ラ ッ ト の 上 行 結 腸 に お け る 常 在 細 菌 の 詳 細 な 定 着 ・ 増 殖 部 位 お よ び 常 在 細 菌 の 腸 陰 窩 内 へ の 侵 入 に 対 す る 生 体 防 御 応 答 と 腸 表 面 上 皮 細 胞 に お け る 膜 型 T LR の 発 現 意 義 に つ い て 明 ら か に す る こ と を 目 的 と し て ， ラ ッ ト の 上 行 結 腸 に お け る 常 在 細 菌 の 分 布 を 精 査 す る と と も に ， 常 在 細 菌 の 定 着 部 位 と TLR の 局 在 と の 関 係 お よ び 腸 陰 窩 内 に お け る 常 在 細 菌 の 増 殖 と 細 胞 増 殖 と の 関 係 に つ い て 定 量 免 疫 組 織 学 的 に 調 べ た 。
そ の 結 果 ， 常 在 細 菌 は 腸 間 膜 非 付 着 部(M NM)に 比 べ て 腸 間 膜 付 着 部 (MAM )の 腸 表 面 上 皮 細 胞 に 優 先 的 に 接 着 し て お り ， 常 在 細 菌 の 侵 入 し た 腸 陰 窩 は M NM よ り も MAM で 頻 繁 に み と め ら れ た こ と か ら ，ラ ッ ト の 上 行 結 腸 に お け る 常 在 細 菌 の 基 本 的 な 定 着 部 位 は MAM の 腸 表 面 上 皮 細 胞 上 で あ る こ と が 確 認 さ れ た 。ま た ，T LR-2，-4 お よ び-9 の 陽 性 強 度 も MAM の 腸 表 面 上 皮 細 胞 の 線 条 縁 で は M NM に 比 べ て 著 し く 弱 か っ た 。以 上 の こ と か ら ，M AM の 腸 表 面 上 皮 細 胞 に お け る 膜 型 TLR の 低 発 現 が 常 在 細 菌 の 優 先 的 な 定 着 に 貢 献 し て い る 可 能 性 が 推 察 さ れ た 。M AM に お け る 常 在 細 菌 を 含 ま な い 腸 陰 窩(MAM -C)で は 常 在 細 菌 を 多 量 に 含 む 腸 陰 窩 (MAM-C -B)に 比 べ て 総 上 皮 細 胞 数 お よ び 微 絨 毛 円 柱 上 皮 細 胞 数 は 有 意 に 少 な か っ た も の の ， 杯 細 胞 数 に 有 意 な 差 が み と め ら れ な か っ た 。 さ ら に MAM -Cに お け る P CNA陽 性 を 示 す 微 絨 毛 円 柱 上 皮 細 胞 数 お よ び 杯 細 胞 数 は M AM -C-B に 比 べ て 有 意 に 少 な か っ た 。 こ れ ら の こ と か ら ，M AM で は 常 在 細 菌 が 腸 陰 窩 内 に 侵 入 す る と 腸 陰 窩 内 に お け る 上 皮 細 胞 の 細 胞 増 殖 が 亢 進 し て い る 可 能 性 が 推 察 さ れ た 。 ま た ，MAM-C と MAM -C-B で は 杯 細 胞 数 に 有 意 な 差 が み と め ら れ な か っ た が ，MAM-C -B で は MAM-C に 比 べ て PC NA 陽 性 杯 細 胞 の 相 対 頻 度 が 有 意 に 高 か っ た 。 こ の こ と か ら ， 常
在 細 菌 が 腸 陰 窩 内 に 侵 入 し ， 増 殖 す る と 杯 細 胞 の 細 胞 交 代 が 亢 進 し ， こ れ に 伴 う 粘 液 分 泌 の 亢 進 が 腸 陰 窩 内 に 侵 入 し た 常 在 細 菌 の 排 除 に 貢 献 し て い る 可 能 性 が 推 察 さ れ た 。
総 括
ラ ッ ト の 消 化 管 に お け る 常 在 細 菌 の 定 着 部 位 は 最 内 腔 側 の 粘 膜 上 皮 表 面 で あ り ， 小 腸 で は 腸 絨 毛 の 先 端 に 定 着 し た 常 在 細 菌 が 腸 絨 毛 の 間 隙 の 深 部 に 向 か っ て 増 殖 す る と さ れ る 。 小 腸 の 粘 膜 上 皮 細 胞 に 常 在 細 菌 が 接 着 す る と ， 遊 離 縁 側 の 細 胞 質 内 に 4 層 か ら な る 物 理 的 防 御 層 が 形 成 さ れ て 接 着 し た 常 在 細 菌 に 対 す る 物 理 的 排 除 が お こ な わ れ る こ と や ， 小 腸 の 腸 絨 毛 間 隙 へ の 常 在 細 菌 の 増 殖 に 伴 っ て 上 皮 細 胞 の 交 代 の 促 進 や 腸 陰 窩 底 部 に 存 在 す る パ ネ ー ト 細 胞 か ら の 抗 菌 物 質 の 一 過 性 の 分 泌 が 惹 起 さ れ る こ と か ら ， 粘 膜 上 皮 細 胞 の 表 面 に は 常 在 細 菌 を 認 識 す る 何 ら か の 受 容 体 が 存 在 す る 可 能 性 が 想 定 さ れ て き た が ，in vivo で は 明 ら か に さ れ て い な い 。 近 年 ， 細 菌 や ウ イ ル ス 由 来 の 構 成 成 分 で あ る 病 原 体 関 連 分 子 パ タ ー ン(PAMPs)を 認 識 す る 受 容 体 で あ る Toll -like receptor (TLR )が 注 目 さ れ て お り ，消 化 管 の 粘 膜 上 皮 細 胞 に TLR が 発 現 す る こ と が i n vit ro や 分 子 生 物 学 的 な 解 析 に よ っ て 明 ら か に さ れ て き た 。 さ ら に ， ヒ ト の 唾 液 ， 乳 汁 お よ び 血 漿 中 に は 分 泌 型 TLR の 存 在 が 明 ら か に さ れ て き て お り ， こ の 分 泌 型 TLR が リ ガ ン ド に 結 合 す る こ と に よ っ て 膜 型 T LR に よ る PAMPs の 認 識 を 調 節 す る こ と が 推 察 さ れ て い る 。 し た が っ て ， 消 化 管 粘 膜 に お け る 常 在 細 菌 の 増 殖 検 出 機 構 と し て 膜 型 お よ び 分 泌 型 TLR が 協 調 的 に 関 与 し て い る 可 能 性 が 想 定 さ れ る 。 そ こ で 本 論 文 で は ，T LR の 中 で も 細 菌 の 構 成 成 分 を 認 識 す る T LR-2，-4 お よ び-9 に 着 目 し ， ラ ッ ト の 消 化 器 系 を 実 験 モ デ ル と し て 常 在 細 菌 の 定 着 制 御 機 構 の 一 端 を TLR を 介 し た 常 在 細 菌 認 識 の 観 点 か ら 明 ら か に す る こ と を 目 的 と し た 。
第 I 章 で は ，ラ ッ ト 小 腸 の 粘 膜 上 皮 に お け る 常 在 細 菌 の 増 殖 を モ ニ タ リ ン グ す る 可 能 性 が 想 定 さ れ る TLR -2，-4 お よ び-9 の 局 在 を 免 疫 組 織 化 学
的 に 精 査 し た 。 そ の 結 果 ， 十 二 指 腸 で は 腸 絨 毛 基 部 か ら 頂 部 に か け て の 上 皮 細 胞 の 線 条 縁 が T LR-2，-4 お よ び-9 陽 性 を 示 し た が ， 空 腸 お よ び 回 腸 で は 腸 絨 毛 の 基 部 か ら 頂 部 の 上 皮 細 胞 の 線 条 縁 に TLR-2 の み が 陽 性 を 示 し た 。ま た ，小 腸 全 長 に わ た っ て 一 部 の 腸 絨 毛 の 先 端 に 線 条 縁 が TLR -2 陰 性 を 示 す 上 皮 細 胞 群 が 散 見 さ れ た 。 こ の T LR-2 陰 性 上 皮 細 胞 を 有 す る 腸 絨 毛 は ， 常 在 細 菌 の 増 殖 が み ら れ な い 部 位 に 比 べ て 常 在 細 菌 が 過 度 に 増 殖 し た 部 位 で 有 意 に 多 か っ た 。 さ ら に ， 絨 毛 円 柱 上 皮 細 胞 へ の 常 在 細 菌 の 接 着 は TLR -2 陰 性 上 皮 細 胞 の 存 在 し な い 腸 絨 毛 よ り も TLR -2 陰 性 上 皮 細 胞 を 有 す る 腸 絨 毛 で 有 意 に 多 か っ た 。以 上 の 第 I 章 の 所 見 か ら ，十 二 指 腸 に お け る TLR は 前 位 消 化 管 か ら 流 入 す る 細 菌 由 来 の リ ガ ン ド を 認 識 す る こ と に よ り ， 前 位 消 化 管 に 生 息 す る 常 在 細 菌 の 増 殖 を モ ニ タ リ ン グ し て い る 可 能 性 が 推 察 さ れ た 。 ま た ， 小 腸 全 域 に わ た っ て TLR -2 が 小 腸 の 粘 膜 上 に 定 着 し た 常 在 細 菌 の 増 殖 を モ ニ タ リ ン グ し て い る 可 能 性 が 推 察 さ れ る と と も に ， 腸 絨 毛 の 先 端 に お け る T LR-2 の 欠 損 が 常 在 細 菌 の 定 着 に 貢 献 し て い る こ と が 示 唆 さ れ た 。
第 II 章 で は ，膜 型 T LR に よ る リ ガ ン ド の 認 識 を 調 節 す る と 考 え ら れ て い る 分 泌 型 T LR の 消 化 管 内 へ の 分 泌 部 位 を 特 定 し ， 消 化 管 粘 膜 上 皮 に お け る 常 在 細 菌 の 検 知 機 構 へ の 分 泌 型 TLR の 関 与 を 明 ら か に す る た め ， 消 化 管 付 属 分 泌 腺 に お け る TLR の 局 在 を 免 疫 組 織 化 学 的 に 精 査 す る と と も に ， 小 腸 に お け る TLR 発 現 の 意 義 を 考 察 す る た め に ， 腸 絨 毛 間 隙 に 増 殖 す る 常 在 細 菌 の 性 状 を 定 量 組 織 学 的 に 調 べ た 。 そ の 結 果 ，TLR -2 は 舌 下 腺 ， 味 腺 ， 眼 窩 外 涙 腺 ， ハ ー ダ ー 腺 ， 胃 底 腺 ， 膵 臓 ， 小 腸 腸 陰 窩 お よ び 大 腸 腸 陰 窩 か ら ，TLR -4 は 味 腺 ， 眼 窩 外 涙 腺 ， ハ ー ダ ー 腺 ， 胃 底 腺 ， 膵 臓 ，小 腸 腸 陰 窩 お よ び 大 腸 腸 陰 窩 か ら ，そ し て T LR-9 は 舌 下 腺 ，味 腺 ， 眼 窩 外 涙 腺 ， ハ ー ダ ー 腺 ， 胃 底 腺 ， 膵 臓 ， 小 腸 腸 陰 窩 お よ び 大 腸 腸 陰 窩 か ら 分 泌 さ れ る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。こ れ ら の 観 察 結 果 と 第 章 の 結 果 と
を 併 せ 考 え る と ， ラ ッ ト の 前 位 消 化 管 に 生 息 す る 常 在 細 菌 か ら 遊 離 さ れ る リ ガ ン ド の 一 定 量 に 唾 液 ， 涙 液 な い し は 胃 液 に 含 ま れ る 分 泌 型 TLR が 結 合 し ， 前 位 消 化 管 内 に お い て 常 在 細 菌 が 過 度 に 増 殖 し て リ ガ ン ド の 量 が 一 定 量 を 越 え た 場 合 に の み 十 二 指 腸 の 絨 毛 円 柱 上 皮 に 発 現 す る 膜 型 TLR に よ っ て 検 出 さ れ て い る 可 能 性 が 考 え ら れ た 。 さ ら に ， 腸 絨 毛 の 間 隙 に 存 在 す る グ ラ ム 陽 性 菌 と 陰 性 菌 の コ ロ ニ ー 数 を 計 測 し た 結 果 ， グ ラ ム 陽 性 菌 の コ ロ ニ ー 数 は 腸 絨 毛 間 隙 の 頂 部 と 中 部 で は グ ラ ム 陰 性 菌 に 比 べ て 有 意 に 多 か っ た の に 対 し て ， 腸 絨 毛 間 隙 の 基 部 で は 減 少 し た こ と か ら ，TLR -2 の リ ガ ン ド で あ る peptidogl ycan を 細 胞 壁 の 最 外 層 に 多 量 に 有 す る グ ラ ム 陽 性 菌 が T LR-2 に よ っ て 惹 起 さ れ る 生 体 防 御 応 答 に よ っ て グ ラ ム 陰 性 菌 よ り も 容 易 に 排 除 さ れ る こ と が 示 唆 さ れ ， こ の こ と が 前 位 消 化 管 か ら 後 位 消 化 管 に か け て グ ラ ム 陽 性 菌 と 陰 性 菌 の 優 位 性 が 逆 転 す る 要 因 の 一 つ で あ る 可 能 性 が 考 え ら れ た 。 ま た ， 回 腸 に お け る 常 在 細 菌 の 増 殖 と T LR の 分 泌 の 関 係 を 調 べ た 結 果 ， 常 在 細 菌 の 増 殖 し て い な い 部 位 の 一 部 の パ ネ ー ト 細 胞 に は T LR-4 陽 性 の 分 泌 顆 粒 が 多 数 存 在 し た が ， 常 在 細 菌 が 増 殖 し た 部 位 の パ ネ ー ト 細 胞 で は TLR -4 陽 性 顆 粒 が 減 少 し ， TLR -4 膜 陽 性 の 空 胞 が 出 現 す る こ と 等 ， 顆 粒 の 分 泌 を 示 唆 す る 所 見 が 得 ら れ た こ と か ら ， 回 腸 に お い て 常 在 細 菌 の 増 殖 に 伴 い ， 一 過 性 に パ ネ ー ト 細 胞 よ り 分 泌 さ れ る 各 種 抗 菌 物 質 に よ っ て 菌 体 よ り 溶 出 さ れ る リ ガ ン ド を ， 同 時 に 分 泌 さ れ る 分 泌 型 T LR が 結 合 し て 中 和 し ， 大 腸 に お け る 常 在 細 菌 に 対 す る 過 剰 な 排 除 応 答 を 調 節 し て い る 可 能 性 が 考 え ら れ た 。
第 III 章 で は ，ラ ッ ト の 上 行 結 腸 に お け る 常 在 細 菌 の 詳 細 な 定 着 ・ 増 殖 部 位 お よ び 常 在 細 菌 の 腸 陰 窩 内 へ の 侵 入 に 対 す る 生 体 防 御 応 答 と 腸 表 面 上 皮 細 胞 に お け る 膜 型 TLR の 発 現 の 意 義 に つ い て 明 ら か に す る こ と を 目 的 と し て ， ラ ッ ト の 上 行 結 腸 に お け る 常 在 細 菌 の 分 布 を 精 査 す る と と も に ， 常 在 細 菌 の 定 着 部 位 と TLR の 局 在 と の 関 係 お よ び 腸 陰 窩 内 に お け る
常 在 細 菌 の 増 殖 と 細 胞 増 殖 と の 関 係 に つ い て 調 べ た 。 そ の 結 果 ， 常 在 細 菌 は 腸 間 膜 非 付 着 部(MNM )よ り も 腸 間 膜 付 着 部(MAM)の 腸 表 面 上 皮 細 胞 上 に 頻 繁 に 接 着 し て お り ，MNM よ り も M AM で 腸 陰 窩 内 の 常 在 細 菌 の 増 殖 が 高 頻 度 で み と め ら れ た 。ま た ，MAM の 常 在 細 菌 が 存 在 し な い 腸 陰 窩 と 多 量 に 存 在 す る 腸 陰 窩 を 比 較 す る と ， 腸 陰 窩 の 上 皮 細 胞 総 数 お よ び 微 絨 毛 円 柱 上 皮 細 胞 数 は 常 在 細 菌 の 多 い 腸 陰 窩 で 有 意 に 多 か っ た が ， 杯 細 胞 数 に 有 意 な 差 が み ら れ な か っ た 。ま た ，MAM に お け る PCNA 陽 性 微 絨 毛 円 柱 上 皮 細 胞 数 お よ び 杯 細 胞 数 は 常 在 細 菌 の 存 在 し な い 腸 陰 窩 に 比 べ て 常 在 細 菌 の 多 い 腸 陰 窩 で 有 意 に 多 か っ た 。 さ ら に 腸 表 面 上 皮 細 胞 の 線 条 縁 に お け る TLR -2，-4 お よ び-9 の 陽 性 強 度 は ，MNM よ り も MAM で 著 し く 弱 か っ た 。 以 上 ，第 III 章 に お け る 観 察 結 果 か ら ，ラ ッ ト の 上 行 結 腸 に お け る 常 在 細 菌 の 基 本 的 な 定 着 部 位 は M AM の 腸 表 面 上 皮 細 胞 表 面 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た 。ま た ，M AM の 腸 表 面 上 皮 細 胞 に お け る 膜 型 TLR の 低 発 現 が 常 在 細 菌 の 優 先 的 な 定 着 に 貢 献 し て い る 可 能 性 が 推 察 さ れ た 。 加 え て ，M AM の 腸 陰 窩 内 に 常 在 細 菌 が 侵 入 す る と 杯 細 胞 を 含 め た 上 皮 細 胞 の 細 胞 交 代 が 促 進 す る と と も に ， こ れ に 伴 う 粘 液 分 泌 の 促 進 が ， 腸 陰 窩 内 に 侵 入 し た 常 在 細 菌 の 排 除 に 貢 献 し て い る 可 能 性 が 推 察 さ れ た 。
以 上 の 結 果 を 総 合 す る と ， 本 学 位 論 文 で は ラ ッ ト の 小 腸 と 上 行 結 腸 の 粘 膜 上 皮 に お け る TLRの 発 現 状 況 お よ び 分 泌 型 T LRを 分 泌 す る 消 化 管 付 属 外 分 泌 腺 を 特 定 す る こ と が で き た 。 ま た ， ラ ッ ト の 消 化 管 で は ， 多 く の 消 化 管 付 属 外 分 泌 腺 か ら 分 泌 型 TLR が 分 泌 さ れ る こ と に よ っ て ， 消 化 管 内 に 存 在 す る 常 在 細 菌 へ の 過 剰 な 生 体 防 御 応 答 を 抑 制 す る こ と に 加 え ， 粘 膜 上 皮 上 に 発 現 す る TLR の 発 現 量 を 調 節 す る こ と に よ っ て 常 在 細 菌 の 定 着 部 位 を 提 供 す る が ， 常 在 細 菌 が 過 度 に 増 殖 し た 場 合 に の み 粘 膜 上 皮 に 発 現 し た 膜 型 TLR を 介 し て 生 体 防 御 応 答 を 亢 進 さ せ る 可 能 性 が 明 ら か に な っ た 。