
HDAC 1 2 3 8 4 5 7 9 6 10 11
Sirt 1 2 3 4 5 6 7 Class I
(Nucleus)
Class IIa
(Nucleus/Cytoplasm)
Class IIb (Cytoplasm)
Class IV
(Nucleus/Cytoplasm)
Zn+2-independent NAD-dependent Thiol (Depsipeptide
Benzamide (MS-275)
Carboxylic acid (Valproic acid, Butylate) Hydroxamate (Trichostatin A, Vorinostat)
Tubacin 亜鉛結合部位のバリエーションとHDACアイソザイム選択性
Nicotinamide Class III
HDAC 阻害剤
＋正電荷ナノ粒子
＝高性能ベクター
我々が開発したHDAC阻害剤 正電荷コレステロール(OH-Chol)
＋ Tween 80 HDAC阻害剤プロドラッグ
脂肪鎖 生分解性リンカー
正電荷ナノ粒子に混ぜられるように、
HDAC阻害剤に生分解性リンカーを介 して脂肪鎖を化学結合させた。
HDAC阻害剤
細胞内に入ると、分解してHDAC阻害剤 が遊離する。
今回合成したHDAC阻害剤プロドラッグ
OH-Chol + Tween 80 K-182-DD
約 100 nm 1 mg/ml ナノ粒子」
水懸濁液
(界面活性剤)
+
エタノールに溶解する
HDAC 阻害剤が含まれるナノ粒子の形成
(85) (5) (10)
濃縮
水を加える
（HDAC阻害剤プロドラッグ）
ナノ粒子
DNA －ナノ粒子複合体 （ nanoplex)
ルシフェラーゼ遺伝子をコードした、プラスミドDNA
今回開発した新規ベクターは従来法より２から4倍程度、遺伝子発現効率の上昇させた
ヒト前立腺がん細胞 ヒト乳がん細胞
従来法の値 従来法の値
今回の値 今回の値
細胞
ルシフェラーゼ遺伝子
ルシフェリン
ホタルの発光の原理を応用した方法
鋭意改良を加え新エンハンサー K004 と K005 を開発した。
K004 は Lipofectamine2000 による遺伝子発現量を 約 9 倍に向上した。
K005 では Lipofectamine2000 による遺伝子発現量を
23 倍以上に向上することに成功した。
改良版エンハンサーＫ００４の結果
K004を入れなかった場合を100％としたときの値 0.5 mM K004
様々なトランスフェクション試薬に対するＫ００４の効果
ＨＣＴ１１６細胞を 使った時の結果 ルシフェラーゼアッ セイによる評価
既存のエンハンサー（ＰＬＵＳ Ｒｅａｇｅｎｔ）との比較と併用 改良版エンハンサーＫ００４の結果
Lipofectamine2000 のみの時
PLUS Reagent を加えた場合
PLUS Reagent
＋0.5 mM Ｋ００４
ＳｋＢｒ３細胞を使った時の結果 ルシフェラーゼアッセイによる評価
HCT116細胞での結果
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500
0 0.5 1 2 4
Relative luciferase activity (%)
新エンハンサー（µM）
CHO-K1細胞での結果
Lipofectamine2000 ＋新エンハンサーＫ００５の効果
0 500 1000 1500 2000 2500
0 0.5 1 2 4
Relative luciferase activity (%)
新エンハンサー (μM)
23倍 28倍
Lipofectamine2000 のみの時
新エンハンサー を入れた時
Lipofectamine2000 のみの時
新エンハンサー を入れた時
ルシフェラーゼアッセイの結果 Ｋ００４をさらに改良したエンハンサーＫ００５の結果
