博士論文 ラット消化管における Toll-like receptor を介した 常在細菌の認識機構に関する研究 平成 25 年 7 月 神戸大学大学院農学研究科 万谷洋平

Kobe University Repository : Thesis

学位論文題目

Title ラット消化管におけるToll-like receptorを介した常在細菌の認識機構に関する研究 氏名 Author 万谷, 洋平 専攻分野 Degree 博士（農学） 学位授与の日付 Date of Degree 2013-09-25 公開日 Date of Publication 2014-09-01 資源タイプ

Resource Type Thesis or Dissertation / 学位論文 報告番号 Report Number 甲第5923号 権利 Rights JaLCDOI URL http://www.lib.kobe-u.ac.jp/handle_kernel/D1005923 ※当コンテンツは神戸大学の学術成果です。無断複製・不正使用等を禁じます。著作権法で認められている範囲内で、適切にご利用ください。 PDF issue: 2018-10-18

博 士 論 文

ラット消 化 管 における Toll-like receptor を介した

常 在 細 菌 の認 識 機 構 に関 する研 究

平 成 25 年 7 月

神 戸 大 学 大 学 院 農 学 研 究 科

万 谷 洋 平

本論文の第Ⅰ章の付図等は学術誌「Histology and Histopathology」に， 第Ⅱ及びⅢ章の付図等は「社団法人日本獣医学会」に帰属する。

目 次

総 緒 1

第 I章 ラ ッ ト 小 腸 の 粘 膜 上 皮 に お け る 膜 型 Toll-like receptor の 発 現 9 I-1 ． 小 緒 10 I-2 ．材 料 お よ び 方 法 1 2 1） 供 試 動 物 お よ び 飼 育 法 12 2） 材 料 採 取 お よ び 組 織 学 的 処 理 12 3） 免 疫 組 織 化 学 的 染 色 13 4） 計 量 組 織 学 的 観 察 法 13 I-3 ． 結 果 15 1） 十 二 指 腸 粘 膜 に お け る 各 種 TLR の 発 現 15 2） 空 腸 粘 膜 に お け る 各 種 TLR の 発 現 1 6 3） 回 腸 粘 膜 に お け る 各 種 TLR の 発 現 1 7 I-4 ． 考 察 20 1. 十 二 指 腸 に お け る T L R 発 現 の 意 義 に つ い て 2 0 2. 空 回 腸 に お け る T L R 発 現 の 意 義 に つ い て 2 0 3. TLR -4 陽 性 の 顆 粒 状 物 質 に つ い て 22 I-5 ． 小 括 24 第 II章 ラ ッ ト の 消 化 管 付 属 外 分 泌 腺 か ら の 分 泌 型 Toll-like receptor の 分 泌 25 II-1．小 緒 26 II-2．材 料 お よ び 方 法 28 1） 供 試 動 物 お よ び 飼 育 法 28 2） 材 料 採 取 お よ び 組 織 学 的 処 理 28 3） 免 疫 組 織 化 学 的 染 色 29 4） グ ラ ム 染 色 法 29 5） グ ラ ム 陽 性 お よ び 陰 性 菌 の コ ロ ニ ー 数 の 定 量 組 織 学 的 観 察 法 30 6） 統 計 学 的 解 析 法 30

II-3．結 果 31 1） 耳 下 腺 に お け る 各 種 T LR の 分 布 31 2） 下 顎 腺 に お け る 各 種 T LR の 分 布 32 3） 舌 下 腺 に お け る 各 種 T LR の 分 布 32 4） 味 腺 に お け る 各 種 TLR の 分 布 3 3 5） 後 舌 腺 に お け る 各 種 T LR の 分 布 33 6） 眼 窩 外 涙 腺 に お け る 各 種 T LR の 分 布 33 7） ハ ー ダ ー 腺 に お け る 各 種 T LR の 分 布 34 8） 胃 底 腺 に お け る 各 種 T LR の 分 布 34 9） 胃 表 面 上 皮 細 胞 に お け る 各 種 TLR の 分 布 35 10） 膵 臓 に お け る 各 種 TLR の 分 布 35 11 ） 十 二 指 腸 腺 に お け る 各 種 TLR の 分 布 36 12） 肝 臓 に お け る 各 種 TLR の 分 布 36 13） 小 腸 腸 陰 窩 に お け る 各 種 TLR の 分 布 37 14） 大 腸 腸 陰 窩 に お け る 各 種 TLR の 分 布 38 15 ） 回 腸 の 腸 絨 毛 間 隙 に お け る グ ラ ム 陽 性 / 陰 性 菌 の 分 布 38 II-4．考 察 39 1. TLR を 分 泌 す る 消 化 管 付 属 分 泌 腺 に つ い て 39 2. 前 位 消 化 管 に お け る TLR の 分 泌 の 意 義 に つ い て 39 3. 小 腸 に お け る T LR の 分 泌 の 意 義 に つ い て 40 4. 大 腸 腸 陰 窩 に お け る T LR 分 泌 の 意 義 に つ い て 42 5. 肝 臓 に お け る TLR -4 陽 性 顆 粒 状 物 質 に つ い て 4 4 II-5．小 括 46 第 III章 ラ ッ ト 上 行 結 腸 に お け る 常 在 細 菌 の 増 殖 制 御 機 構 に 関 す る 定 量 組 織 学 的 観 察 49 III-1 ． 小 緒 50 III-2．材 料 と 方 法 52 1） 供 試 動 物 お よ び 飼 育 法 52 2） 材 料 採 取 お よ び 組 織 学 的 処 理 52 3） 免 疫 組 織 化 学 的 染 色 52 4） 組 織 構 成 要 素 の 定 義 53 5） 定 量 組 織 学 的 観 察 法 53 6） 統 計 処 理 54 III-3 ． 結 果 56 1）肉 眼 解 剖 学 的 所 見 56

2）一 般 組 織 学 的 所 見 5 6 3） 腸 陰 窩 内 に お け る 上 皮 細 胞 数 56 4） 腸 陰 窩 内 に お け る PCNA 陽 性 上 皮 細 胞 数 57 5） 粘 膜 上 皮 に お け る 各 種 TLR の 局 在 5 8 III-4 ． 考 察 59 1. 常 在 細 菌 の 定 着 と 上 皮 細 胞 に お け る TLR の 発 現 と の 関 係 に つ い て 59 2. 常 在 細 菌 の 腸 陰 窩 内 で の 増 殖 と 上 皮 細 胞 の 増 殖 と の 関 係 に つ い て 59 III-5 ． 小 括 62 総 括 64 Abs t ract 68 謝 辞 73 引 用 文 献 74 付 図 お よ び 付 図 説 明 87

総 緒

動 物 と 細 菌 の 進 化 の 過 程 で ， 両 者 は 長 い 時 間 を か け て 共 生 関 係 を 築 い て き た 。 な か で も 動 物 の 消 化 管 に 定 着 す る 常 在 細 菌 は 刺 胞 動 物 門 か ら 脊 椎 動 物 門 に 至 る 進 化 の 過 程 で そ れ ぞ れ の 宿 主 の 食 環 境 等 に 適 応 し な が ら 共 生 関 係 を 維 持 し て き た 。 動 物 の 消 化 管 に 生 息 す る 常 在 細 菌 に よ る ， 宿 主 に と っ て 有 益 な 機 能 と し て ， 宿 主 由 来 の 消 化 酵 素 で は 消 化 さ れ な い 食 物 成 分 お よ び 食 物 に 含 ま れ る 毒 物 の 分 解 や 食 物 中 に 含 ま れ な い 物 質 の 合 成 ， す な わ ち ビ タ ミ ン の 合 成 [Berg, 1996]，短 鎖 脂 肪 酸 の 合 成 ，胆 汁 酸 の 分 解 [Hill and Draser, 1975] お よ び シ ュ ウ 酸 の 分 解 等 が あ げ ら れ る [Duncan et al., 2002]。一 方 ，こ れ ら の 常 在 細 菌 に 対 す る ゼ ブ ラ フ ィ ッ シ ュ の 消 化 管 粘 膜 の 応 答 に 関 連 し た 遺 伝 子 発 現 が 哺 乳 綱 の マ ウ ス の そ れ と 非 常 に 類 似 す る こ と か ら ， 宿 主 に よ る 常 在 細 菌 の 定 着 制 御 に は 進 化 の 過 程 で 保 存 さ れ て き た 基 本 的 な 宿 主 側 の 応 答 機 構 が 存 在 す る 可 能 性 が 想 定 さ れ て い る [Rawls et al., 2004]。 哺 乳 綱 動 物 の 消 化 管 内 に お け る 常 在 細 菌 の 定 着 は ， 出 生 後 す ぐ に 母 親 由 来 の 細 菌 に よ っ て 始 ま り ， 成 体 に な る と 生 理 学 的 条 件 下 に お け る 常 在 細 菌 の 組 成 お よ び 数 が ほ ぼ 一 定 に 保 た れ [Bourlioux et al., 2003]，最 終 的 に 成 人 で は 消 化 管 内 に 定 着 す る 常 在 細 菌 量 は 2 kg に 及 ぶ と さ れ て い る [Fraune and Bosch, 2010] 。消 化 管 内 腔 に 生 息 す る 常 在 細 菌 の 総 数 や 菌 種 構 成 は ， 宿 主 側 な い し 常 在 細 菌 自 体 に よ る 様 々 な 因 子 に よ っ て 一 定 に 保 た れ て い る 。 す な わ ち ， 免 疫 応 答 を 主 体 と す る 特 異 的 防 御 機 構 に 加 え て 免 疫 応 答 に 依 ら な い 非 特 異 的 防 御 機 構 が 常 在 細 菌 の 制 御 に 関 わ る と さ れ る [Batt et al. , 1996] 。 特 異 的 生 体 防 御 機 構 に は ， 複 数 の 抗 原 に 対 し て 結 合 能 を も ち ， 免 疫 応 答 を 介 さ ず に 分 泌 さ れ る 自 然 抗 体 と 腸 管 粘 膜 に 備 わ る 消

化 管 付 属 リ ン パ 組 織 (GALT)の 免 疫 担 当 細 胞 に よ る 応 答 を 介 し た 免 疫 応 答 が 存 在 す る 。 す な わ ち ， 消 化 管 内 腔 に は 唾 液 中 に 含 ま れ る IgM や IgA ク ラ ス の 自 然 抗 体 が 存 在 し ， 常 在 細 菌 の 定 着 を 制 御 し て い る と さ れ る [Mest eck y et al ., 1999; Quan et al., 1997] 。 一 方 ， GALT で は ， 代 表 的 な リ ン パ 組 織 で あ る パ イ エ ル 板 の 濾 胞 被 蓋 上 皮 （ FAE） に 存 在 す る 特 殊 な M 細 胞 が 腸 管 内 腔 の 抗 原 を 取 り 込 ん だ 後 ， プ ロ セ ッ シ ン グ を お こ な わ ず に 同 上 皮 下 の 樹 状 細 胞 等 に 抗 原 情 報 を 受 け 渡 し ， 一 連 の 免 疫 応 答 を 誘 導 す る [Owen et al., 1986]。GALT を 介 し た 免 疫 応 答 は 最 終 的 に 粘 膜 固 有 層 内 に 存 在 す る 形 質 細 胞 か ら の 各 種 免 疫 グ ロ ブ リ ン の 分 泌 や 細 胞 性 免 疫 応 答 で 完 結 す る と さ れ て い る [Ottaway et al., 1979; Tomasi et al., 1980]。こ の た め ， ヒ ト の 消 化 管 内 や 糞 中 の 細 菌 は IgA に 覆 わ れ て お り [Brandtzaeg et al., 1968; Van der Waaij et al. ,1996] ， こ の IgA が 細 菌 の 上 皮 細 胞 へ の 接 着 を 妨 げ る と さ れ て い る [Williams and Gibbons, 1972]。 こ の よ う に ， 特 異 的 生 体 防 御 を 介 し た 常 在 細 菌 の 定 着 制 御 で は ， 自 然 抗 体 の 分 泌 に 加 え て 腸 管 内 腔 に 存 在 す る 常 在 細 菌 由 来 の 抗 原 に 対 す る 免 疫 応 答 を 誘 導 す る こ と に よ っ て ， 常 在 細 菌 の 上 皮 へ の 接 着 や 抗 原 の 生 体 内 へ の 侵 入 を 防 い で い る と さ れ る 。 一 方 ， 消 化 管 内 腔 か ら 取 り 込 ま れ た 抗 原 に 対 し て は ， 粘 膜 以 外 の 組 織 で は ， 細 胞 性 免 疫 応 答 や 液 性 免 疫 応 答 が 抑 制 さ れ る ， い わ ゆ る 経 口 免 疫 寛 容 が 誘 導 さ れ る [Weiner, 1997]。 例 え ば ， カ サ 貝 の ヘ モ シ ア ニ ン を 経 口 的 に 動 物 に 摂 食 さ せ る と ， 同 抗 原 を 皮 下 投 与 し た 場 合 に 遅 延 型 過 敏 反 応 が 抑 制 さ れ る と い う 例 の よ う に [Husby et al., 1994]， 腸 管 内 腔 の 抗 原 に 対 し て は 粘 膜 内 で 免 疫 応 答 が 誘 導 さ れ る が ， 粘 膜 以 外 の 部 位 で は 免 疫 寛 容 が 成 立 さ れ ， 生 体 組 織 内 で 過 剰 な 免 疫 応 答 を 防 ぐ と い う 非 常 に 複 雑 な 特 異 的 生 体 防 御 が お こ な わ れ て い る 。 消 化 管 内 に お け る 常 在 細 菌 の 定 着 制 御 に 関 わ る 非 特 異 的 生 体 防 御 と し て ， 下 記 の 防 御 応 答 が あ る 。 す な わ ち ， 消 化 管 の 全 長 に わ た っ て 粘 膜 上

皮 の 表 面 に は 物 理 的 な 障 壁 と し て 働 く 粘 液 層 が 存 在 し て お り [Pearson and Brownl ee, 2005] ，特 に マ ウ ス や ラ ッ ト の 後 位 の 消 化 管 で は 二 層 の 粘 液 層 が 厚 く 発 達 し て い る [Atuma et al., 2001; Johansson et al., 2008, 2011]。 す な わ ち ， マ ウ ス の 結 腸 で は ， 二 層 に 分 か れ た 粘 液 層 の う ち ， 常 在 細 菌 が 内 側 の 層 に み と め ら れ な い こ と か ら ， こ れ ら の 粘 液 層 が 細 菌 に 対 す る 物 理 的 な 防 御 層 と し て 機 能 し て い る と 考 え ら れ て い る [Johansson et al., 2008, 2011] 。 ま た ， 粘 膜 上 皮 細 胞 の す ば や い 細 胞 交 代 も 細 菌 に 対 す る 重 要 な 生 体 防 御 で あ る と 考 え ら れ て い る [Pearson and Brownlee, 2005] 。 す な わ ち ， 動 物 の 消 化 管 に お け る 細 胞 交 代 に 関 し て は ， マ ウ ス [Gordon, 1989] ， ラ ッ ト [Qi et al., 2009a, b]， ウ サ ギ [Takeuchi and Gonda, 2004] お よ び ニ ワ ト リ [Spielvogel et al., 1972; Takeuchi et al., 1998, 1999] 等 様 々 な 動 物 種 に お い て 研 究 さ れ て き て お り ， 腸 陰 窩 で 産 生 さ れ た 上 皮 細 胞 が 粘 膜 表 面 で 脱 落 す る ま で の 細 胞 寿 命 は ， マ ウ ス の 十 二 指 腸 で 3.3 日 ， 空 腸 で 3.4 日 ，ラ ッ ト の 十 二 指 腸 ， 空 腸 お よ び 回 腸 で 1.5 日 ， 近 位 結 腸 で 1.3-1.8 日 ， 中 位 結 腸 で 1.4 日 ， ニ ワ ト リ の 盲 腸 で 4-5 日 ， ウ サ ギ の 小 腸 で 5-6 日 ， 近 位 結 腸 で は 4.6 日 で あ る [Cheng and Leblond, 1974; Grant and Specian, 2001; Qi et

al., 2009a, b; Takeuchi and Gonda, 2004] 。 他 臓 器 と の 比 較 で は ， ラ ッ ト の

表 皮 で 19.1 日 [Storey and Leblond, 195 1]， 口 腔 粘 膜 上 皮 で 14 日 [Trott and Gorenst ein, 1963] ， 胃 粘 膜 上 皮 で 3 日 [ Stevens and Lebl ond, 1953] ， 気 管 粘 膜 上 皮 で 33 ～ 83 日 [Blenkinsopp, 1967] ， 肺 粘 膜 上 皮 で 8.1 ～ 29.4 日 [Bert al anff y and Leblond, 1953 ] ， 膀 胱 粘 膜 上 皮 で 33～ 64 日 [ Lebl ond et al. , 1955; Lebl ond and Walker, 1956 ] お よ び 精 巣 の 精 細 管 で 16 日 [Roos en -Runge, 1951] で あ る こ と か ら ， 他 臓 器 に 比 べ て 腸 管 の 上 皮 細 胞 の 細 胞 交 代 が 著 し く 速 い こ と が 分 か る 。 一 方 ， 化 学 的 な 障 壁 と し て は 消 化 管 内 腔 に 分 泌 さ れ る 消 化 酵 素 や 抗 菌 物 質 等 が あ げ ら れ [Batt et al., 1996; Pearson and

2011b]， マ ウ ス [Aya be et al ., 2000, 2002 , 2004]， ア カ ゲ ザ ル [Tanabe et al. , 2004]， ヒ ツ ジ [M e yerholz et al., 2004] ， ニ ワ ト リ [Van Dijk et al., 2007] や ゼ ブ ラ フ ィ ッ シ ュ [Oehlers et al., 2011]等 の 多 く の 動 物 で 研 究 さ れ て い る 。消 化 管 内 に 分 泌 さ れ る 抗 菌 物 質 と し て ， 細 菌 の 細 胞 壁 に 含 ま れ る peptidogl ycan の N-acet ylmurami c acid と N-acet yl gl ucos am ine 間 の 結 合 を 分 解 す る lysozyme ， 細 菌 の 細 胞 膜 を 分 解 す る secretory phospholipase A2 (sP LA2)， 細 菌 の 細 胞 質 膜 に 陰 イ オ ン 伝 導 性 チ ャ ネ ル を 形 成 す る こ と に よ っ て 細 菌 の 細 胞 質 膜 を 脱 分 極 さ せ る α お よ び β-defensin，細 菌 の 鉄 代 謝 を 阻 害 す る lactoferrin ， お よ び 複 雑 な 過 程 を 経 て 殺 菌 因 子 と し て 働 く com plem ent component 等 が あ げ ら れ る [ Ahrenst edt et al., 1990; Andoh et al. , 1997; C all ewaert and Mich i el s, 2010; C ol e and Ganz, 2005; Fujita et al ., 2002] 。

前 記 の 非 特 異 的 生 体 防 御 が 常 在 細 菌 の 制 御 に 関 与 す る 根 拠 と な る 事 象 が 数 多 く 報 告 さ れ て き て い る 。 す な わ ち ， 通 常 飼 育 の ラ ッ ト の 腸 管 か ら 分 泌 さ れ る 粘 液 は 無 菌 ラ ッ ト の に 比 べ て 中 性 ム チ ン が 多 く 含 ま れ て お り ， 酸 性 ム チ ン が 少 な い こ と に 加 え て [Meslin et al., 1999; Sharma and Schum acher, 1995] ，常 在 細 菌 数 が 著 し く 多 く な る 結 腸 の 腸 表 面 上 皮 細 胞 を 覆 う 粘 液 層 が 厚 く ， 腸 陰 窩 に お け る 細 胞 増 殖 も ま た 高 頻 度 で あ る こ と や [Alam et al ., 1994; Szentkuti et al. , 1990] ， 無 菌 ラ ッ ト に 常 在 細 菌 な い し lipopol ys acchari de（ LPS ） を 経 口 投 与 す る と 杯 細 胞 数 の 増 加 や 粘 液 中 の 中 性 ム チ ン の 割 合 が 増 加 す る こ と が 報 告 さ れ て い る [Enss et al., 1996; Sharma et al., 1995] 。 さ ら に ， 消 化 管 全 長 に お け る 常 在 細 菌 の 優 先 的 な 接 着 部 位 が ア ポ ト ー シ ス 後 期 の 上 皮 細 胞 の 脱 落 部 位 で あ り [Yamamoto et al., 2010] ， 小 腸 で は 常 在 細 菌 の 接 着 し た 上 皮 細 胞 が 細 胞 骨 格 タ ン パ ク 質 を 再 構 成 す る こ と に よ っ て 常 在 細 菌 の 接 着 部 位 に 4 層 の 防 御 層 を 形 成 し ， 細 菌 を 物 理 的 に 排 除 す る こ と が 明 ら か に さ れ て い る [Inamoto et al., 2008a, b]。ま た ，腸 絨 毛 の 先 端 を 起 点 と し て 常 在 細 菌 が 腸 絨 毛 の 表 面 を 腸 陰 窩 に

向 か っ て 増 殖 す る と ， 上 皮 細 胞 の 一 過 性 の 脱 落 亢 進 に 起 因 す る と 考 え ら れ る 腸 絨 毛 の 丈 の 減 少 に 加 え て ， 上 皮 細 胞 の 移 動 速 度 が 速 く な り ， 常 在 細 菌 の 増 殖 範 囲 が 腸 絨 毛 間 隙 の 深 部 に ま で 及 ぶ と ， 腸 陰 窩 の 底 部 に 存 在 す る パ ネ ー ト 細 胞 か ら lysozyme や sPLA2 等 の 抗 菌 物 質 が 一 過 性 に 分 泌 さ れ る こ と が 明 ら か に さ れ て い る [Qi et al., 2009a, b; Yokoo et al., 2011a, b]。 こ の よ う に 粘 膜 表 面 に お け る 常 在 細 菌 の 増 殖 に 対 し て 上 皮 細 胞 が 様 々 な 応 答 を 起 し て い る こ と か ら ， 粘 膜 上 皮 の 表 面 に は 常 在 細 菌 を 認 識 す る 受 容 体 の 存 在 が 想 定 さ れ て い る が [Inamoto et al., 2008a, b; Qi et al., 2009a]， こ の 受 容 体 に 関 し て は in vivo で は 未 だ 明 ら か に さ れ て い な い 。

近 年 ， 細 菌 や ウ イ ル ス の 構 成 成 分 で あ る 病 原 体 関 連 分 子 パ タ ー ン (PAMPs ) を 認 識 す る 受 容 体 と し て Toll -l ike receptor (TLR ) が 注 目 さ れ て い る [Akira et al., 2006; Gleeson et al., 2006; Netea et al., 2006]。こ の TLR は ， 元 来 シ ョ ウ ジ ョ ウ バ エ に お い て 発 見 さ れ た Toll と 呼 ば れ る 受 容 体 に 相 同 な タ ン パ ク 質 と し て 発 見 さ れ た 。 TLR 遺 伝 子 は 海 綿 動 物 門 の 動 物 や 刺 胞 動 物 門 の イ ソ ギ ン チ ャ ク に 存 在 し て い る こ と か ら [Miller et al., 2007; Wiens et al., 2007]， T LR 遺 伝 子 の 起 源 は 後 生 動 物 の 祖 先 に ま で 遡 る と さ れ て い る [Leulier and Lemaitre, 2008]。シ ョ ウ ジ ョ ウ バ エ に お け る Toll は ， 初 期 発 生 に お け る 背 腹 パ タ ー ン の 決 定 に 関 わ る 受 容 体 と し て 発 見 さ れ た が [Anderson et al., 1985]，菌 類 に 対 す る 生 体 防 御 に お い て も 重 要 な 役 割 を 演 じ ， Toll と リ ガ ン ド と の 結 合 に よ っ て 抗 菌 類 物 質 で あ る drosomycin の 産 生 を 誘 導 す る と さ れ る [Lemaitre et al., 1996]。進 化 の 過 程 で 特 に TLR が 重 要 視 さ れ て い る 動 物 は ， 棘 皮 動 物 門 の ウ ニ と 頭 索 動 物 門 の ナ メ ク ジ ウ オ で あ り ， ウ ニ の DNA か ら は 222 種 類 ， ナ メ ク ジ ウ オ の DNA か ら は 42 種 類 の TLR 遺 伝 子 が 見 つ か っ て い る [Hibino et al., 2006; Pancer and Cooper, 2006; Rast et al ., 2006] 。こ れ ら の 動 物 で は 高 度 な 病 原 体 認 識 シ ス テ ム が 必 要 で あ る に も か か わ ら ず 獲 得 免 疫 が 発 達 し て い な い こ と か ら ， こ れ を 補

う た め に 爆 発 的 な TLR 遺 伝 子 の レ パ ー ト リ ー の 拡 大 が 起 こ っ た と 考 え ら れ て い る [Leulier and Lemaitre, 2008]。 獲 得 免 疫 や 補 体 系 の 発 達 に 伴 い ， TLR 遺 伝 子 の レ パ ー ト リ ー の 拡 大 は み と め ら れ な く な る が ， 獲 得 免 疫 の 発 達 し た 脊 椎 動 物 門 の TLR は 自 然 免 疫 に 関 わ る だ け で な く ， 獲 得 免 疫 を 誘 導 す る 上 で も 重 要 な 機 能 を 有 す る こ と が 知 ら れ て い る [Iwasaki and Medzhi tov, 2004 ]。 こ の よ う に ， T LR は 生 命 の 進 化 の 過 程 で 高 度 に 保 存 さ れ て き た タ ン パ ク 質 で あ り ， 動 物 の 種 間 差 を 超 え て 病 原 体 の 認 識 に 関 わ る 基 本 的 な 受 容 体 で あ る と 考 え ら れ る 。 哺 乳 綱 の 動 物 で は 13 種 類 の TLR が 報 告 さ れ て お り ，こ の う ち ，細 菌 の 構 成 成 分 を 認 識 す る TLR に 関 し て は ， TLR-2 が 細 菌 の 細 胞 壁 に 含 ま れ る peptidogl ycan ， lipoprot ei n お よ び lipot ei choi c acid 等 を ， TLR -4 が グ ラ ム 陰 性 菌 の 細 胞 壁 に 含 ま れ る LPS を ， TLR-5 が 細 菌 の 鞭 毛 に 含 ま れ る flagellin を ， ま た TLR -9 が 細 菌 の DNA に 含 ま れ る 非 メ チ ル 化 CpG DNA を 認 識 す る と さ れ る 。 免 疫 担 当 細 胞 に 発 現 し た TLR が そ れ ぞ れ の リ ガ ン ド を 認 識 す る と 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン 等 の 分 泌 を 誘 導 し ， 炎 症 を 惹 起 す る [Akira et al. , 2006; Glees on et al. , 2006; Netea et al. , 2006] 。

TLR は 主 に 樹 状 細 胞 や 大 食 細 胞 等 の 免 疫 担 当 細 胞 に 発 現 す る 受 容 体 と さ れ て い る が [Akira et al., 2006; Gleeson et al., 2006; Netea et al., 2006]，こ れ 以 外 の 細 胞 種 に 関 し て は ， 腸 管 粘 膜 の 上 皮 細 胞 な い し は こ れ に 由 来 す る 細 胞 株 に TLR が 発 現 す る こ と が in vitro や 分 子 生 物 学 的 な 解 析 に よ っ て 明 ら か に さ れ て い る 。 す な わ ち ， ヒ ト 結 腸 由 来 細 胞 株 Caco-2， HT-29 お よ び T84 が TLR-2， -3 お よ び -4 を 発 現 す る こ と ， ヒ ト 結 腸 上 皮 初 代 培 養 細 胞 が TLR-1-9 を 発 現 す る こ と ， マ ウ ス の 小 腸 遠 位 部 と 結 腸 近 位 部 の 上 皮 細 胞 に TLR-1-9 が 発 現 す る こ と ， お よ び ラ ッ ト の 結 腸 の 上 皮 細 胞 に TLR -2-5 お よ び TLR-7-10 が 発 現 す る こ と が 明 ら か に さ れ て い る [Abreu et

Ott e et al ., 2004; R uemm el e et al ., 2002; Terán-Ventura et al . , 2010; Wang et al., 2010] 。 こ の こ と か ら ， T LR が 消 化 管 の 粘 膜 上 皮 に お け る 常 在 細 菌 の 認 識 に 関 与 し て い る 可 能 性 が 想 定 さ れ る 。 し か し な が ら ， こ れ ま で 常 在 細 菌 由 来 の リ ガ ン ド を 検 知 す る 受 容 体 に つ い て は ， TLR を 含 め て in vivo で の 研 究 は な さ れ て い な い 。一 方 ，近 年 PAMPs を 認 識 す る 膜 型 TLR の み な ら ず ， 生 体 組 織 外 の 分 泌 液 等 に 含 ま れ る 分 泌 型 の TLR の 存 在 が 明 ら か に さ れ て き て い る 。 す な わ ち ， 分 泌 型 TLR の 存 在 に 関 し て は ，2000 年 に Iwami ら に よ っ て 初 め て マ ウ ス の 大 食 細 胞 系 列 の 培 養 細 胞 株 R AW293 細 胞 ， マ ウ ス 脾 臓 由 来 の 初 代 培 養 大 食 細 胞 お よ び マ ウ ス T 細 胞 系 列 の 培 養 細 胞 株 CTLL2 お よ び EL4 細 胞 に 分 泌 型 TLR-4 が 発 現 す る こ と が 明 ら か に さ れ た 。 そ の 後 ， 魚 綱 の ヒ ラ メ ， フ グ お よ び ニ ジ マ ス に お け る TLR-5 や 鳥 綱 の ニ ワ ト リ に お け る TLR-3 お よ び -5 で も 同 様 に 分 泌 型 TLR と 考 え ら れ る mRNA が 発 見 さ れ て き た [Hwang et al., 2010, Yilmaz et al., 2005]。 さ ら に 哺 乳 綱 で は ヒ ト の 唾 液 ，乳 汁 お よ び 血 漿 中 に 分 泌 型 TLR-2 が ，ま た ， 唾 液 中 に 分 泌 型 TLR-4 が 存 在 す る こ と が 明 ら か に さ れ て き て お り ， こ れ ら の 報 告 で は 分 泌 型 TLR が 膜 型 TLR に よ る リ ガ ン ド の 認 識 を 中 和 す る 作 用 を 有 す る こ と が 推 察 さ れ て い る こ と か ら ， こ の 分 泌 型 TLR が 膜 型 TLR を 介 し た 細 菌 の 認 識 機 構 の 調 節 に 重 要 な 役 割 を 担 っ て い る 可 能 性 も 想 定 さ れ て い る [Iwami et al., 2000; Kuroishi et al., 2007; LeBouder et al., 2003; Zunt et al., 2009] 。 し た が っ て ， 消 化 管 粘 膜 に お け る 常 在 細 菌 の 増 殖 検 出 機 構 を 十 分 に 明 ら か に す る た め に は 膜 型 TLR の み な ら ず ，分 泌 型 TLR の 消 化 管 粘 膜 に お け る 局 在 を 明 ら か に す る 必 要 が あ る と 考 え ら れ る 。 そ こ で ， 本 研 究 で は 哺 乳 綱 の TLR 中 で も 細 菌 の 構 成 成 分 を 認 識 す る TLR-2， -4 お よ び -9 に 着 目 し ，第 I 章 で は ラ ッ ト 小 腸 の 粘 膜 上 皮 に お け る TLR -2， -4 お よ び -9 の 発 現 を ， さ ら に 第 II 章 で は ラ ッ ト の 消 化 管 付 属 外 分 泌 腺 に お け る TLR-2，-4 お よ び -9 の 局 在 を 免 疫 組 織 化 学 的 に 精 査 す る と と も に ，

第 III 章 で は ラ ッ ト の 上 行 結 腸 に お け る 常 在 細 菌 の 定 着 部 位 と TLR の 発 現 部 位 を 精 査 し ， 常 在 細 菌 の 増 殖 に 対 す る 生 体 防 御 応 答 に 関 し て も 明 ら か に し ， 最 終 的 に 常 在 細 菌 の 定 着 お よ び 増 殖 へ の 制 御 機 構 の 一 端 を TLR を 介 し た 常 在 細 菌 の 認 識 の 観 点 か ら 明 ら か に す る こ と を 目 的 と し た 。

第 I 章

I-1. 小 緒

消 化 管 の 重 要 な 機 能 の 一 つ と し て ，栄 養 素 の 消 化・吸 収 が あ げ ら れ る 。 哺 乳 綱 で は ， 唾 液 ， 胃 液 ， 膵 液 ， 胆 汁 お よ び 腸 液 中 に 含 ま れ る 種 々 の 消 化 酵 素 に よ っ て 経 口 摂 取 さ れ た 食 物 由 来 の タ ン パ ク 質 ， 炭 水 化 物 お よ び 脂 肪 を 低 分 子 の 栄 養 素 に 分 解 し ， そ の 多 く が 小 腸 に お い て 吸 収 さ れ る 。 小 腸 粘 膜 に は 腸 絨 毛 が 存 在 し て お り ， 粘 膜 の 表 面 積 を 拡 大 す る こ と に よ っ て 効 率 的 に 栄 養 素 を 吸 収 す る と 考 え ら れ て い る [藤 田 ら ，2010]。こ の 小 腸 の 腸 絨 毛 に お け る 常 在 細 菌 の 基 本 的 な 定 着 部 位 は 腸 絨 毛 の 先 端 で あ り ， 腸 絨 毛 の 先 端 の 上 皮 細 胞 に 常 在 細 菌 が 接 着 す る と ， 上 皮 細 胞 は 4 層 か ら な る 物 理 的 防 御 層 を 接 着 部 位 に 形 成 し ， 最 終 的 に actin と myosin を 再 配 列 す る こ と に よ っ て 接 着 し た 常 在 細 菌 を 排 除 す る こ と が 明 ら か に さ れ て い る [Inamoto et al., 2008a, b]。 ま た ， 腸 絨 毛 先 端 の 上 皮 細 胞 に 接 着 し た 常 在 細 菌 が 腸 絨 毛 間 隙 の 10％ の 位 置 に ま で 増 殖 す る と 腸 絨 毛 の 長 さ が 短 く な り ， さ ら に 深 部 へ と 増 殖 す る と 上 皮 細 胞 の 移 動 速 度 が 有 意 に 速 く な る と と も に ，50％ の 位 置 に ま で 増 殖 す る と そ の 移 動 速 度 が 最 大 と な る こ と ， ま た ， 常 在 細 菌 が 腸 絨 毛 間 隙 の 深 部 へ と 増 殖 し た 場 合 に は 腸 陰 窩 底 部 に 存 在 す る パ ネ ー ト 細 胞 か ら lysozyme や sPLA2 等 の 抗 菌 物 質 が 分 泌 さ れ る こ と が 明 ら か に さ れ て い る [Qi et al., 2009a; Yokoo et al., 2011a]。こ の よ う に ， 宿 主 が 近 接 す る 常 在 細 菌 に 対 し て 基 本 的 な 生 体 防 御 応 答 を 惹 起 す る こ と か ら ， 腸 絨 毛 表 面 に は 細 菌 を 認 識 す る 何 ら か の 受 容 体 が 存 在 す る 可 能 性 が 想 定 さ れ て い る 。 し か し な が ら ， 生 体 に お け る 小 腸 の 粘 膜 上 皮 に お い て ， 常 在 細 菌 の 増 殖 の 認 識 に 関 わ る 受 容 体 に つ い て は 明 ら か に さ れ て い な い 。 近 年 ， 生 体 に お い て 細 菌 や ウ イ ル ス 等 の 構 成 成 分 を 認 識 す る 受 容 体 と

し て TLR が 注 目 さ れ て い る 。 TLR は サ イ ト カ イ ン の 産 生 [Akira et al., 2006; Kawai and Aki ra, 2007 ]， β -defensi n 等 の 抗 菌 物 質 の 産 生 制 御 [Vora et

al., 2004] ，細 胞 増 殖 の 制 御 [ Li et al. , 2010] ，ア ポ ト ー シ ス の 制 御 [ Aliprantis et al. , 1999, 2000] 等 生 体 に と っ て 基 本 的 な 生 体 防 御 応 答 に 関 わ る と さ れ

て い る 。 従 来 in vitro お よ び 分 子 生 物 学 的 な 解 析 を 用 い た 研 究 か ら ， TLR が 粘 膜 上 皮 に お い て 細 菌 の 認 識 に 関 わ る 可 能 性 が 報 告 さ れ た も の の [Abreu et al., 2001; Cario et al ., 2000, 2002 ; Ikeda et al ., 2010; Ruemm el e et

al., 2002; Swerdlow et al., 2006]， 小 腸 の 粘 膜 上 皮 に お け る T LR の 局 在 は in vivo で は 未 だ 明 ら か に さ れ て い な い 。 そ こ で ， 第 I 章 で は ， ラ ッ ト の

小 腸 を 実 験 モ デ ル と し て 粘 膜 上 皮 に お け る TLR-2， -4 お よ び -9 の 局 在 を 免 疫 組 織 化 学 的 に 精 査 し た 。

I-2. 材 料 お よ び 方 法

1） 供 試 動 物 お よ び 飼 育 法 7 週 齢 の Wistar 系 ラ ッ ト の 雄 7 匹 を 用 い た 。 供 試 動 物 の 飼 育 お よ び 実 験 に つ い て は 「 神 戸 大 学 動 物 実 験 実 施 規 則 」 に 基 づ い て お こ な っ た (許 可 番 号 ： 19-05-07 および 22-05-01)。 飼 育 条 件 に つ い て は ， 室 温 を 23±1℃ ， 湿 度 を 50-60％ に 保 ち ， 配 合 飼 料 (ラ ボ MR ス ト ッ ク ， 日 本 農 産 工 業 ， 横 浜 ， 日 本 )の 自 由 摂 食 お よ び 自 由 飲 水 と し て ， 午 前 6 時 か ら 午 後 6 時 ま で の 12 時 間 照 明 と し た 。 実 験 期 間 中 ， ラ ッ ト に は 外 見 上 の 異 常 は み と め ら れ ず ， 健 常 で あ り ， 材 料 採 取 時 に お け る 肉 眼 解 剖 学 的 所 見 お よ び 採 取 し た 臓 器 の 組 織 学 的 所 見 に お い て も 異 常 は み と め ら れ な か っ た 。 2） 材 料 採 取 お よ び 組 織 学 的 処 理 ラ ッ ト を ソ ム ノ ペ ン チ ル (共 立 製 薬 ，東 京 ，日 本 )の 腹 腔 投 与 に よ る 深 麻 酔 下 で 安 楽 死 さ せ た 後 ， 胸 郭 の 腹 側 を 正 中 切 開 し ， さ ら に 心 膜 を 切 開 し て 心 臓 を 露 出 し ，左 心 室 か ら 4％ paraformaldehyde (PFA) 固 定 液 を 灌 流 し た 。 灌 流 固 定 後 ，す ば や く 十 二 指 腸 ，空 腸 お よ び 回 腸 の 組 織 片 を 4％ PFA 固 定 液 を 用 い て 4℃ で 6 時 間 浸 漬 固 定 し た 。 凍 結 切 片 の 作 製 に つ い て は Barthel と Raymond (1990)の 方 法 に 準 拠 し た 。 そ の 方 法 を 要 約 し て 以 下 に 記 載 す る 。 固 定 後 ，組 織 片 を 0.1M リ ン 酸 緩 衝 液（ pH 7.4; 以 下 PB）に よ る 洗 浄 を 20 分 間 ず つ 3 回 お こ な っ た 。 次 い で ， 5 ％ ス ク ロ ー ス 加 0.1M リ ン 酸 緩 衝 液 （ pH 7.4; 以 下 ス ク ロ ー ス 加 PB） に 20 分 間 ず つ 3 回 ， 10％ ， 12.5％ ， 15％ ス ク ロ ー ス 加 PB に そ れ ぞ れ 30 分 ，20％ ス ク ロ ー ス 加 P B に 1 時 間 浸 漬 し ， 最 後 に 4℃ の 20％ ス ク ロ ー ス 加 PB と OCT コ ン パ ウ ン ド (Sakura Finet ek ， C ali forni a ， U.S.A.) を 2： 1 の 割 合 で 混 合 し た 混 合 液 に 一 晩 浸 漬

し た 。 浸 漬 後 ， 溶 液 と と も に ア ル ミ 箔 製 の 容 器 中 に 移 し ， そ の 容 器 を 液 体 窒 素 中 の 鉛 塊 に 押 し 付 け て 急 速 凍 結 し た 。 作 製 し た 凍 結 ブ ロ ッ ク に つ い て は 薄 切 時 ま で -30℃ で 保 存 し た 。次 い で ，ク リ オ ス タ ッ ト (HM505E 型 ， カ ー ル ツ ァ イ ス ， Jena， ド イ ツ )を 用 い て 4 μm 厚 の 凍 結 切 片 を 作 製 し ， 3’-am inoprop ylt ri ethox ysi lane (信 越 化 学 工 業 ， 東 京 ， 日 本 )を コ ー テ ィ ン グ し た ス ラ イ ド グ ラ ス に 貼 付 し て ， 使 用 時 ま で 冷 凍 保 存 (-30℃ )し た 。 3） 免 疫 組 織 化 学 的 染 色 前 記 の 凍 結 切 片 を 蒸 留 水 に 浸 漬 し ， ア ス ピ レ ー タ ー を 用 い て 陰 圧 条 件 下 で 切 片 に 含 ま れ る 気 泡 を 除 去 し た 後 ，0.05％ の Tween20 を 加 え た 0.01M リ ン 酸 緩 衝 液 (pH7.4，以 下 0.05％ T-PBS)で 3 回 洗 浄 し た 。続 い て 100％ メ タ ノ ー ル と 0.5 ％ 過 酸 化 水 素 水 に 室 温 で そ れ ぞ れ 30 分 間 浸 漬 し た 後 ， 0.05％ T-P BS で 3 回 洗 浄 し ， 0.06 ％ 正 常 ブ リ 血 清 と 室 温 で 1 時 間 反 応 さ せ た 。そ の 後 ，100 倍 希 釈 の 抗 TLR-2，-4 お よ び -9 抗 体 (Santa Cruz Biotechnol., Sant a C ruz, 米 国 )と 室 温 で 撹 拌 し な が ら 30 分 間 反 応 さ せ た 後 ， 4℃ で 18 時 間 反 応 さ せ た 。 反 応 後 ， 0.05％ T-PBS で 3 回 洗 浄 し ， 200 倍 希 釈 の 抗 ヤ ギ IgG マ ウ ス IgG (Chemicon International, Bill eri ca,

MA，

米 国 )と 室 温 で 1 時 間 反 応 さ せ た 。最 後 に ト リ ス 緩 衝 液 (pH7.6)で 切 片 を 3 回 洗 浄 し て DAB 発 色 液 と 反 応 さ せ ， メ チ ル グ リ ー ン な い し ヘ マ ト キ シ リ ン 染 色 液 で 対 比 染 色 し た 。 実 験 対 象 切 片 に は 一 次 抗 体 の 代 わ り に 非 免 疫 ヤ ギ IgG な い し PBS を 反 応 さ せ た 。 4） 計 量 組 織 学 的 観 察 法 回 腸 の 標 本 を 用 い て ， 常 在 細 菌 が 腸 絨 毛 間 隙 の 深 部 に ま で 増 殖 し て い る 部 位 と 常 在 細 菌 が 本 来 の 定 着 部 位 で あ る 腸 絨 毛 先 端 の み に 限 局 し て 存

在 す る 部 位 の 2 箇 所 か ら そ れ ぞ れ 無 作 為 に 40 本 の 腸 絨 毛 を 選 び 出 し ，そ れ ぞ れ の 部 位 に お い て 腸 絨 毛 先 端 に TLR-2 陰 性 上 皮 細 胞 の 存 在 す る 腸 絨 毛 の 割 合 を 算 出 し た 。 さ ら に TLR-2 陰 性 上 皮 細 胞 の 存 在 す る 腸 絨 毛 と 存 在 し な い 腸 絨 毛 を 無 作 為 に 30 本 選 び 出 し ，腸 絨 毛 先 端 に 常 在 細 菌 の 接 着 が み ら れ る 腸 絨 毛 の 割 合 を 算 出 し た 。 計 測 値 を 平 均 値 ±標 準 偏 差 と し て 表 示 し た 。 統 計 学 的 解 析 に は Pearson の χ 二 乗 検 定 を 用 い た 。 P の 値 が 0.05 未 満 の 場 合 を 有 意 と し た 。

I-3. 結 果

1） 十 二 指 腸 粘 膜 に お け る 各 種 TLR の 発 現 a) TLR-2 TLR -2 は 腸 絨 毛 基 部 か ら 頂 部 に か け て の 絨 毛 円 柱 上 皮 細 胞 の 線 条 縁 で 陽 性 を 示 し た 。 線 条 縁 に お け る 陽 性 強 度 は 腸 絨 毛 の 基 部 で は 弱 く ， 中 部 か ら 頂 部 で は 強 か っ た 。 一 部 の 腸 絨 毛 の 先 端 に は 線 条 縁 が TLR-2 陰 性 を 示 す 上 皮 細 胞 群 が み と め ら れ た 。 腸 絨 毛 頂 部 の 絨 毛 円 柱 上 皮 細 胞 の 遊 離 縁 側 の 細 胞 質 に TLR-2 膜 陽 性 の 空 胞 が 散 見 さ れ た (図 1a-c)。 腸 絨 毛 の 先 端 に は ， 線 条 縁 が 陽 性 を 示 し か つ 空 胞 を 有 す る 上 皮 細 胞 ， 線 条 縁 が 陰 性 を 示 し ， か つ 空 胞 を 有 す る 上 皮 細 胞 ， 線 条 縁 が 陽 性 を 示 し ， か つ 空 胞 を 有 さ な い 上 皮 細 胞 お よ び 線 条 縁 が 陰 性 を 示 し ， か つ 空 胞 を 有 さ な い 上 皮 細 胞 が み と め ら れ た 。 ま た ， 上 皮 内 リ ン パ 球 に 陽 性 は み ら れ な か っ た 。 粘 膜 固 有 層 の 遊 走 細 胞 の 細 胞 膜 お よ び 細 胞 質 に ま れ に 陽 性 が み と め ら れ た 。 そ の 他 の 組 織 構 成 要 素 は 陰 性 で あ っ た 。 b) TLR-4 TLR -4 は 腸 絨 毛 基 部 か ら 頂 部 に か け て の 絨 毛 円 柱 上 皮 細 胞 の 線 条 縁 で 陽 性 を 示 し た が ， 上 皮 細 胞 の 中 に は 線 条 縁 が 陰 性 を 示 す 上 皮 細 胞 が 散 見 さ れ た 。 線 条 縁 の 陽 性 頻 度 は 腸 絨 毛 基 部 で 低 く ， 先 端 に 向 か う に つ れ て 高 く な っ た 。 ま た ， TLR-4 陽 性 を 示 す 顆 粒 状 物 質 が 腸 絨 毛 頂 部 の 絨 毛 円 柱 上 皮 細 胞 の 遊 離 縁 側 の 細 胞 質 ， 細 胞 間 隙 お よ び 毛 細 血 管 内 腔 に 多 く み と め ら れ た (図 2a-d)。 ま た ， 上 皮 内 リ ン パ 球 に 陽 性 は み ら れ な か っ た 。 粘 膜 固 有 層 の 遊 走 細 胞 の 細 胞 膜 お よ び 細 胞 質 に ま れ に 陽 性 が み と め ら れ た 。 さ ら に ， 中 心 リ ン パ 管 の 内 皮 細 胞 に も 陽 性 が み と め ら れ た 。 そ の

他 の 組 織 構 成 要 素 は 陰 性 で あ っ た 。 c) TLR-9 TLR -9 は 腸 絨 毛 基 部 か ら 頂 部 に か け て の 絨 毛 円 柱 上 皮 細 胞 の 線 条 縁 で 陽 性 を 示 し た 。 線 条 縁 に お け る 陽 性 強 度 は 腸 絨 毛 基 部 か ら 頂 部 に 向 か う に つ れ て 強 く な っ た 。 一 部 の 腸 絨 毛 の 先 端 に は 線 条 縁 が TLR-9 陰 性 を 示 す 上 皮 細 胞 群 が み と め ら れ た (図 2e)。 ま た ， 上 皮 内 リ ン パ 球 に 陽 性 は み ら れ な か っ た 。 粘 膜 固 有 層 の 遊 走 細 胞 の 細 胞 質 に ま れ に 陽 性 が み と め ら れ た 。 そ の 他 の 組 織 構 成 要 素 は 陰 性 で あ っ た 。 2） 空 腸 粘 膜 に お け る 各 種 TLR の 発 現 a) TLR-2 TLR -2 は 腸 絨 毛 基 部 か ら 頂 部 に か け て の 絨 毛 円 柱 上 皮 細 胞 の 線 条 縁 で 陽 性 を 示 し た 。 線 条 縁 に お け る 陽 性 強 度 は 腸 絨 毛 基 部 で 弱 か っ た が ， 中 部 か ら 頂 部 で は 強 か っ た 。 一 部 の 腸 絨 毛 の 先 端 に は 線 条 縁 が TLR-2 陰 性 を 示 す 上 皮 細 胞 群 が み と め ら れ た 。 腸 絨 毛 の 頂 部 の 絨 毛 円 柱 上 皮 細 胞 の 遊 離 縁 側 の 細 胞 質 に TLR-2 膜 陽 性 の 空 胞 が 散 見 さ れ た 。 こ の TLR-2 膜 陽 性 空 胞 の 大 き さ は 十 二 指 腸 に 比 べ て 大 き か っ た (図 3a-c)。腸 絨 毛 の 先 端 に は ， 線 条 縁 が 陽 性 を 示 し ， か つ 空 胞 を 有 す る 上 皮 細 胞 ， 線 条 縁 が 陰 性 を 示 し ， か つ 空 胞 を 有 す る 上 皮 細 胞 ， 線 条 縁 が 陽 性 を 示 し ， か つ 空 胞 を 有 さ な い 上 皮 細 胞 お よ び 線 条 縁 が 陰 性 を 示 し ， か つ 空 胞 を 有 さ な い 上 皮 細 胞 が み と め ら れ た 。 ま た ， 上 皮 内 リ ン パ 球 に 陽 性 は み ら れ な か っ た 。 粘 膜 固 有 層 の 遊 走 細 胞 の 細 胞 膜 お よ び 細 胞 質 に 陽 性 が ま れ に み と め ら れ た 。 そ の 他 の 組 織 構 成 要 素 は 陰 性 で あ っ た 。

b) TLR-4 TLR -4 は 一 部 の 腸 絨 毛 頂 部 の 絨 毛 円 柱 上 皮 細 胞 の 線 条 縁 で ま れ に 陽 性 を 示 し た が ， ほ と ん ど の 腸 絨 毛 の 絨 毛 円 柱 上 皮 細 胞 の 線 条 縁 で 陰 性 で あ っ た (図 4a)。 ま た ， 十 二 指 腸 と 同 様 に TLR-4 陽 性 を 示 す 顆 粒 状 物 質 が 腸 絨 毛 頂 部 の 絨 毛 円 柱 上 皮 細 胞 の 遊 離 縁 側 の 細 胞 質 ， 細 胞 間 隙 お よ び 毛 細 血 管 内 腔 に み と め ら れ た 。 ま た ， 上 皮 内 リ ン パ 球 に 陽 性 は み ら れ な か っ た 。 粘 膜 固 有 層 の 遊 走 細 胞 の 細 胞 膜 お よ び 細 胞 質 に 陽 性 が 中 程 度 の 頻 度 で み と め ら れ た 。 粘 膜 固 有 層 の 遊 走 細 胞 の 細 胞 質 に は 微 細 な TLR-4 陽 性 顆 粒 状 物 質 が み と め ら れ た 。 さ ら に ， 中 心 リ ン パ 管 の 内 皮 細 胞 に も 陽 性 が み と め ら れ た 。 そ の 他 の 組 織 構 成 要 素 は 陰 性 で あ っ た 。 c) TLR-9 TLR -9 は 一 部 の 腸 絨 毛 頂 部 の 絨 毛 円 柱 上 皮 細 胞 の 線 条 縁 で ま れ に 陽 性 を 示 し た が ， ほ と ん ど の 腸 絨 毛 の 絨 毛 円 柱 上 皮 細 胞 の 線 条 縁 で 陰 性 で あ っ た (図 4b)。 ま た ， 上 皮 内 リ ン パ 球 に 陽 性 は み ら れ な か っ た 。 粘 膜 固 有 層 の 遊 走 細 胞 の 細 胞 膜 お よ び 細 胞 質 に 陽 性 が 低 頻 度 で み と め ら れ た 。 粘 膜 固 有 層 内 の 毛 細 血 管 な い し 中 心 リ ン パ 管 の 内 皮 細 胞 に 陽 性 は み ら れ な か っ た 。 そ の 他 の 組 織 構 成 要 素 は 陰 性 で あ っ た 。 3） 回 腸 粘 膜 に お け る 各 種 TLR の 発 現 a) TLR-2 TLR -2 は 腸 絨 毛 基 部 か ら 頂 部 に か け て の 絨 毛 円 柱 上 皮 細 胞 の 線 条 縁 で 陽 性 を 示 し た 。 線 条 縁 に お け る 陽 性 強 度 は 腸 絨 毛 基 部 で は 弱 く ， 中 部 か ら 頂 部 で は 強 か っ た 。 一 部 の 腸 絨 毛 の 先 端 に は 線 条 縁 が TLR-2 陰 性 を 示 す 上 皮 細 胞 群 が み と め ら れ た (図 5a-b)。TLR-2 陰 性 上 皮 細 胞 の 存 在 す る 腸

絨 毛 の 割 合 は ， 常 在 細 菌 の 増 殖 が み ら れ な い 部 位 に 比 べ て 常 在 細 菌 が 過 度 に 増 殖 し て い る 部 位 で 有 意 に 高 か っ た (図 6a)。 さ ら に ， 絨 毛 円 柱 上 皮 細 胞 へ の 常 在 細 菌 の 接 着 は ， TLR-2 陰 性 上 皮 細 胞 の 存 在 し な い 腸 絨 毛 に 比 べ て TLR-2 陰 性 上 皮 細 胞 の 存 在 す る 腸 絨 毛 に お い て 有 意 に 高 頻 度 で あ っ た (図 6b)。 腸 絨 毛 の 頂 部 の 絨 毛 円 柱 上 皮 細 胞 の 遊 離 縁 側 の 細 胞 質 に は TLR -2 膜 陽 性 の 空 胞 が 散 見 さ れ た 。 こ の T LR-2 膜 陽 性 空 胞 は 十 二 指 腸 お よ び 空 腸 に 比 べ て よ り 低 頻 度 で あ っ た (図 5c)。 腸 絨 毛 の 先 端 に は ， 線 条 縁 が 陽 性 を 示 し ， か つ 空 胞 を 有 す る 上 皮 細 胞 ， 線 条 縁 が 陰 性 を 示 し ， か つ 空 胞 を 有 す る 上 皮 細 胞 ， 線 条 縁 が 陽 性 を 示 し ， か つ 空 胞 を 有 さ な い 上 皮 細 胞 お よ び 線 条 縁 が 陰 性 を 示 し ， か つ 空 胞 を 有 さ な い 上 皮 細 胞 が み と め ら れ た 。 ま た ， 上 皮 内 リ ン パ 球 に 陽 性 は み ら れ な か っ た 。 粘 膜 固 有 層 の 遊 走 細 胞 の 細 胞 膜 お よ び 細 胞 質 に 陽 性 が ま れ に み と め ら れ た 。 そ の 他 の 組 織 構 成 要 素 は 陰 性 で あ っ た 。 b) TLR-4 TLR -4 は 一 部 の 腸 絨 毛 頂 部 の 絨 毛 円 柱 上 皮 細 胞 の 線 条 縁 で ま れ に 陽 性 を 示 し た が ， ほ と ん ど の 腸 絨 毛 の 絨 毛 円 柱 上 皮 細 胞 の 線 条 縁 で 陰 性 で あ っ た (図 7a)。 ま た ， 十 二 指 腸 や 空 腸 と 同 様 に TLR-4 陽 性 を 示 す 顆 粒 状 物 質 が 腸 絨 毛 頂 部 の 絨 毛 円 柱 上 皮 細 胞 の 遊 離 縁 側 の 細 胞 質 ， 細 胞 間 隙 お よ び 毛 細 血 管 内 腔 に ま れ に み と め ら れ ， 腸 絨 毛 基 部 の 絨 毛 円 柱 上 皮 細 胞 の 遊 離 縁 側 の 細 胞 質 お よ び 細 胞 間 隙 に も ご く ま れ に み と め ら れ た 。 ま た ， 上 皮 内 リ ン パ 球 に 陽 性 は み ら れ な か っ た 。 粘 膜 固 有 層 の 遊 走 細 胞 の 細 胞 膜 お よ び 細 胞 質 に 陽 性 が ま れ に み と め ら れ た 。 さ ら に ， 中 心 リ ン パ 管 の 内 皮 細 胞 に も 陽 性 が み と め ら れ た 。 そ の 他 の 組 織 構 成 要 素 は 陰 性 で あ っ た 。

c) TLR-9 TLR -9 は 一 部 の 腸 絨 毛 頂 部 の 絨 毛 円 柱 上 皮 細 胞 の 線 条 縁 で ま れ に 陽 性 を 示 し た が ， ほ と ん ど の 腸 絨 毛 の 絨 毛 円 柱 上 皮 細 胞 の 線 条 縁 で は 陰 性 で あ っ た (図 7b)。 ま た ， 上 皮 内 リ ン パ 球 に 陽 性 は み ら れ な か っ た 。 粘 膜 固 有 層 の 遊 走 細 胞 の 細 胞 膜 お よ び 細 胞 質 に 陽 性 が ま れ に み と め ら れ た 。 そ の 他 の 組 織 構 成 要 素 は 陰 性 で あ っ た 。

I-4. 考 察

１ ． 十 二 指 腸 に お け る TLR 発 現 の 意 義 に つ い て

動 物 の 前 位 消 化 管 に は 大 量 の 常 在 細 菌 が 生 息 し て お り ， 舌 の 糸 状 乳 頭 の 背 面 ， 食 道 お よ び 胃 無 腺 部 の 角 質 層 表 面 に 広 く 接 着 し て い る [Brady et

al., 1975; Kast er and Cam eron, 1978; Yamamot o et al., 2009] 。 小 腸 で は 常 在

細 菌 は 腸 絨 毛 の 先 端 に 接 着 し て お り [Yamamoto et al., 2009]， 小 腸 に お け る 常 在 細 菌 数 は ， 十 二 指 腸 か ら 空 腸 に か け て は 少 な い が ， 回 腸 で は 多 く な る [Berg, 1996] 。 ま た ， 下 位 の 小 腸 の 粘 膜 に は パ イ エ ル 板 等 の リ ン パ 小 節 が 発 達 し て お り ， 腸 粘 膜 上 で 増 殖 す る 常 在 細 菌 を モ ニ タ リ ン グ し て い る 可 能 性 が 想 定 さ れ て い る の に 対 し ， ラ ッ ト の 前 位 消 化 管 粘 膜 に は リ ン パ 小 節 が 存 在 し な い [Koornstra et al., 1993; Yamamoto et al., 2009]。 本 章 で の 観 察 結 果 か ら ， 常 在 細 菌 の 多 く 生 息 す る 回 腸 で は TLR-2 の み が 絨 毛 円 柱 上 皮 細 胞 の 線 条 縁 で 陽 性 を 示 し た の に 対 し ， 常 在 細 菌 の 少 な い 十 二 指 腸 で は TLR-2，-4 お よ び -9 が 絨 毛 円 柱 上 皮 細 胞 の 線 条 縁 で 陽 性 を 示 し た 。 こ の こ と か ら ， 十 二 指 腸 の 絨 毛 円 柱 上 皮 細 胞 の 細 胞 膜 に 発 現 し た TLR が 前 位 消 化 管 か ら 十 二 指 腸 へ と 流 入 す る 細 菌 由 来 の リ ガ ン ド を 認 識 す る こ と に よ っ て ， 前 位 消 化 管 に 生 息 す る 常 在 細 菌 の 増 殖 を モ ニ タ リ ン グ し て い る 可 能 性 が 推 察 さ れ た 。 ２ ． 空 回 腸 に お け る TLR 発 現 の 意 義 に つ い て ラ ッ ト の 小 腸 に お け る 常 在 細 菌 の 優 先 的 な 接 着 部 位 は 腸 絨 毛 お よ び FAE の 先 端 で あ り ， 腸 絨 毛 の 先 端 に 接 着 し た 常 在 細 菌 は 腸 絨 毛 間 隙 の 深 部 へ と 増 殖 し て い く [Chin et al., 2006, 2007; Inamoto et al., 2008a, b; Yam am oto et al., 2009] 。従 来 腸 絨 毛 間 隙 に お け る 常 在 細 菌 の 増 殖 に と も な

っ て 様 々 な 生 体 防 御 機 構 が 働 く こ と が 明 ら か に さ れ て き て い る 。 す な わ ち ， 常 在 細 菌 が 腸 絨 毛 の 先 端 か ら 腸 絨 毛 間 隙 の 10％ の 位 置 ま で 増 殖 す る と ， 腸 絨 毛 の 長 さ が 短 く な り ， 絨 毛 円 柱 上 皮 細 胞 の 移 動 速 度 が 常 在 細 菌 の 増 殖 に 伴 っ て 増 加 し て 腸 絨 毛 間 隙 の 50％ の 位 置 に ま で 達 す る と 最 大 に な る こ と が 明 ら か に さ れ て い る [Qi et al., 2009a]。 さ ら に ， 常 在 細 菌 が 腸 絨 毛 間 隙 の 深 部 へ と 増 殖 す る と ， 腸 陰 窩 底 部 に 存 在 す る パ ネ ー ト 細 胞 か ら lysozyme や sPLA2 等 の 抗 菌 物 質 が 分 泌 さ れ る こ と が 明 ら か に さ れ て い る [Yokoo et al., 2011a]。こ れ ら の こ と か ら ，腸 絨 毛 の 表 面 に は 常 在 細 菌 由 来 の 物 質 を 認 識 す る た め の 受 容 体 が 存 在 し て い る 可 能 性 が 想 定 さ れ る 。 今 回 の 研 究 に お い て ， TLR-2 が 小 腸 の 全 域 に わ た っ て 腸 絨 毛 の 基 部 か ら 頂 部 の 絨 毛 円 柱 上 皮 細 胞 の 線 条 縁 に 存 在 し て い た 。 こ の こ と か ら ， 腸 絨 毛 の 表 面 に 発 現 し た TLR-2 が 小 腸 の 粘 膜 上 に 定 着 し た 常 在 細 菌 の 増 殖 を モ ニ タ リ ン グ し て い る 可 能 性 が 推 察 さ れ た 。 粘 膜 表 面 の リ ガ ン ド を 認 識 す る 細 菌 の 接 着 因 子 が 複 数 報 告 さ れ て い る 。 す な わ ち ， Yersinia の 外 膜 表 面 に 発 現 す る タ ン パ ク 質 で あ る invasin お よ び Escherichia coli の 外 膜 表 面 に 発 現 す る タ ン パ ク 質 で あ る intimin は 宿 主 の 細 胞 接 着 因 子 で あ る integrin に 特 異 的 に 結 合 す る [Isberg et al., 1995; Frankel et al ., 1996] 。ま た ，種 々 の 細 菌 に 発 現 す る レ ク チ ン で あ る adhesi n は ， 宿 主 の 腸 管 粘 膜 表 面 に 発 現 す る 多 糖 類 と 結 合 す る [Mouricout and Védrine, 2000] 。ラ ッ ト の 小 腸 で は 常 在 細 菌 の 定 着 部 位 で あ る 腸 絨 毛 先 端 の 上 皮 細 胞 の 脱 落 部 位 に 特 異 的 な 糖 が 発 現 し て お り ， こ れ ら の 糖 が 常 在 細 菌 の 接 着 リ ガ ン ド に な り う る 可 能 性 が 考 え ら れ て い る [Chin et al., 2007; Yam am oto et al., 2010] 。本 章 で の 観 察 結 果 か ら ，小 腸 の 全 長 に わ た っ て 一 部 の 腸 絨 毛 の 先 端 に は TLR-2 を 欠 損 す る 上 皮 細 胞 群 が 存 在 す る と と も に ， TLR -2 陰 性 上 皮 細 胞 の 存 在 す る 腸 絨 毛 の 割 合 が 常 在 細 菌 の 増 殖 が み ら れ な い 部 位 に 比 べ て ， 常 在 細 菌 が 過 度 に 増 殖 し て い る 部 位 で 有 意 に 高 か っ

た 。 さ ら に ， 絨 毛 円 柱 上 皮 細 胞 へ の 常 在 細 菌 の 接 着 は TLR-2 陰 性 上 皮 細 胞 の 存 在 し な い 腸 絨 毛 に 比 べ て TLR-2 陰 性 上 皮 細 胞 の 存 在 す る 腸 絨 毛 に お い て 有 意 に 高 頻 度 で み と め ら れ た 。 こ れ ら の こ と か ら ， 腸 絨 毛 先 端 の 上 皮 細 胞 で は ， TLR-2 が 欠 損 し て い る こ と も 常 在 細 菌 の 接 着 の 許 容 に 貢 献 し て い る こ と が 示 唆 さ れ た 。 ３ ． TLR-4 陽 性 の 顆 粒 状 物 質 に つ い て 腸 絨 毛 の 上 皮 細 胞 は 食 餌 あ る い は 細 菌 由 来 の 外 来 抗 原 に 常 時 曝 さ れ て お り ， ア ミ ノ 酸 ， 単 糖 類 お よ び 脂 肪 酸 等 消 化 さ れ た 様 々 な 低 分 子 の 栄 養 素 を 吸 収 し て い る 。 腸 絨 毛 の 上 皮 細 胞 は 分 解 さ れ て い な い 高 分 子 の 食 餌 由 来 物 質 を 吸 収 し な い と さ れ て き た が ， こ の 定 説 に 反 し て 多 く の 研 究 者 が persorption と 呼 ば れ る 現 象 を 報 告 し て い る [Herbst, 1844; Hillyer and Albrecht, 2001; Hus b y et al., 1986; Ki tagawa et al ., 2003; McLean and As h, 1986, 1987, 1990; Takeuchi et al., 2004; Udall et al., 1981; Volkheim er, 1974 , 1977; Vol kheim er and Shulz, 1968; Volkheim er et al ., 1968, Wells et al. , 1988; Yuji et al., 2006, 2007, 2012 ]。 す な わ ち ， 腸 絨 毛 頂 部 の 絨 毛 円 柱 上 皮 細 胞 は ， 食 餌 由 来 物 質 に 対 す る 特 異 抗 体 と IgG に 対 す る 膜 受 容 体 を 介 し て 高 分 子 や 粒 子 等 を 腸 管 内 腔 か ら 取 り 込 み ， 門 脈 血 中 へ と 輸 送 す る と さ れ て い る 。 さ ら に ， 腸 絨 毛 の 上 皮 細 胞 は 食 餌 由 来 の 栄 養 素 の み な ら ず ， LPS 等 の 細 菌 由 来 の 構 成 成 分 も 吸 収 す る と さ れ て い る [Ghoshal et al., 2009; J acob et al ., 1977]。 さ ら に ， 唾 液 中 に は 分 泌 型 TLR -4 が 存 在 し て お り ， LPS を 中 和 す る こ と が 報 告 さ れ て い る [ Zunt et al ., 2009] 。 加 え て ， 本 章 に お け る 観 察 結 果 か ら ， TLR-4 陽 性 の 顆 粒 状 物 質 が 特 に 腸 絨 毛 頂 部 の 腸 管 上 皮 細 胞 の 遊 離 縁 側 の 細 胞 質 ， 細 胞 間 隙 お よ び 毛 細 血 管 内 腔 で み と め ら れ た 。 こ れ ら の こ と か ら ， 分 泌 型 TLR-4 と LPS の 複 合 体 と 考 え ら れ る TLR -4 陽 性 の 顆 粒 状 物 質 は ， 腸 管 内 腔 か ら 上 皮 下 の 毛 細 血 管 へ と

I-5. 小 括

ラ ッ ト 小 腸 の 粘 膜 上 皮 に お い て 常 在 細 菌 の 増 殖 を モ ニ タ リ ン グ す る 可 能 性 が 考 え ら れ る TLR の 局 在 を 免 疫 組 織 化 学 的 に 精 査 し た 。 そ の 結 果 ， 十 二 指 腸 で は 腸 絨 毛 基 部 か ら 頂 部 に か け て の 上 皮 細 胞 の 線 条 縁 に お い て TLR-2， -4 お よ び -9 が 陽 性 を 示 し た こ と か ら ， 十 二 指 腸 の 腸 絨 毛 で は 絨 毛 円 柱 上 皮 細 胞 の 細 胞 膜 に 発 現 し た TLR-2， -4 お よ び -9 が 前 位 消 化 管 か ら 流 入 す る 細 菌 由 来 の リ ガ ン ド を 認 識 す る こ と に よ っ て ， 前 位 消 化 管 に 生 息 す る 常 在 細 菌 の 増 殖 を モ ニ タ リ ン グ し て い る 可 能 性 が 推 察 さ れ た 。 ま た ， 空 腸 お よ び 回 腸 で は 腸 絨 毛 の 基 部 か ら 頂 部 の 上 皮 細 胞 の 線 条 縁 で TLR-2 の み が 陽 性 を 示 し た 。 こ の こ と か ら ， TLR-2 が 小 腸 全 長 に わ た っ て ， 粘 膜 上 に 定 着 し た 常 在 細 菌 の 増 殖 を モ ニ タ リ ン グ し て い る 可 能 性 が 推 察 さ れ た 。 さ ら に ， 小 腸 全 長 に わ た っ て ， 一 部 の 腸 絨 毛 の 先 端 に は 線 条 縁 が TLR-2 陰 性 を 示 す 上 皮 細 胞 群 が 散 見 さ れ ，こ の TLR-2 陰 性 上 皮 細 胞 の 存 在 す る 腸 絨 毛 の 割 合 は 常 在 細 菌 の 増 殖 が み ら れ な い 部 位 に 比 べ て ， 常 在 細 菌 が 過 度 に 増 殖 し て い る 部 位 で 有 意 に 高 か っ た 。 加 え て ， 絨 毛 円 柱 上 皮 細 胞 へ の 常 在 細 菌 の 接 着 は TLR-2 陰 性 上 皮 細 胞 の 存 在 し な い 腸 絨 毛 に 比 べ て TLR-2 陰 性 上 皮 細 胞 の 存 在 す る 腸 絨 毛 で 有 意 に 高 頻 度 で あ っ た 。 こ れ ら の こ と か ら ， 腸 絨 毛 先 端 の 絨 毛 円 柱 上 皮 細 胞 に お け る TLR-2 の 欠 損 が 常 在 細 菌 の 定 着 に 貢 献 し て い る こ と が 示 唆 さ れ た 。 ま た ， 腸 絨 毛 先 端 の 上 皮 細 胞 の 遊 離 縁 側 の 細 胞 質 ， 細 胞 間 隙 お よ び 毛 細 血 管 内 腔 に TLR-4 陽 性 の 顆 粒 状 物 質 が み と め ら れ た こ と か ら ， 分 泌 型 TLR -4- LPS 複 合 体 と 考 え ら れ る TLR -4 陽 性 の 顆 粒 状 物 質 は 腸 管 内 腔 か ら 上 皮 下 の 毛 細 血 管 へ と persorption さ れ る 可 能 性 が 考 え ら れ た 。

第 II 章

ラ ッ ト の 消 化 管 付 属 外 分 泌 腺 か ら の 分 泌 型 Toll-like receptor の

分 泌

II-1. 小 緒

動 物 の 消 化 管 内 に お け る 常 在 細 菌 の 定 着 は ， 出 生 後 す ぐ に 母 親 由 来 の 常 在 細 菌 を 起 源 と し て 始 ま り ， 成 体 に な る と 生 理 学 的 条 件 下 で は 常 在 細 菌 の 組 成 お よ び 数 と も に 一 定 に 保 た れ る と さ れ る [Bourlioux et al., 2003]。 常 在 細 菌 の 定 着 の 仕 組 み に 関 し て は い ま だ 十 分 に は 解 明 が な さ れ て い な い が ， ラ ッ ト で は 消 化 管 の 最 内 腔 側 の 粘 膜 上 皮 表 面 が 常 在 細 菌 の 定 着 場 所 で あ り ， 小 腸 で は 腸 絨 毛 の 先 端 に 接 着 し た 常 在 細 菌 を 起 点 と し て 腸 絨 毛 の 間 隙 の 深 部 へ と 常 在 細 菌 が 増 殖 す る 。 腸 絨 毛 の 先 端 に は 特 異 的 な 糖 の 発 現 が み と め ら れ て お り ， 常 在 細 菌 が こ れ ら の 糖 を 介 し て 粘 膜 上 皮 へ と 接 着 し て い る 可 能 性 が 考 え ら れ て い る [Chin et al., 2006; Yamamoto et

al., 2009, 2010]。 第 I 章 で は ， こ の 常 在 細 菌 の 定 着 制 御 に 関 し て 小 腸 粘 膜 上 皮 に お け る TLR の 発 現 部 位 を 明 ら か に し ， TLR-2 が 小 腸 に 定 着 す る 常 在 細 菌 の 増 殖 の 検 知 に 重 要 な 役 割 を 担 っ て い る 可 能 性 が 推 察 さ れ た 。 し か し な が ら ， 小 腸 の 食 ビ 中 な い し は 粘 液 層 内 に は 大 量 の 常 在 細 菌 が 絶 え ず 生 息 し て い る に も 関 わ ら ず [Yamamoto et al., 2009]， 常 在 細 菌 の 増 殖 に 対 す る 生 体 防 御 応 答 は 常 在 細 菌 が 過 度 に 増 殖 し た 場 合 に し か 起 こ ら な い こ と か ら [Qi et al., 2009a; Yokoo et al., 2011a]，粘 液 層 内 の 常 在 細 菌 由 来 の TLR の リ ガ ン ド の 量 が あ る 閾 値 を 超 え な い と 膜 型 T LR を 刺 激 す る こ と が で き な い 仕 組 み の 存 在 が 想 定 さ れ る 。 近 年 ， 分 泌 型 TLR の 存 在 が 明 ら か に さ れ ，こ の 分 泌 型 TLR が 膜 型 TLR に よ る リ ガ ン ド の 認 識 を 緩 和 す る 可 能 性 が 報 告 さ れ て い る が [Kuroishi et al., 2007; LeBouder et al., 2003; Srinivasan et al., 2008; Zunt et al ., 2009]，消 化 管 に お け る 分 泌 型 T LR の 分 泌 部 位 等 に つ い て は ほ と ん ど 明 ら か に さ れ て い な い 。 こ の た め ， 消 化 管 粘 膜 上 皮 に お け る TLR を 介 し た 常 在 細 菌 の 増 殖 を 検 知 す る 仕 組 み を 十 分 に 明

ら か に す る た め に は 膜 型 TLR の 発 現 部 位 の み な ら ず ， 消 化 管 内 へ の 分 泌 型 TLR の 分 泌 部 位 に つ い て も in vivo で 明 ら か に す る 必 要 が あ る 。 ま た ， 第 I 章 で は グ ラ ム 陰 性 菌 由 来 の LPS を 認 識 す る TLR-4 が 空 回 腸 の 腸 絨 毛 で は 欠 如 し て お り ， グ ラ ム 陽 性 菌 に 豊 富 に 存 在 す る peptidoglycan を 認 識 す る TLR-2 が 小 腸 全 域 の 腸 絨 毛 で 発 現 す る こ と を 明 ら か に し た 。 こ の こ と か ら 小 腸 に お け る TLR を 介 し た 認 識 機 構 で は ， グ ラ ム 陽 性 菌 と 陰 性 菌 の 検 知 し 易 さ に 差 異 が 存 在 す る 可 能 性 が 想 定 さ れ ， 実 際 に 小 腸 は 前 位 消 化 管 の グ ラ ム 陽 性 菌 優 位 が 大 腸 の グ ラ ム 陰 性 菌 優 位 へ と 変 化 す る 部 位 で あ る こ と が 明 ら か に さ れ て い る [Yokoo et al., 2011a]，し か し な が ら ，小 腸 に お い て グ ラ ム 陰 性 菌 が 生 存 し 易 い か 否 か に 関 す る 直 接 的 な 証 拠 は 未 だ 得 ら れ て い な い 。 そ こ で ， 第 II 章 で は ， ラ ッ ト 消 化 器 系 に お け る TLR の 分 泌 部 位 を 特 定 し ， 消 化 管 粘 膜 上 皮 に お け る 常 在 細 菌 の 検 知 機 構 へ の 分 泌 型 TLR の 関 与 を 明 ら か に す る た め ， 消 化 管 付 属 外 分 泌 腺 に お け る TLR の 局 在 を 免 疫 組 織 化 学 的 に 精 査 す る と と も に ， 小 腸 に 備 わ る TLR 発 現 の 意 義 に つ い て 考 察 す る た め に ， 腸 絨 毛 間 隙 に 増 殖 す る 常 在 細 菌 の グ ラ ム 染 色 性 状 を 併 せ て 定 量 組 織 学 的 に 調 べ た 。

II-2. 材 料 お よ び 方 法

1） 供 試 動 物 お よ び 飼 育 法 7 週 齢 の Wistar 系 ラ ッ ト の 雄 10 匹 を 用 い た 。 供 試 動 物 の 飼 育 等 に 関 し て は 第 I 章 と 同 様 で あ る た め 省 略 す る 。 2） 材 料 採 取 お よ び 組 織 学 的 処 理 免 疫 組 織 化 学 用 の 試 料 採 取 に 関 し て ， 10 匹 の ラ ッ ト を ソ ム ノ ペ ン チ ル (共 立 製 薬 )の 腹 腔 投 与 に よ る 深 麻 酔 下 で 安 楽 死 さ せ た 後 ，胸 郭 の 腹 側 を 正 中 切 開 し ，さ ら に 心 膜 を 切 開 し て 心 臓 を 露 出 し ，左 心 室 か ら 4％ PFA 固 定 液 を 灌 流 し た 。灌 流 固 定 後 ，5 匹 の ラ ッ ト か ら は 免 疫 組 織 化 学 的 染 色 用 試 料 と し て 消 化 管 全 長 お よ び 消 化 管 に 付 随 す る 分 泌 腺 を す ば や く 取 り 出 し ， 耳 下 腺 ，下 顎 腺 ，舌 下 腺 ，眼 窩 外 涙 腺 ，ハ ー ダ ー 腺 ，舌 ，胃 腺 部 ，肝 臓 ， 膵 臓 ， 十 二 指 腸 ， 空 腸 ， 回 腸 ， 盲 腸 ， 上 行 結 腸 ， 下 行 結 腸 お よ び 直 腸 に 分 け ， さ ら に 他 の 5 匹 の ラ ッ ト か ら は グ ラ ム 染 色 用 の 試 料 と し て 回 腸 の み を 摘 出 し ， 組 織 片 を 4％ PFA 固 定 液 で 6 時 間 浸 漬 固 定 し た 。 免 疫 組 織 化 学 用 試 料 に つ い て は ， 第 I 章 と 同 様 に Barthel と Raymond (1990) の 方 法 に 準 じ て 凍 結 ブ ロ ッ ク を 作 製 し ， ク リ オ ス タ ッ ト (HM505E 型 ， カ ー ル ツ ァ イ ス ) を 用 い て 4 μm 厚 の 凍 結 切 片 を 作 製 し ， 3’-am inoprop ylt ri ethox ysi lane ( 信 越 化 学 工 業 ) を コ ー テ ィ ン グ し た ス ラ イ ド グ ラ ス に 貼 付 し て 使 用 時 ま で 冷 凍 保 存 (-30℃ )し た 。

グ ラ ム 染 色 用 の 試 料 は ， 0.1M PB（ pH7.4） に よ る 洗 浄 を 20 分 間 ず つ 3 回 お こ な っ た 後 ，70％ ，80％ ，90％ お よ び 95％ エ タ ノ ー ル に 20 分 間 ず つ 浸 漬 し ， さ ら に 100％ エ タ ノ ー ル に 1 時 間 ず つ 2 回 浸 漬 し て ， 100％ エ タ ノ ー ル に 一 晩 浸 漬 し た 。次 い で 20 分 間 ず つ 3 回 キ シ レ ン に 浸 漬 し て 透 徹

を お こ な い ， HISTOSEC（ 融 点 56～ 58℃ ； MERCK 社 ， ド イ ツ ） と 純 パ ラ フ ィ ン （ 融 点 56～ 58℃ ； MERCK 社 ） を 1:1 に 混 合 し た パ ラ フ ィ ン に 20 分 間 ず つ 3 回 浸 漬 し た 後 ， 同 パ ラ フ ィ ン に 包 埋 し た 。 こ れ を 滑 走 式 ミ ク ロ ト ー ム （ Leica SM2000R 型 ， Leica Microsystems 社 ， ド イ ツ ） を 用 い て

4 μm 厚 の パ ラ フ ィ ン 切 片 に 薄 切 し た 。 薄 切 後 ，

3’-am inoprop ylt ri ethox ysi lane ( 信 越 化 学 工 業 ) を コ ー テ ィ ン グ し た ス ラ イ ド グ ラ ス に 貼 付 し た 。

3） 免 疫 組 織 化 学 的 染 色

第 I 章 と 同 様 の 方 法 を 用 い て ，前 記 の 凍 結 切 片 に 0.06％ 正 常 ヘ ビ 血 清 と 室 温 で 1 時 間 反 応 さ せ た 後 ， 100 倍 希 釈 の 抗 TLR-2， -4 お よ び -9 ヤ ギ 抗 体 を 一 次 抗 体 と し ， 300 倍 希 釈 の 抗 ヤ ギ IgG マ ウ ス IgG (Chemicon Int ernational ) な い し 200 倍 希 釈 の 抗 ヤ ギ IgG ロ バ IgG (Beth yl Laborat or y, Mont gom er y,

TX，

米 国 )を 二 次 抗 体 と し て 染 色 し た 。 4） グ ラ ム 染 色 法 上 記 の パ ラ フ ィ ン 切 片 を 脱 パ ラ フ ィ ン 後 ， グ ラ ム 氏 染 色 第 1 液 （ 石 炭 酸 ゲ ン チ ア ナ 紫 液；武 藤 化 学 ，東 京 ，日 本 ）と 室 温 で 2 分 間 反 応 さ せ た 。 そ の 後 ， 蒸 留 水 で 洗 浄 し て グ ラ ム 氏 染 色 第 2 液 （ ル ゴ ー ル 液 ； 武 藤 化 学 ） と 室 温 で 1 分 間 反 応 さ せ ，蒸 留 水 で 洗 浄 し た 。次 に 100％ エ タ ノ ー ル に 切 片 を 50 秒 間 浸 漬 し て 脱 色 し た 後 に 蒸 留 水 で 洗 浄 し ，グ ラ ム 氏 染 色 第 3 液 （ チ ー ル 10 倍 希 釈 液 ； 武 藤 化 学 ） と 室 温 で 1 分 間 反 応 さ せ た 。 そ の 後 ， 蒸 留 水 で 洗 浄 し て ア セ ト ン で 脱 水 し ， 封 入 し た 。 グ ラ ム 染 色 の 陽 性 お よ び 陰 性 対 照 と し て ， 寒 天 培 地 に て 培 養 さ れ た 枯 草 菌 コ ロ ニ ー（ グ ラ ム 陽 性 菌 ）お よ び 大 腸 菌 コ ロ ニ ー（ グ ラ ム 陰 性 菌 ）（ 神

戸 大 学 大 学 院 農 学 研 究 科 河 野 潤 一 教 授 よ り 供 与 ）を ラ ッ ト の 組 織 に 対 し て お こ な っ た 方 法 と 同 様 の 方 法 で 固 定 お よ び パ ラ フ ィ ン 切 片 作 製 を お こ な っ た 。 5） グ ラ ム 陽 性 お よ び 陰 性 菌 の コ ロ ニ ー 数 の 定 量 組 織 学 的 観 察 法 グ ラ ム 陽 性 菌 お よ び 陰 性 菌 数 の 計 測 に つ い て は ， 油 浸 レ ン ズ （ 100 倍 ） を 装 着 し た 光 学 顕 微 鏡 下 で お こ な っ た 。 回 腸 の 腸 絨 毛 間 隙 を 頂 部 ， 中 部 お よ び 基 部 の 3 部 位 に 分 け ，そ れ ぞ れ の 部 位 か ら 40 箇 所 を 無 作 為 に 選 出 し て ，箇 所 毎 に お け る グ ラ ム 陽 性 な い し 陰 性 菌 の コ ロ ニ ー 数 を 計 測 し た 。 最 終 的 に そ れ ぞ れ の 部 位 に お け る グ ラ ム 陽 性 な い し 陰 性 菌 の コ ロ ニ ー 数 の 平 均 値 を 5 匹 の ラ ッ ト か ら 算 出 し た 。 6） 統 計 学 的 解 析 法 回 腸 に お け る グ ラ ム 陽 性 菌 お よ び 陰 性 菌 の コ ロ ニ ー 数 を 平 均 値 ± 標 準 偏 差 で 示 し た 。 さ ら に ， そ れ ぞ れ の 腸 絨 毛 間 隙 の 部 位 間 に お け る グ ラ ム 陽 性 菌 お よ び 陰 性 菌 の コ ロ ニ ー 数 の 比 較 に は Mann-Whitney の U 検 定 を 用 い た 。 有 意 水 準 は P＜ 0.05 と し た 。

II-3. 結 果

消 化 管 付 属 外 分 泌 腺 に お け る TLR の 分 布 に つ い て は ， 消 化 管 の 前 位 か ら 後 位 に 向 か っ て TLR ご と に 分 け ， 以 下 に 記 載 す る 。 1） 耳 下 腺 に お け る 各 種 TLR の 分 布 a） TLR-2 腺 房 細 胞 は TLR-2 陰 性 で あ っ た が ， 介 在 導 管 の 一 部 の 上 皮 細 胞 の 遊 離 縁 側 の 細 胞 膜 が 弱 陽 性 を 示 す と と も に ， 細 胞 質 が 顆 粒 状 な い し 小 胞 状 の 陽 性 を 示 し た (図 8a)。 線 条 導 管 の 一 部 の 導 管 上 皮 細 胞 が 遊 離 縁 側 の 細 胞 膜 で 弱 陽 性 を 示 し た が ， 基 底 側 の 細 胞 膜 お よ び 細 胞 質 は 陰 性 で あ っ た 。 導 管 の 内 腔 は 陰 性 で あ っ た 。 ま た ， 一 部 の 毛 細 血 管 の 内 皮 細 胞 で 陽 性 が み と め ら れ た が ， そ の 他 の 組 織 構 成 要 素 に 陽 性 は み ら れ な か っ た 。 b） TLR-4 腺 房 細 胞 お よ び 介 在 導 管 は TLR-4 陰 性 で あ っ た が ， 線 条 導 管 の 一 部 の 上 皮 細 胞 で は 遊 離 縁 側 お よ び 基 底 側 の 細 胞 膜 で 弱 陽 性 を 示 す と と も に ， 細 胞 質 で 微 顆 粒 状 の 陽 性 を 示 し た (図 8b)。 導 管 の 内 腔 は TLR-4 陰 性 で あ っ た 。 ま た ， ご く 一 部 の 毛 細 血 管 の 内 皮 細 胞 お よ び 一 部 の 遊 走 細 胞 の 細 胞 膜 が TLR-4 陽 性 で あ っ た が ， そ の 他 の 組 織 構 成 要 素 は 陰 性 で あ っ た 。 c） TLR-9 腺 房 細 胞 は TLR-9 陰 性 で あ っ た が ， 介 在 導 管 で は 一 部 の 上 皮 細 胞 の 遊 離 縁 側 の 細 胞 膜 が 弱 陽 性 を 示 す と と も に ， 細 胞 質 が 顆 粒 な い し は 小 胞 状 の 陽 性 を 示 し た (図 8c)。 線 条 導 管 の 一 部 の 上 皮 細 胞 で は ， 遊 離 縁 側 の 細

胞 膜 が 弱 陽 性 を 示 し た が ，基 底 側 の 細 胞 膜 お よ び 細 胞 質 は 陰 性 で あ っ た 。 ま た ， 導 管 の 内 腔 お よ び そ の 他 の 組 織 構 成 要 素 は 陰 性 で あ っ た 。 2） 下 顎 腺 に お け る 各 種 TLR の 分 布 す べ て の TLR が ， 漿 液 細 胞 ， 粘 液 細 胞 ， 導 管 上 皮 細 胞 お よ び 導 管 内 腔 の 内 容 物 で 陰 性 で あ っ た 。 ま た ， TLR-2 の み が 一 部 の 毛 細 血 管 の 内 皮 細 胞 で 陽 性 を 示 し た が ， そ の 他 の 組 織 構 成 要 素 や TLR で は 陰 性 で あ っ た 。 3） 舌 下 腺 に お け る 各 種 TLR の 分 布 a） TLR-2 一 部 の 粘 液 細 胞 の 分 泌 顆 粒 が TLR-2 陽 性 を 示 し た (図 9a)。 線 条 導 管 の 上 皮 細 胞 の 遊 離 縁 側 の 細 胞 膜 が 弱 陽 性 で あ っ た が ， 基 底 側 の 細 胞 膜 お よ び 細 胞 質 は 陰 性 で あ り ， 導 管 内 腔 の 内 容 物 も 陰 性 で あ っ た 。 ま た ， 一 部 の 毛 細 血 管 の 内 皮 細 胞 が 陽 性 を 示 し た が ， そ の 他 の 組 織 構 成 要 素 は 陰 性 で あ っ た 。 b） TLR-4 粘 液 細 胞 は TLR-4 陰 性 で ， 線 条 導 管 の 一 部 の 上 皮 細 胞 の 細 胞 質 は 微 顆 粒 状 に 陽 性 を 示 し た が ， 遊 離 縁 側 お よ び 基 底 側 の 細 胞 膜 は 陰 性 で あ っ た (図 9b)。 導 管 内 腔 の 内 容 物 は 陰 性 で あ っ た 。 ま た ， 一 部 の 毛 細 血 管 の 内 皮 細 胞 お よ び 一 部 の 遊 走 細 胞 に 陽 性 が み と め ら れ た が ， そ の 他 の 組 織 構 成 要 素 は 陰 性 で あ っ た 。 c） TLR-9 一 部 の 粘 液 細 胞 の 分 泌 顆 粒 が TLR-9 弱 陽 性 を 示 し た (図 9c)。 線 条 導 管 の 一 部 の 上 皮 細 胞 の 遊 離 縁 側 の 細 胞 膜 が 弱 陽 性 で あ っ た が ， 基 底 側 の 細