動物モデルによる非アルコール性脂肪肝炎の病態生理に関する研究

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動物モデルによる非アルコール性脂肪肝炎の病態生理に関する研究

Studies on the pathophysiology of nonalcoholic steatohepatitis

using animal models

2021 年 2 月

斉藤友幸

Tomoyuki SAITO

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動物モデルによる非アルコール性脂肪肝炎の病態生理に関する研究

Studies on the pathophysiology of nonalcoholic steatohepatitis

using animal models

2021 年 2 月

早稲田大学大学院先進理工学研究科生命理工学専攻分子生理学研究

斉藤友幸

Tomoyuki SAITO

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i

略語一覧

AASLD American Association for the Study of Liver Diseases（米国肝臓学会）

Acaca acetyl-CoA carboxylase-α Acta2 α-smooth muscle actin Actb β-actin

ALT alanine aminotransferase（アラニンアミノトランスフェラーゼ）

AMLN Amylin Liver NASH

ASK1 apoptosis signal-regulating kinase 1

（アポトーシスシグナル調節キナーゼ1） AST aspartate aminotransferase

（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）

AUROC area under the receiver operating characteristic curve

（受信者動作特性曲線下面積）

Bambi BMP and activin membrane bound inhibitor BMI body mass index（体格指数）

Ccl2 C-C motif chemokine ligand 2 CCl4 carbon tetrachloride（四塩化炭素）

CCR C-C chemokine receptor（C-Cケモカイン受容体）

CDAA choline-deficient, L-amino acid-defined

（コリン欠乏メチオニン減量アミノ酸）

CDAHFD choline-deficient, L-amino acid-defined, high-fat diet

（コリン欠乏高脂肪メチオニン減量食）

cDNA complementary deoxyribonucleic acid（相補的デオキシリボ核酸）

Col1a1 collagen type I-α1 CVC cenicriviroc

CYP2E1 cytochrome P450 2E1（シトクロムP450 2E1）

DEN diethylnitrosamine（ジエチルニトロソアミン）

DM diabetes mellitus（糖尿病）

(7)

II DNA deoxyribonucleic acid（デオキシリボ核酸）

DPP4 dipeptidyl peptidase 4（ジペプチジルペプチダーゼ4） DYSF dystrophy-associated fer-1-like protein；dysfelin

ELISA enzyme-linked immunosorbent assay（酵素結合免疫吸着測定法）

Fasn fatty acid synthase

FDA Food and Drug Administration（米国食品医薬品局）

FXR farnesoid X receptor（ファルネソイドX受容体）

GAPDH glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase

（グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ）

GCKR glucokinase gene regulator

GWAS genome-wide association study（ゲノムワイド関連解析）

HE hematoxylin-eosin（ヘマトキシリン・エオジン）

4-HNE 4-hydroxynonenal（4-ヒドロキシノネナール）

HVPG hepatic venous pressure gradient（肝静脈圧較差）

IFG impaired fasting glucose（空腹時高血糖）

JNK c-Jun N-terminal kinase（c-Jun N末端キナーゼ）

LPAAT lysophosphatidic acid acyltransferase

（リゾフォスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ）

LDL low density lipoprotein（低比重リポタンパク質）

LDLC low density lipoprotein cholesterol

（低比重リポタンパク質コレステロール）

MBOAT7 membrane bound O-acyltransferase domein containing 7 M2BPGi Mac-2 binding protein glycosylation isomer

（Mac-2結合蛋白糖鎖修飾異性体）

MCD methionine-choline deficient（メチオニン・コリン欠乏）

Mc4r melanocortin receptor 4（メラノコルチン4受容体）

MELD model for end-stage liver disease（末期肝疾患モデル）

MGB Minor Groove Binder

miRNA micro ribonucleic acid（マイクロリボ核酸）

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III mRNA messenger ribonucleic acid（伝令リボ核酸）

MRE magnetic resonance elastography（磁気共鳴エラストグラフィ）

MRI-PDFF magnetic resonance imaging - proton density fat fraction

（磁気共鳴画像－プロトン密度脂肪画分測定法）

MRS magnetic resonance spectroscopy（磁気共鳴スペクトロスコピー）

Mttp microsomal triglyceride transfer protein；MTP NADH reduced nicotinamide adenine dinucleotide

（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）

NAFL nonalcoholic fatty liver（非アルコール性脂肪肝）

NAFLD nonalcoholic fatty liver disease（非アルコール性脂肪肝疾患）

NAS NAFLD activity score

NASH nonalcoholic steatohepatitis（非アルコール性脂肪肝炎）

OCA obeticholic acid

PCR polymerase chain reaction（ポリメラーゼ連鎖反応）

PEMT phosphatidylethanolamine N-methyltransferase MAPK mitogen-activated protein kinase

（分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ）

PNPLA3 patatin-like phospholipase domain containing 3 protein PPAR peroxisome proliferator-activated receptor

（ペルオキシゾーム増殖因子活性化受容体）

Pten phosphatase and tensin homolog

ROS reactive oxygen species（活性酸素種）

SCD1 stearoyl CoA desaturase 1（ステアロイルCoAデサチュラーゼ1）

SD standard diet（標準飼料）

SDT Spontaneously Diabetic Torii

Srebf1 sterol regulatory element binding transcription factor 1 SREBP sterol regulatory element-binding protein

（ステロール調節配列結合タンパク質）

STAM Stelic Animal Model

STZ streptozotocin（ストレプトゾトシン）

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IV TAA thioacetamide（チオアセタミド）

TC total cholesterol（総コレステロール）

TG triglyceride（トリグリセリド）

Tgfb1 transforming growth factor-β1；TGF-β1

THR-β thyroid hormone receptor-β（甲状腺ホルモン受容体β） Timp1 tissue inhibitor of metalloproteinase 1

TLR4 Toll-like receptor 4（Toll様受容体4） TM6SF2 transmembrane 6 superfamily member 2 Tnf tumor necrosis factor

VLDL very low density lipoprotein（超低比重リポタンパク）

WD western diet（西洋型飼料）

ZF Zucker fatty

ZL Zucker lean

※ 遺伝子名は米国国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information；NCBI）に登録されているOfficial Symbolにて表記した。

(10)

V

図表一覧

第1章

図1-1 NAFLD／NASHの進展

図1-2 肝線維化とNAFLD／NASH患者の予後図1-3 NAFLD／NASHにおける肝臓病理所見

図1-4 NAFLD／NASHにおける肝線維化の病理所見図1-5 肥満とNAFLDの関連

図1-6 Multiple parallel hits hypothesis

図1-7 NAFLD／NASHにおける細胞外小胞の関与

図1-8 NASHに対する第3相試験を実施した又は実施中の薬剤図1-9 NASH治験薬の作用機序

表1-1 Matteoni分類表1-2 Brunt分類

表1-3 NAFLD activity score

表1-4 FIB4 index及びNAFLD fibrosis score

第2章

表2-1 NAFLD／NASH動物モデルの特徴

第3章

図3-1 実験方法の概略

図3-2 STAM，高脂肪食，STZ及び正常マウスにおける体重及び血液生化学値

(11)

VI の経時変化

図3-3 STAM，高脂肪食，STZ及び正常マウスにおける肝臓重量，肝臓中脂質含量及び肝臓遺伝子発現量の経時変化

図3-4 STAM，高脂肪食，STZ及び正常マウスにおける肝臓のHE染色像及びヘキサノイルリジン免疫組織化学染色像

図3-5 STAM，高脂肪食，STZ及び正常マウスにおける肝臓のシリウスレッド染色像

表3-1 STAM，高脂肪食，STZ及び正常マウスにおける肝臓の病理組織学的所見

第4章

図4-1 実験方法の概略

図4-2 ZF-SDラット，ZF-WDラット，ZL-SDラット及びZL-WDラットにおける摂取カロリー及び体重の経時変化

図4-3 ZF-SDラット，ZF-WDラット，ZL-SDラット及びZL-WDラットにおける血液生化学値の経時変化

図4-4 ZF-SDラット，ZF-WDラット，ZL-SDラット及びZL-WDラットにおける肝臓のHE染色像

図4-5 ZF-SDラット，ZF-WDラット，ZL-SDラット及びZL-WDラットにおける肝臓のシリウスレッド染色像

図4-6 ZF-SDラット，ZF-WDラット，ZL-SDラット及びZL-WDラットにおける肝臓の4-ヒドロキシノネナール免疫組織化学染色像

図4-7 ZF-SDラット，ZF-WDラット，ZL-SDラット及びZL-WDラットにお

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VII ける肝臓の遺伝子発現量

表4-1 ZF-SDラット，ZF-WDラット，ZL-SDラット及びZL-WDラットにおける肝臓の病理組織学的所見

第5章

図5-1 STAMマウスにおけるNASH発症の肝病態生理

図5-2 Zucker fattyラットへの西洋型飼料給餌によるNASH様肝病変の誘発

(13)

1

第 1 章緒論

1-1. NAFLD／NASH の概説

非アルコール性脂肪肝疾患（nonalcoholic fatty liver disease；NAFLD）は飲酒歴が乏しいにも関わらず脂肪肝を呈する進行性の肝疾患である。近年，糖尿病や肥満等の生活習慣病を背景として世界的に患者が急増している疾患であり，

北米では慢性肝障害の原因として最も多い（Chalasani et al., 2018）。NAFLDは肝細胞に脂肪が沈着した非アルコール性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver；

NAFL）と，炎症及び肝細胞傷害を発症している非アルコール性脂肪肝炎

（nonalcoholic steatohepatitis；NASH）に分類されるが，臨床的に重要な疾患は一部の症例が肝硬変や肝細胞癌へ進行することがあるNASHである（Malik et al., 2009；Ertle et al., 2011）（図1-1）。しかし，近年，NAFLDの予後を規定する因子はNASH診断ではなく，肝線維化の重症度であることが明らかとなり

（Angulo et al., 2015；Loomba and Chalasani, 2015；Dulai et al., 2017；Hagström

et al., 2017）（図1-2），また，肝生検を2回検討した報告により，NAFLから

NASHや肝線維化が進行した症例が少なからず存在することが示された

（McPherson et al., 2015；Singh et al., 2015）。これらのことから，NAFLと NASHは異なる疾患ではなくNAFLDにおける異なる病期であり，相互移行するという認識に変遷しつつある。

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2 図 1-1 NAFLD／NASHの進展

非アルコール性脂肪肝疾患（nonalcoholic fatty liver disease；NAFLD）は肝細胞に脂肪が沈着した非アルコール性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver；NAFL）と，炎症及び肝細胞傷害を発症した非アルコール性脂肪肝炎（nonalcoholic steatohepatitis；NASH）に分類される。

NAFLDの一部の患者は線維化により肝硬変へ進行したり，肝細胞癌を発症する。Cohen

et al., Science 2011より改変。

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3 図 1-2 肝線維化とNAFLD／NASH患者の予後

(A) NAFLD患者において，非NASHで肝線維化がある患者（緑線）は非NASHで肝線維化がない患者（青線）よりも生存率が低い（p = 0.001）。また，NASHで肝線維化がある患者（赤線）はNASHで肝線維化がない患者（黄線）よりも同様に生存率が低い

（p = 0.018）。このように肝線維化があるNAFLD患者では，NASHの有無にかかわらず生存率が低い。Angulo et al., Gastroenterology 2015より改変。(B) NAFLD患者の生存率は肝線維化ステージ（F0，F1，F2，F3，F4）に応じて悪化する。ControlsはNAFLD患者と性別・年齢・居住地域をマッチさせた非NAFLDの対照母集団。Hagström et al., J Hepatol.

2017より改変。

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4 1-2. NAFLD／NASH の疫学

1-2-1. NAFLDの有病率

NAFLDの有病率は全人口の約25%と報告されているが，国や地域においてばらつきが大きい（Younossi et al., 2016）。例えば，日本では9～30%（Jimba et al., 2005；Hashimoto and Tokushige, 2011；Eguchi et al., 2012）であるが，欧米 諸国では20～40%（Angulo, 2007；Radu et al., 2008；Williams et al., 2011； Vernon et al., 2011）と日本よりも高頻度である。NAFLDの有病率の性差には一定の見解は得られていないが，日本において男性は中年層，女性は高齢層において多い傾向がある（Jimba et al., 2005；Hashimoto and Tokushige, 2011）。 NAFLDの有病率は日本を含め全世界的に増加傾向にあり，推定有病率は2000

～2005年において20.13%，2011～2015年において26.80%と増加している

（Younossi et al., 2016）。NAFLDは肥満との関連が強いことが報告されており

（Eguchi et al., 2012），全世界的な肥満人口の増加に伴ってNAFLDの有病率が増加していると考えられる。

1-2-2. NASHの有病率

NASHの有病率については，NASH疑いの患者すべてが肝生検を受けられるわけではないため正確な把握は困難であるが，全人口の3～5%と推定されている（Williams et al., 2011；Vernon et al., 2011）。また，NAFLD有病率の増加に伴ってNASH有病率も増加していると推定される（Fan and Farrell, 2009；Vernon et al., 2011）。

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5 1-3. NAFLD／NASH の診断

1-3-1. NAFLD／NASHの診断基準

米国肝臓学会（American Association for the Study of Liver Diseases；AASLD）

ガイドライン（Chalasani et al., 2018）及び日本消化器病学会ガイドライン（日本消化器病学会（編），2014）によると，①アルコール摂取量が男性で30 g／

日，女性で20 g／日未満，②肝組織検査又は画像検査で脂肪肝を認める，③肝疾患の原因となる他の要因がない，の3項目を満たすとNAFLDと診断される。NAFLDと診断された場合，NAFLかNASHの鑑別は肝生検による病理診断によってのみ可能である。NASHの病理所見は肝細胞における大滴性の脂肪沈着（肝細胞の5%以上），小葉内における炎症細胞の浸潤，肝細胞の傷害性変化である風船様変性等の特徴を有する（図1-3）。

(18)

6

(A) (C)

(B)

図 1-3 NAFLD／NASHにおける肝臓病理所見

(A) 主に小葉中心域に見られる大滴性の脂肪沈着。マッソントリクローム染色像。スケールバー = 100 μm。(B) 小葉中心性の炎症細胞集簇巣（黒矢印）。ヘマトキシリン・エオジン染色像。スケールバー = 50 μm。(C) 肝細胞の風船様変性（黒矢印）及びマロリー・デンク体（白矢印）。風船様変性は肝細胞の細胞骨格形成不全により細胞質が膨化している。マロリー・デンク体は肝細胞質内に認められる好酸性の細胞内封入体。ヘマトキシリン・エオジン染色像。スケールバー = 20 μm。Takahashi and Fukusato, World J Gastroenterol.

2014より改変。

1-3-2. NAFLD／NASHの病理分類

NAFLD／NASHの病理分類に関してはMatteoni分類（Matteoni et al., 1999）， Brunt分類（Brunt et al., 1999），NAFLD activity score（NAS）（Kleiner et al., 2005）等がよく用いられている。Matteoni分類は脂肪沈着のみをtype 1，脂肪沈着に加えて小葉内に炎症細胞浸潤が認められるものをtype 2，脂肪沈着に加えて肝細胞の風船様変性が認められるものをtype 3，type 3の所見に加えて肝

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7 線維化又はマロリー・デンク体が認められるものをtype 4とし，type 1及び2 をNAFL，type 3及び4をNASHと診断する（表1-1）。しかし，Matteoni分類はNASHの重症度（線維化の程度）が反映されておらず，肝細胞の風船様変性の診断所見に明確な基準がない，といった欠点がある。Brunt分類はNASHの病理学的重症度を分類する方法として用いられており，NASHを組織学的に grading（活動性）とstaging（病期）により分類する。Gradingは，脂肪沈着，

肝細胞風船様変性，小葉及び門脈域内の炎症細胞浸潤の程度を総合的に判断し，軽症，中等症，重症の3段階に分類する。Stagingは線維化の進展の程度を分類するもので，stage 1は小葉中心性の線維化，stage 2は小葉中心域と門脈域の線維化，stage 3は架橋形成（bridging fibrosis），stage 4は肝硬変の各病理所見により定義される（表1-2，図1-4）。ただし，Brunt分類はNASHのみを対象としている，小児や超肥満成人の場合は線維化が門脈域から始まるために評価が困難である，といった欠点がある。NASはスコアリングによるNAFLD／ NASHの病理診断方法である。脂肪化の程度を0～3点，小葉内炎症の程度を0

～3点，肝細胞風船様変性の程度を0～2点にスコア化し，合計点をNASとする。NASが2点以下はnon-NASH，3～4点はborderline-NASH，5点以上は NASHとして診断する（表1-3）。ただし，NASには線維化が評価項目に入っていない，NAS 5点以上でも75%のNASH患者しか診断できず感度が低い

（Brunt et al., 2011）ことが問題である。

(20)

8 表 1-1 Matteoni分類

分類組織所見診断

Type 1 脂肪沈着 NAFL

Type 2 脂肪沈着＋小葉内炎症 NAFL

Type 3 脂肪沈着＋肝細胞風船様変性 NASH

Type 4 Type 3＋線維化又はマロリー・デンク体 NASH

表 1-2 Brunt分類

活動性

（grading）脂肪化風船様変性小葉炎症門脈域炎症 Grade 1

（軽症）

66%まで時々zone 3に認める

軽度な好中球，リンパ球浸潤

認めない又は軽度 Grade 2

（中等症）

種々の程度

明らかにzone 3 に認める

風船様変性に伴う慢性好中球浸潤

軽度から中等度 Grade 3

（重症）

小葉全体高度にzone 3に認める

風船様変性及び類洞周囲線維化に伴うzone 3における強い好中球浸潤

軽度から中等度

病期（staging）

Stage 1 Zone 3の線維化

Stage 2 Zone 3＋門脈域の線維化 Stage 3 線維性架橋形成

Stage 4 肝硬変 Zone 3；小葉中心域

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9 図 1-4 NAFLD／NASHにおける肝線維化の病理所見

マッソントリクローム染色像。Albhaisi and Sanyal, Pharmaceut Med. 2019より改変。

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10 表 1-3 NAFLD activity score

項目定義点数

脂肪化 5%未満 0 5%～33% 1 33%～66% 2 66%以上 3

小葉内炎症病巣なし 0

200倍の視野で2カ所未満の病巣 1

200倍の視野で2～4カ所の病巣 2

200倍の視野で4カ所を超える病巣 3

肝細胞風船様変性なし 0

少数 1 多数 2

NAFLD activity score 合計 0～8

診断 Non-NASH 2点以下

Borderline-NASH 3～4点

NASH 5点以上

1-3-3. NAFLD／NASHの病理学的検査

病理学的検査によるNASHの確定診断に必須である肝生検は侵襲性の高い高額な検査であり，繰り返し採取することが困難で，合併症のリスクを伴う

（Bravo et al., 2001；Van der Poorten et al., 2006；Cadranel et al., 2000）。また，肝臓をサンプリングする場所によって診断が異なってしまうサンプリングエラーや病理医間での診断誤差があることが指摘されている（Ratziu et al., 2005； Hashimoto et al., 2015；Fukusato et al., 2005）。したがって，NASH疑いのある

NAFLDの全症例に対して肝生検を実施することは困難である。そのため，肝

生検は線維化の進行が疑われる症例や他の慢性肝疾患との鑑別が困難な症例に

(23)

11 対して行うことが推奨されている。そこで，肝生検に代わる検査法が線維化進行例の拾い上げに使用されている。

1-3-4. NAFLD／NASHの肝線維化に対する血清学的検査

保険適用されている臨床検査のうち，肝線維化に対する血清学的検査として用いられているものには，IV型コラーゲン7S，Mac-2結合蛋白糖鎖修飾異性体（Mac-2 binding protein glycosylation isomer；M2BPGi），オートタキシン，ヒアルロン酸，III型プロコラーゲンN末端ペプチド，アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（aspartate aminotransferase；AST）／アラニンアミノトランスフェラーゼ（alanine aminotransferase；ALT）比，血小板数等がある。特に，

肝線維化ステージ3及び4の高度線維化を有するNAFLD症例において，

M2BPGiの診断能は受信者動作特性曲線下面積（area under the receiver operating characteristic curve；AUROC）0.876と良好であることが報告されている（Abe

et al., 2015）。しかし，M2BPGi等の肝線維化マーカーは通常の検査では測定さ

れず，高コスト等の課題があることから，一般診療の検査値から計算されるスコアリングシステムがスクリーニングとして有用である。頻用されるのはFIB4 index及びNAFLD fibrosis scoreであり，FIB4 indexは年齢，AST値，ALT値及び血小板数から，NAFLD fibrosis scoreは年齢，体格指数（body mass index； BMI），AST／ALT比，空腹時高血糖又は糖尿病の有無，血小板数及びアルブミン値からそれぞれ算出される（表1-4）。FIB4 index及びNAFLD fibrosis scoreの高度線維化を有するNAFLD患者の診断能はAUROC 0.84であり，他のスコアリングシステムより高値である（Xiao et al., 2017）。

(24)

12 表 1-4 FIB4 index及びNAFLD fibrosis score

計算式カットオフ値

FIB4 index

（AST (IU/L)×年齢 (歳)）／

（血小板数 (10⁹/L)）×√ALT (IU/L)）

1.30未満（低リスク）

2.67より大（高リスク）

NAFLD fibrosis score

−1.675＋0.037×年齢 (歳)＋0.094×BMI (kg/m²)

＋1.13×IFG/DM (yes = 1, no = 0)＋0.99×AST／ALT比

－0.013×血小板数 (10⁹/L)－0.66×アルブミン (g/dL)

−1.455未満（低リスク）

0.676より大（高リスク）

IFG/DM（impaired fasting glucose/diabetes mellitus；空腹時高血糖又は糖尿病）

1-3-5. NAFLD／NASHの肝線維化に対する画像検査

肝線維化の画像検査法としては超音波による肝弾性度測定装置であるフィブロスキャンが安価で有用であるが，線維化が進行した症例しか検出できない

（Hannah and Harrison, 2016）。一方，磁気共鳴エラストグラフィ（magnetic resonance elastography；MRE）はフィブロスキャンより感度よく線維化を検出することができ，高度肥満者でも測定可能であり，観察者の違いによるばらつきも小さい。また，MREは高度線維化を有するNAFLD患者の診断能が AUROC 0.96と極めて高く，高い診断能を有する（Xiao et al., 2017）。しかし，

MREは高額で設置施設が限られている。

1-3-6. NAFLD／NASHの低侵襲的肝線維化検査法の問題点

1-3-4項及び1-3-5項でそれぞれ示した血清学的検査及び画像検査は低侵襲性であり，特に血清学的検査は簡易に行えるメリットがある。しかし，いずれも十分な妥当性確認試験を経てNASH肝線維化のサロゲートマーカーとして確立されたものではない。NAFLD／NASHの分子メカニズムを解明し，感度の高い非侵襲的なNASH及び肝線維化の特異的バイオマーカーを開発するためのさら

(25)

13 なる研究が必要である。

1-4. NAFLD／NASH の病因

1-4-1. NAFLD／NASHの遺伝学的素因

NAFLD／NASHの遺伝的素因にはゲノムワイド関連解析（genome-wide association study；GWAS）により，PNPLA3（patatin-like phospholipase domain containing 3 protein），TM6SF2（transmembrane 6 superfamily member 2），GCKR

（glucokinase gene regulator），MBOAT7（membrane bound O-acyltransferase domein containing 7），DYSF（dystrophy-associated fer-1-like protein；dysfelin）， PEMT（phosphatidylethanolamine N-methyltransferase）等の遺伝子多型が関与していることが示唆される。PNPLA3 I148M変異（rs738409）はNAFLD／NASH 発症に関与する感受性遺伝子として2008年に世界で初めて報告された（Romeo

et al., 2008）。PNPLA3 I148M変異は日本人においても有意な関連があり，層別

解析によりMatteoni分類type 4に強い相関が認められたことから，NASH病態進展に関与することが明らかとなっている（Kawaguchi et al., 2012）。PNPLA3 はリゾフォスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（lysophosphatidic acid acyltransferase；LPAAT）として機能し，そのI148M変異はLPAAT活性の上昇をもたらして肝脂肪化に関与すると考えられている。PNPLA3 I148M変異は非肥満の健常者及び肥満のNAFLD患者よりも非肥満のNAFLD患者で多く観察され（Zou et al., 2020），日本人においても，肥満の人より非肥満の人において

PNPLA3 I148M変異保因者のNAFLD有病率が有意に高い（Nishioji et al.,

2015）。また，欧米人に比較して日本人ではPNPLA3 I148M変異（GG型）保因率が高く，その率はイギリス人が5%であるのに対して日本人では21%である

（Liu et al., 2014；Nishioji et al., 2015）。したがって，日本人はPNPLA3による

(26)

14 遺伝的リスクが高く，非肥満者においてもNAFLD／NASHを発症しやすいと考えられる。日本人においてはPNPLA3以外にもGCKR，DYSF（Kawaguchi et al., 2018），PEMT（Tan et al., 2016）の遺伝子変異がNAFLD発症に関連することがGWASにより示唆されている。

1-4-2. NAFLD／NASHにおける生活習慣病の関与

NAFLDの病因には上記の遺伝的素因に加えて，生活習慣病である肥満，イ

ンスリン抵抗性，糖尿病，脂質異常症，高血圧等が関与すると考えられるが

（de Alwis and Day, 2008；Falck-Ytter et al., 2001），NAFLD／NASH発症において最も重要な因子は肥満である（図1-5）。NAFLDの有病率と肥満の程度は関連しており，高度肥満例では90%以上の症例がNAFLDと診断される（Eguchi

et al., 2012）。また，NAFLD／NASH患者の内臓脂肪量と肝細胞内脂肪量には正

の相関がある（Koda et al., 2007）。ただし，非肥満例においても7～20%の NAFLD／NASH患者がおり，特にアジアにおいて多い傾向がある（Fan et al., 2017；Wei et al., 2015）。

(27)

15 図 1-5 肥満とNAFLDの関連

BMIが増加すると男性及び女性のいずれにおいてもNAFLD有病率が増加する。Eguchi

et al., J Gastroenterol. 2012より改変。

背景疾患としては2型糖尿病がNAFLD／NASHの発症及び進展と強く関連しており（El-Serag et al., 2004；Wanless and Lentz, 1990），糖尿病患者の50～ 70%程度の症例がNAFLDと診断され（Eguchi et al., 2012；Kwok et al., 2016），さらに18%の症例に肝線維化を認める（Kwok et al., 2016）。

1-4-3. NASH発症のメカニズム

NAFLDの一部の症例がNASHへ進行する機序は，従来，肝細胞に脂肪沈着が起こるfirst hitに，肝細胞変性，炎症，線維化を引き起こす種々の要因が second hitとして加わることでNASHに至るtwo hit theoryで説明されてきた

（Day and James, 1998）。Second hitとしては酸化ストレス，小胞体ストレス，

アディポサイトカイン，インスリン抵抗性，脂肪毒性，ミトコンドリア機能異常，オートファジー，腸内細菌叢，鉄等が挙げられる。しかし，実際には，必

(28)

16 ずしもすべての症例がNAFLを経由せず，炎症が脂肪化と同時又は先行することがある等，矛盾点があることから，複数の因子が並行して肝の脂肪化，炎症，線維化進展に作用することでNASHを発症するmultiple parallel hits

hypothesisが提唱され（Tilg and Moschen, 2010；Buzzetti et al., 2016），広く受け入れられている（図1-6）。肝臓と脂肪組織，腸管等他の臓器との相互作用によって，酸化ストレス，小胞体ストレス，ミトコンドリア機能異常，オートファジー，サイトカイン／アディポサイトカイン，腸内細菌叢の変化に伴う自然免疫系の賦活等が同時進行的に肝臓に作用しながら，NAFLD／NASH病態が惹起されると考えられている。例えば，酸化ストレスについては脂質の過剰摂取による肝臓への脂質流入の増加が関与することが報告されている。遊離脂肪酸の流入増加は肝細胞のミトコンドリアにおけるβ酸化活性に対して過負荷を引き起こして電子伝達系を障害し，ミトコンドリア膜から漏れた電子により活性酸素種（reactive oxygen species；ROS）が生成される。ROSによりミトコンドリアのデオキシリボ核酸（deoxyribonucleic acid；DNA）が障害され，ミトコンドリアDNAにコードされた電子伝達系タンパク質の産生が低下してミトコンドリア機能がさらに悪化するという悪循環が生まれる（Grattagliano et al., 2012）。また，コレステロールの過負荷によるミトコンドリア膜のコレステロール蓄積は電子伝達系の機能を損ない，酸化ストレスを亢進させる（Solsona-Vilarrasa et al., 2019）。他にも，酸化ストレスにおけるシトクロムP450 2E1（cytochrome P450 2E1；CYP2E1）の関与が報告されている（Weltman et al., 1998；Orellana

et al., 2006）。CYP2E1はアルコールの多量飲酒で誘導されるシトクロムP450で

あり，CYP2E1を介して産生されるROSがアルコール性肝障害の主要因であると考えられている。NASH患者においても肝臓においてCYP2E1が増加していることから，NASHにおいてもアルコール性肝障害と同様に，活性酸素種によ

(29)

17 る酸化ストレスが病態発症に関与している可能性がある。

図 1-6 Multiple parallel hits hypothesis

過栄養に伴う脂肪細胞の肥大化・機能異常は炎症性サイトカインの分泌を促進し，インスリン抵抗性発症に寄与する。脂肪組織におけるインスリン抵抗性は脂肪分解を促進し，血中遊離脂肪酸の上昇をもたらす。腸管では腸内環境の変化により腸管透過性が亢進し，腸内細菌叢に由来するエンドトキシンや短鎖脂肪酸が肝臓に流入して肝臓の炎症を悪化させる。肝臓ではインスリン抵抗性により脂肪合成が亢進し，遊離脂肪酸からトリグリセリド

（TG）へ変換・蓄積し脂肪肝となるが，肝臓での脂質代謝物の増加は脂肪毒性をもたらし，ミトコンドリア異常に伴う酸化ストレス及び小胞体ストレス等が生じて，炎症，肝細胞傷害，線維化の肝病変の形成に寄与する。Buzzetti et al., Metabolism 2016より改変。臓器の挿絵はBioRender.comより引用。

1-4-4. NAFLD／NASHにおける細胞外小胞の関与

脂質の過剰摂取に伴う遊離脂肪酸や遊離コレステロール，セラミド等の肝細胞への蓄積は脂肪毒性として肝細胞傷害や炎症性変化をもたらし，NASHの発症要因の一因となる。近年，脂肪毒性を起こした肝細胞がエクソソームをはじめとした細胞外小胞を放出し，その細胞外小胞が肝臓構成細胞に作用して炎

(30)

18 症，血管新生及び線維化等，NASH発症における重要な過程に関与することが報告されている（斉藤及び加藤，2018）（図1-7）。

 炎症反応への関与

遊離飽和脂肪酸であるパルミチン酸やその代謝物であるリゾフォスファチジルコリンを処置した肝細胞から大量に放出される細胞外小胞は，マクロファージにおいてdeath receptor 5シグナル依存的に炎症性サイトカイン遺伝子を誘導する。また，食餌誘発性NASHモデルマウスの初代培養肝細胞から分泌される細胞外小胞もマクロファージを活性化する。一方，脂肪毒性による細胞外小胞分泌を抑制する化合物であるfasudilをこのNASHモデルマウスに反復投与することで，血清中細胞外小胞の増加，血清中ALT値の増加，マクロファージによる肝臓の炎症及び肝線維化がいずれも抑制される（Hirsova et al., 2016）。

 血管新生への関与

NASHをはじめとする慢性肝炎では，病的な血管新生が異常な脈管構造のリモデリングを引き起こし，肝線維化を悪化させる。脂肪毒性により分泌された肝細胞の細胞外小胞はvanin 1を介して血管内皮細胞に取り込まれ，血管新生を誘導する（Povero et al., 2013）。

 肝線維化への関与

肝星細胞の活性化に伴う筋線維芽細胞への形質転換は，コラーゲン等の細胞外基質の産生を通じて，肝線維化の進展に寄与する。肝星細胞の活性化は脂肪毒性により分泌された肝細胞の細胞外小胞によっても調節されている。パルミチン酸を処置した肝細胞から分泌された細胞外小胞は，マイクロリボ核酸

（micro ribonucleic acid；miRNA）であるmiR-128-3pを肝星細胞へ輸送することにより，そのmiRNAの標的遺伝子であるペルオキシゾーム増殖因子活性化受容体（peroxisome proliferator-activated receptor；PPAR）γの発現を低下させて

(31)

19 肝星細胞活性化を引き起こす（Povero et al., 2015）。

図 1-7 NAFLD／NASHにおける細胞外小胞の関与

斉藤及び加藤，“代謝性疾患とエクソソーム”．医療を変えるエクソソーム－生体機能から疾患メカニズム，臨床応用まで－ 2018より改変。

これらのように，細胞外小胞による臓器内及び臓器間における細胞間コミュニケーションがNAFLD／NASHの発症過程に関与することが明らかとなって

(32)

20 きたが，NAFLD／NASHにおける細胞外小胞の生理学的機能及び意義についてはまだ不明な点も多く，今後の研究の進展が期待される。

1-4-5. ヒトにおけるNASH発症メカニズム

NAFLD／NASHの発症・進展に関与する因子については，本節で示したように様々な研究報告がある。なかでも，multiple parallel hits hypothesisはNASHの病態を説明しうる仮説として最もよく受け入れられている。しかしながら，その根拠となる知見の多くは動物モデルや培養細胞を用いた基礎研究によるものであり，複雑かつ多様なヒトNAFLD／NASH病態におけるエビデンスは限定的である。したがって，NASHの発症メカニズムの詳細はいまだ十分に解明されていないのが現状である。

1-5. NAFLD／NASH の治療

1-5-1. 食事・運動療法

NAFLD／NASHの治療法として，体重減少はNAFLD／NASHの病態改善に有効であることが証明されている。体重の7%以上の減少により肝脂肪化，炎症細胞浸潤，肝細胞の風船様変性が軽減され，その結果としてNASの有意な改善が認められる（Promrat et al., 2010）。また，体重減少が10%以上では肝線維化も改善する（Vilar-Gomez et al., 2015）。そこで，第一に食事・運動療法による生活習慣の改善及び減量が行われるが，減量に成功する確率は7%及び 10%減量に対してそれぞれ18%及び10%であり（Vilar-Gomez et al., 2015），減量達成率の低さや食事・運動療法を維持し続ける難しさが課題である。

1-5-2. 薬物療法

薬物療法については，現在のところ，NAFLD／NASHを適応症とした薬剤は承認されていない。日本においてエビデンスに基づいて推奨されている薬剤と

(33)

21 して，糖尿病合併例ではPPARγ作動薬であるピオグリタゾンがある（日本消化器病学会（編），2014）。ピオグリタゾンはインスリン抵抗性改善薬のカテゴリーに分類される2型糖尿病治療薬であり，複数の臨床試験においてNASHの組織学的所見が改善されることが報告されている（Musso et al., 2017）。一方，ピオグリタゾンの長期投与は副作用として体重増加が起こることに加えて，心不全，骨折等のリスクについても注意が必要である。また，保険適用外ではあるが，抗酸化薬であるビタミンEが推奨されている（日本消化器病学会（編）， 2014）。ビタミンEはNAFLD／NASHにおいて体内で増加するROSを捕捉して抗酸化作用を示す。ビタミンEもNAFLD／NASHに対する複数の臨床試験において血液生化学値や組織学的所見の改善が認められている（Sato et al., 2015）。一方で，ビタミンEの長期投与により総死亡率が上昇する報告もある

（Miller et al., 2005）。なお，NAFLD／NASH患者における肝硬変の発症や死亡率の改善等の予後に対するこれらの薬剤の効果は不明であり，長期投与の有効性や安全性は確認されていない。

1-6. NASHの薬剤開発

1-6-1. 概況

NAFLDの有病率は全人口の約25%と報告されており，日本においても1000 万人以上のNAFLD患者及び約100万人以上のNASH患者が存在すると推定される。主な慢性肝疾患の原因であったB型・C型肝炎が有効な治療薬の登場により次第に減少する一方，NAFLD／NASHの有病率は肥満人口の増加に伴って世界的に増加する傾向にあり，将来的にNAFLD／NASHが肝移植の原因疾患第1位になると予測されている（Charlton et al., 2011）。このような背景から NASH治療薬の確立は急務であり，多くの製薬企業がNASH治療薬の開発に取

(34)

22 り組んでいる。

2013年，米国食品医薬品局（Food and Drug Administration；FDA）がAASLD との合同ワークショップにおいてNASH治療薬開発における有効性の評価方法及び承認方針（Sanyal et al., 2015）を示したことで，製薬企業のNASH治療薬の開発が加速した。さらに，FDAは2018年，線維化を伴う非肝硬変NASHの治療薬開発におけるドラフトガイダンスを発出し，具体的な承認要件を示した

（U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, 2018）。NASH治療の最終ゴールは，疾患の進行抑制又は改善により，臨床アウトカム（肝硬変，肝硬変合併症，肝移植，死亡）を改善することであるが，

NASHは進行が遅く，臨床アウトカムをエンドポイントとした治験の実施は長期間を要する。そのため，第3相試験においては次のエンドポイントを臨床上の有益性を予測する可能性の高い代替エンドポイントに設定し，承認要件として考慮することで治験の早期化を図るとした。その承認要件とは，

 線維化を悪化させることなくNASHを消散させる又は，

 NASHを悪化させることなく線維化を1ステージ以上改善させる又は，

 NASHを消散させ，線維化を改善させる

である。なお，NASHの消散とは，脂肪沈着がないか，脂肪肝炎を伴わない脂肪肝と定義され，NASにおいて，炎症スコア0～1，肝細胞風船様変性スコア 0，脂肪肝スコアは任意の値をとる状態を指す。ただし，上記要件を満たして薬剤が承認されても，肝組織学的改善と臨床アウトカムとの関係は明らかになっていないことから，引き続き，市販後臨床試験において，以下を含む複合エンドポイントによって臨床的有用性を検証することを求めている。

(35)

23

 肝硬変への進行

 肝機能障害イベント（肝性脳症，静脈瘤破裂，腹水等）

 末期肝疾患モデル（Model for End-Stage Liver Disease；MELD）スコア12以下から15以上への変化

 肝移植

 全死亡

ClinicalTrials.govによると，2020年11月の時点で「Nonalcoholic

Steatohepatitis」に対する臨床試験は803件あり，非常に多くの試験が実施されている。そのうち，第3相試験に進んだ，ファルネソイドX受容体（farnesoid X receptor；FXR）作動薬obeticholic acid，アポトーシスシグナル調節キナーゼ 1（apoptosis signal-regulating kinase 1；ASK1）阻害薬selonsertib，PPARα／δ作動薬elafibranor，C-Cケモカイン受容体（C-C chemokine receptor；CCR）2／

CCR5拮抗薬cenicriviroc，甲状腺ホルモン受容体β（thyroid hormone receptor- β；THR-β）作動薬resmetirom，ステアロイルCoAデサチュラーゼ1（stearoyl CoA desaturase 1；SCD1）阻害薬aramchol及びガレクチン3阻害薬belapectinについて概説する（図1-8）。第3相試験に進んだ薬剤の試験結果が2019年以降，順次明らかとなり，2020年にはNASH治療薬が初上市されることが期待されていたが，非承認（obeticholic acid）又は第3相試験の主要評価項目未達

（seronsertib，elafibranor）と開発失敗が相次ぎ，NASH治療薬の開発の難しさが浮き彫りとなった。

(36)

24 図 1-8 NASHに対する第3相試験を実施した又は実施中の薬剤

Romero et al., J Med Chem. 2020及びChan et al., Int J Mol Sci. 2018より改変。

1-6-2. FXR作動薬obeticholic acid

Obeticholic acid（OCA）はケノゲオキシコール酸誘導体で，胆汁酸をリガンドとする核内受容体であるFXRの作動薬である（図1-9）。FXRの活性化は胆汁酸代謝，糖脂質代謝，インスリン感受性調節等に関与している。第3相試験

(37)

25 REGENERATE（Younossi et al., 2019）の18カ月時点における中間解析において，931例の線維化ステージ2及び3のNASH患者に対して，主要評価項目である「NASHの悪化なく線維化ステージ1以上改善」の達成率はプラセボ群 12%，OCA 10 mg群18%（p = 0.045），OCA 25 mg群23%（p = 0.0002）であり，有意な改善が認められた。一方，「線維化の悪化なくNASH消散」の達成率はプラセボ群，OCA 10 mg群，OCA 25 mg群でそれぞれ8，11，12%

（p = 0.13）であり，有意な改善は得られなかった。1968例の線維化ステージ1

～3のNASH患者において，最も多くみられた有害事象は掻痒（かゆみ）であり，プラセボ群の19%，OCA 10 mg群の28%，OCA 25 mg群の51%で発生した。そのうち，重度な掻痒が発生したのはプラセボ群では1%未満だったのに対し，OCA 25 mg群では5%に上った。また，OCA投与により低比重リポタンパク質コレステロール（low density lipoprotein cholesterol；LDLC）値が1カ月まで増加したが（ベースラインからの平均変化：プラセボ群−3.0 mg/dL，OCA 10 mg群17.8 mg/dL，OCA 25 mg群23.8 mg/dL），その後減少し，18カ月までにベースラインに近づいた。本試験結果を受け，開発元であるIntercept社は FDAに対して承認申請を行ったが，同社はFDAから「組織学的改善に基づく OCAの有益性予測は不確実であり，潜在的なリスクを十分に上回っていない」

とする審査完了通知を受領し，申請は承認されなかった（Intercept社プレスリリース，2020）。

1-6-3. ASK1阻害薬selonsertib

SelonsertibはGilead Sciences社が開発したASK1阻害薬である（図1-9）。 ASK1は酸化ストレスにより活性化し，p38分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（mitogen-activated protein kinase；MAPK）及びc-Jun N末端キナーゼ（c- Jun N-terminal kinase；JNK）経路を介して炎症，アポトーシス及び線維化を促

(38)

26 進するタンパク質である。877例の代償性肝硬変（線維化ステージ4）を呈するNASH患者に対する第3相試験STELLAR-4において，48週間のselonsertib 6 mg及び18 mgの投与により肝線維化を改善することができず，主要評価項目が達成できなかった。また，802例の線維化ステージ3のNASH患者に対して実施した第3相試験STELLAR-3においても，selonsertib投与による肝線維化の改善が認められなかった（Harrison et al., 2020）。

1-6-4. PPARα／δ作動薬elafibranor

ElafibranorはGenfit社が開発したPPARα／δ作動薬である（図1-9）。第3相試験RESOLVE-ITの72週の時点における中間解析において，1070例のNASH 患者に対して，主要評価項目である「線維化の悪化なくNASH消散」の達成率はプラセボ群14.7%に対してelafibranor群19.2%，副次的評価項目である「線維化ステージ1以上の改善」はプラセボ群22.4%に対してelafibranor群24%であり，いずれの評価項目も有意な改善が認められなかった（Genfit社プレスリリース，2020）。

1-6-5. CCR2／CCR5拮抗薬cenicriviroc

Cenicriviroc（CVC）はCCR2／CCR5拮抗薬であり，CCR2拮抗により肝傷害部位への炎症性単球及びマクロファージの遊走及び浸潤の抑制が，また，

CCR5拮抗により肝星細胞の遊走，増殖及び活性化の抑制がそれぞれ期待される（図1-9）。現在，肝線維化ステージ2及び3のNASH患者を対象とした第3 相試験AURORAが進行中である（Tacke, 2018）。線維化ステージ1～3の NASH患者289例を対象とした1年間の第2b相試験CENTAURにおいて，主要評価項目である「炎症又は肝細胞風船様変性のいずれか1点以上の改善を伴うNAS 2点以上の改善」はプラセボ群に対してCVC群で有意差は認められなかったが，副次的評価項目である「NASH悪化なく線維化改善」の達成率はプ

(39)

27 ラセボ群10.4%に対して，CVC群20.0%（p = 0.023）であり，有意な改善が認められた（Friedman et al., 2018）。

1-6-6. THR-β作動薬resmetirom

Resmetirom（MGL-3196）は選択的なTHR-β作動薬であり，肝臓の脂肪代謝を高めて脂肪毒性を軽減することによりNASHを改善する（図1-9）。125例の NASH患者に対する第2相試験において，主要評価項目である12週時の磁気共鳴画像－プロトン密度脂肪画分測定法（magnetic resonance imaging - proton density fat fraction；MRI-PDFF）で測定した肝臓の脂肪量の相対変化が，プラセボ群では10.4%減少であったのに対して，resmetirom群では32.9%減少

（p < 0.0001）であり，有意な肝脂肪量低下作用が確認された。副次的評価項目である36週時点での「線維化悪化なくNASH消散」の達成率はresmetirom群で有意に増加したが，「NASH悪化なく線維化改善」の達成率についてはプラセボ群とresmetirom群で同程度であった（Harrison et al., 2019）。現在，

Madrigal社により線維化ステージ2～3のNASH患者を対象とした第3相試験 MAESTRO-NASHが進行中である。

1-6-7. SCD1阻害薬aramchol

Aramcholは脂肪酸－胆汁酸複合体であり，SCD1を阻害してde novo脂肪合成を抑制する（図1-9）。248例のNASH患者に対する1年間の第2b相試験 ARRESTでは，主要評価項目である磁気共鳴スペクトロスコピー（magnetic resonance spectroscopy；MRS）により測定された脂肪肝の改善がaramchol投与により有意に認められた。なお，副次的評価項目である「線維化悪化なく NASH消散」の達成率はプラセボ群5%，aramchol 400 mg群7.5%，aramchol 600 mg群16.7%（p = 0.051），「NASH悪化なく線維化改善」の達成率はプラセボ群17.5%，aramchol 400 mg群21.3%，aramchol 600 mg群29.5%（p = 0.21）で

(40)

28 あり，いずれも有意な改善作用は認められなかった（Ratziu et al., 2018）。本試験結果を受け，開発元であるGalmed Pharmaceutical社は第3相試験ARMORを実施中である。

1-6-8. ガレクチン3阻害薬belapectin

Belapectin（GR-MD-02）は，線維化組織において発現が増加し，線維症の病因に関与すると考えられているガレクチン3の阻害薬である（図1-9）。肝静脈圧較差（hepatic venous pressure gradient；HVPG）が6 mmHg以上のNASH，肝硬変及び門脈圧亢進症患者162例に対する52週間の第2b相試験NASH-CXにおいて，主要評価項目であるHVPG変化はプラセボ群 0.10 mmHg，belapectin 2 mg/kg群 −0.28 mmHg（p = 1.0），belapectin 8 mg/kg群 −0.25 mmHg（p = 1.0）

であり，有意差は認められなかった。しかし，食道静脈瘤のない患者のサブグループ解析において，belapectin 2 mg/kgの投与によりHVPGの減少

（p = 0.02）及び静脈瘤発症頻度の減少（p = 0.03）が認められた（Chalasani

et al., 2020）。本試験結果をうけ，開発元であるGalectin Therapeutics社は食道静脈瘤のないNASH肝硬変及び門脈圧亢進症患者を対象とした第3相試験

NASH-RXを実施中である。

(41)

29 図 1-9 NASH治験薬の作用機序

図1-6 NASH発症メカニズム（multiple parallel hits hypothesis）に対して，NASH治験薬が抑制する主な作用機序を示した。臓器の挿絵はBioRender.comより引用。

(42)

30

第 2 章

NAFLD ／ NASH の動物モデル

2-1. NAFLD／NASH 動物モデルの分類及び特徴

複雑なNAFLD／NASHの病態解明や，新たなNASH治療薬の研究開発には NAFLD／NASHの動物モデルが必須である。NAFLD／NASHの主な動物モデルは，遺伝的モデル，食餌誘発性インスリン抵抗性モデル，栄養欠乏食モデル，化学物質誘発モデル及びそれらを組み合わせたモデルとして分類される

（表2-1）。

2-1-1. 遺伝的モデル

NAFLD／NASHの遺伝的動物モデルとしては，ob/obマウス，db/dbマウス，

Zucker fatty（ZF）ラット，Spontaneously Diabetic Torii（SDT）fattyラット，肝細胞特異的Pten（phosphatase and tensin homolog）欠損マウス，メラノコルチン 4受容体（melanocortin receptor 4；Mc4r）欠損マウス等が挙げられる。ob/obマウスは摂食抑制作用を有するホルモンであるレプチンにナンセンス変異があり，正常に機能するレプチンが産生されないため，過食及び肥満を呈し，さらに，肥満及びインスリン抵抗性に基づいて脂肪肝を自然発症する。また，db/db マウスはレプチン受容体遺伝子変異を有するため，レプチン不応性の過食及び肥満を呈するとともに，重度の糖尿病を自然発症する。ZFラットもレプチン受容体にミスセンス変異（Lepr^fa）を有しており，その結果，過食及び肥満を呈するモデルである。db/dbマウス及びZFラットのいずれも脂肪肝を発症する。た

だし，ob/obマウス，db/dbマウス及びZFラットはいずれも肝線維化が認めら

れない（Ge et al., 2010；Hockings et al., 2003；Ran et al., 2004）。したがって，こ

(43)

31 れらのモデルは肥満，インスリン抵抗性や糖尿病を背景とした脂肪肝の治療効果に関する介入研究に用いられる。

遺伝的モデルに，後述の食餌誘発モデルや化学物質誘発モデルを組み合わせることで，NASHの重症化（肝線維化）やNASH発症の短期化がおこることが報告されている。例えば，ob/obマウスに高フルクトース，高コレステロール及び高トランス脂肪酸を含有したAmylin Liver NASH（AMLN）食を給餌すると，AMLN食給餌正常マウスよりも早期にNASH及び肝線維化を発症する

（Kristiansen et al., 2016）。また，SDT fattyラットは非肥満型2型糖尿病モデルであるSDTラットにZFラットのLepr^fa遺伝子を導入して確立された肥満2型糖尿病モデルである（Masuyama et al., 2005）。雌性SDT fattyラットは32週齢から肝線維化を伴うNASHを発症するが（Ishii et al., 2015），高コレステロール食を給餌することにより，16週齢から肝線維化を伴うNASHを発症し，病態惹起が早期化する（Toriniwa, Muramatsu et al., 2018；Toriniwa, Saito et al., 2018）。

がん抑制遺伝子であるPtenの肝細胞特異的欠損マウス（Watanabe et al., 2005）は40週齢で肝線維化を伴うNASH様肝病変を呈し，80週齢で肝細胞癌が認められるが，体重減少，血糖低下，インスリン感受性亢進もみられることから，肥満を背景とすることが多いヒトNASHとは病態生理が異なる。また，

中枢神経系における摂食抑制やエネルギー消費に関与するMc4rの欠損マウスは肥満及び脂肪肝を呈するが，高脂肪食を給餌することにより20週齢で肝線維化を伴うNASH，1年齢で肝細胞癌を発症する（Itoh et al., 2011）。これらの動物モデルはNASHから肝細胞癌に至る病態を観察できる利点があるが，組換え動物であることから，入手経路の確保や管理が必要となる。

(44)

32

2-1-2. 食餌誘発性インスリン抵抗性モデル

NAFLD／NASHの主な要因は栄養過多や運動不足等の生活習慣による肥満であることから，高脂肪食等の肥満・インスリン抵抗性誘発性の食餌負荷モデルがヒトのNAFLD／NASHを模倣した動物モデルとして用いられている。しかし，正常マウスやラットに対して，食餌負荷によりNASHや肝線維化まで発症させることは容易ではなく，種々の食餌組成による検討が行われている。例えば，高脂肪食にコレステロールやコール酸を添加することでNASHを発症することが報告されている（Zheng et al., 2008；Bruckbauer et al., 2016）。また，高脂肪，高コレステロールに加えて，西洋食に多く含まれるフルクトースを添加した西洋型飼料をマウスやラットに給餌することでNASHの誘発が試みられているが，NASH様肝病変や肝線維化が観察されないことがあったり（Shierwagen et al., 2015；Asgharpour et al., 2016），肝線維化までの発症が遅い（Asgharpour et al., 2016；Savard et al., 2013）といったことが報告されている。一方，22%フルクトース，2%コレステロール及び40 kcal%脂肪（30 kcal%トランス脂肪）を含有したAMLN食は，正常動物であるC57BL/6マウスにおいて，食餌負荷26

～30週で脂肪肝，炎症，肝細胞変性及び肝線維化を発症させる（Clapper et al., 2013）。また，60 kcal%脂肪，1.25%コレステロール，0.5%コール酸食に加えて，コレステロール吸収を促進する2%シヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン含有水を負荷したHFCC/CDXマウスは3週間という短期間で脂肪肝，

炎症及び肝線維化の評価が可能である（Duparc et al., 2019）。

2-1-3. 栄養欠乏食モデル

肝臓から末梢へのトリグリセリドの運搬は，肝臓から分泌される超低比重リポタンパク質（very low density lipoprotein；VLDL）が担っている。したがって，肝臓からのVLDL分泌を抑制すると肝臓中に脂肪が蓄積する。メチオニ

(45)

33 ン・コリン欠乏（methionine-choline deficient；MCD）食モデルは，VLDLの主なリン脂質成分であるホスファチジルコリンの前駆体であるコリンと，コリン生合成の前駆体であるメチオニンを欠乏した飼料を負荷したNASHモデルであり，メチオニンやコリンの欠乏によりホスファチジルコリンの合成量が減少し，VLDLの組立及び分泌が低下する結果，肝臓に脂肪が蓄積する。MCD食には40%ショ糖と10%脂肪が含まれる。MCD食モデルは脂肪肝に加えて，食餌誘発性インスリン抵抗性モデルよりも短期間で肝線維化を伴うNASHを発症する（Ip et al., 2004；Dela Peña et al., 2005）。しかし，MCD食モデルは大幅な体重減少や血清中グルコース，インスリン，トリグリセリド及びコレステロール値の低下等，メタボリックシンドロームを背景にしたヒトのNAFLD／NASH とは逆方向の代謝的特徴を有する（Rinella and Green, 2004；Rinella et al.,

2008）。したがって，MCD食モデルは実験的に肝臓脂肪蓄積及びNASH様肝病変を惹起できるものの，ヒトNAFLD／NASHの病態生理とは大きく異なっている。

MCD食モデルは著しい体重減少を起こし，肝線維化の観察等，継続的な評価に使用しづらいことから，MCD食の改変飼料であるコリン欠乏メチオニン減量アミノ酸（choline-deficient, L-amino acid-defined；CDAA）食を負荷した NASHモデルも使用されている（Nakae et al., 1990；Sakieda et al., 1994）。 CDAA食はコリンを欠乏した31 kcal%脂肪，0.17%メチオニンを含有する飼料であり，Fischer 344又はWistarラットにおいて体重減少を抑えつつ，肝線維化及び肝細胞癌を発症する。しかし，CDAA食モデルによるNASH発症には種差があり，マウスでの病態発症が弱い。そこで，体重減少を抑制し，かつ，線維化まで進行する，コリン欠乏高脂肪メチオニン減量食（choline-deficient, L- amino acid-defined, high-fat diet；CDAHFD）マウスモデルが開発されている

動物モデルによる非アルコール性脂肪肝炎 の病態生理に関する研究

動物モデルによる非アルコール性脂肪肝炎 の病態生理に関する研究

Studies on the pathophysiology of nonalcoholic steatohepatitis

using animal models

2021 年 2 月

斉藤 友幸

Tomoyuki SAITO

動物モデルによる非アルコール性脂肪肝炎 の病態生理に関する研究

Studies on the pathophysiology of nonalcoholic steatohepatitis

using animal models

2021 年 2 月

早稲田大学大学院 先進理工学研究科 生命理工学専攻 分子生理学研究

斉藤 友幸

Tomoyuki SAITO

目 次

略語一覧

図表一覧

第 1 章 緒 論

第 2 章

NAFLD ／ NASH の動物モデル

動物モデルによる非アルコール性脂肪肝炎の病態生理に関する研究

動物モデルによる非アルコール性脂肪肝炎の病態生理に関する研究

斉藤友幸

動物モデルによる非アルコール性脂肪肝炎の病態生理に関する研究

早稲田大学大学院先進理工学研究科生命理工学専攻分子生理学研究

斉藤友幸

目次

第 1 章緒論