博士（農学）顔 学位論文題名
瑾
STUDIES ON GENOME STRUCTURE OF RICE RAGGED STUNT VIRUS
イネラギッドスタントウイルスの遺伝子構造に関する研究
学位論文 内容の要旨
Rice Ragged Stunt Virus (RRSV)は ， 東 南ア ジ ア の 稲 作 地帯 で 流 行 し ，毎 年 経 済 的 に深 刻 な 被 害 を 与え て い る ウ イル ス で あ る 。RRSVは植 物 レ オ ウ イ ルス に 属 す る が， そ の中で の分 類 学 的 位 置 は ま だ 不 明 で あ る 。 本 研 究 はRRSVの 遺 伝 子 解 析 を 中 心 に ，RRSVと そ れ に類 似 し て い るEchinochloa Ragged Stunt Virus (ERSV)を 遺 伝 子 レ ベ ルて 解 甘Iし ，分 類 学 的 位 置 を 初 め て 明ら か に し た 。更 に 遺 伝 子 構造 と そ の 機 能の 解 明 を 目 的 とし て ，RRSVのゲノ ムセ グ メント10（S10)，S9及び その変 異株の 塩基 配列を 解析し た。
1． RRSV純化 法の検 討
従 来 の純 化 方 法 を 検討 し ， グ リ シン 及びMgCl：を合 むトリ ス緩衝 液に 改良し ，ウイ ルス収 量 が 最も高 くかつ 粒子 崩壊の 少ない 純化方 法を 確立し た。こ の方法 によっ て寄 生植物 成分の混入を 最 少にし ，常に 高純 度のウ イルス 分画を 得る ことが 初めて 出来た 。また ，ウ イルス 遺伝子解析の た め に 充 分 な試 験 材 料 を 得る こ と が で きた 。 さ ら に ，RRSV純 化に 最 も 良 い 季節 は 夏であ るこ と を明ら かにし た。
2． RRSV粒子 形態に 関す る研究
純 化粒 子をchymotryspinある いはO．3一O．5M MgCl：含 有ト ランス クリプ ト反応 液で処理し，
粒 子 構 造 の 変化 を 蛋 白 質 の電 気 泳 動 と 粒子 の 電 顕 観 察に よ っ て 解 析 した 。 そ の 結果，RRSVの spikeは植 物レ オウイ ルスの 他の2属と 全く異 なった構造であることを始めて明らかにした。また，
45K, 35Kの ポ り ペ プ チ ド は 粒 子 の 表 面 に 存 在 し ，spikeの 成 分 で あ る と 推 定 し た 。 3． RRSVと他 の植物 レオ ウイル スの関 係
（1） 寄主範 囲
近 年 報 告 さ れ たERSVは ， そ の ゲ ノ ム の 電 気 泳 動 パ 夕 一 ン がRRSVに 類 似 し て い る の で ， 両 者 の 関 係 を 解 明 す る た め ， ま ず 寄 主 範 囲 を 調 べ た 。 そ の 結 果 ，RRSVはERSVの 主 なる 寄 主Echinochloa crus―galliに 感 染 せ ず， ま たERSVは イ ネ に感 染 し な い こ とか ら 両 ウ イ ルス
の寄 主範 囲が異 なるこ とを明 らか にした 。 (2) RNA/RNAハ イブリ ダイ ゼーシ ョン
RRSV, ERSVの ゲ ノ ムRNAを そ れ ぞ れ プ 口 ー ブ と し ， 他 の 植 物 レ オ ウ イ ル ス と 遺 伝 子 レ ベ ル 上の共 通性を ハイブ リダ イゼー ション 法で解 析した 。反 応はそ れぞれ45℃，50℃，55℃の3 段 階 の 温 度 で行 っ た 。 そ の結 果RRSVは 植 物 レ オ ウイ ル ス の 他 の2属 と は 共 通性 の な い こ とを 明 ら か に し た 。 ま た ，RRSVとERSVの 間 で は 弱 い 反 応 し か 認 め ら れ ず ， 両 ウ イ ルス は ゲ ノ ムレ ベル で相同 性の少 ないこ とを 明らか にした 。
(3) RRSV及びERSVゲノム の両末 端構 造解析
RRSVとERSVの す べ て の ゲ ノ ム 両 末 端 塩 基 配 列 を ゲ ノ ム2本 鎖RNAよ り2次 元 ゲ ル 電 気 泳 動 法(Wandering spot法 ） で直 接 解 析 し た。RRSVで は す べ て のゼ グ メ ン ト に 共通 な 配 列5 GAUAA‑‑‑GUGC3 カ く 見 い だ され た 。 ゲ ノ ム両 末 端 の 塩 基はPEIセ ル口 ース プレー ト展 開法で 確 か め た 。S9，Sl0の 末 端 塩 基 配 列 はcDNAの 塩 基 配 列 解 析 あ る い はRNAプラ イ マ ー シ ーケ ン ス 法 に よ る 結 果 と 一 致 し た 。ERSVで は 全 分 節 ゲ ノ ム で 共 通 な 配 列5 GAUAAAU…GGUGC 3 が存 在した 。ゲ ノム末 端の塩 基fま PEIセル口ースプレート展開法で同定した。両ウイルスで保 存さ れて いる共 通配列 は同じ であ った。 この共 通配列 は植物レオウイルスの他の2属のそれとは全 く 異 な って お り ， 従 っ てRRSV及びERSVは 新 し い 属 に分 類 す べ き で ある こと を遺伝 子レベ ルで 証明 した 。また ，複製 と転写 に関 する末端保存配列が植物レオウイルスの分類のーっの重要な基準 とな るこ とを提 唱した 。
4． RRSVゲノ ムSl0の遺伝 子構造 解析
本 研究 で は ，RRSVS10の 全 塩 基 配 列を 決 定 し ，推 定され たア ミノ酸 を他の 植物レ オウイ ルス の コ ー ド す る 蛋 白 質 の ア ミ ノ 酸 配 列 と 比 較 し た 。 最 初 にRRSVの 転 写 産 物を 鋳 型 と し て，
GublerとHoffman（1983） 法 でcDNAを 合 成 し ， 大 腸 菌 プ ラ ス ミ ドpBR322を 用 い て ク 口 一 ニ ン グ した 。 得 ら れ た1000個 以上 のcDNAク ロ ー ンのampicillin感受 性を 調べ，493個 のク口 ― ン を 選 抜し 電 気 泳 動 に よっ て 挿 入cDNAの 長 さを 調 べ た 。 さら に ， 長 いク 口ー ンの中 からハ イ ブ リ ダ イゼ ― シ ョ ン 法 よりSl0のク 口 一 ン を 選別 しデ ィレ ーショ ンシリ ーズク ロ―ン を作 成し た 。 このク 口ーン の塩基 配列 をジデ オキシ チェイ ン夕一 ミネ ー夕一 法で決 定した とこ ろ840塩基 対 で あり， ゲノム の両末 端領 域を含 んでい なかっ た。欠 損し ていた5 末端領 域はゲ ノムま たは 転 写 産 物RNAを 直 接 解 析 し て 塩 基 配 列 を 決 定 し た 。3 末 端 で は 新 た にcDNAを 合成 し 塩 基 配 列 を 決 定 し た 。 更 にPCR法 よ りSl0のfull―length cDNAを合 成 し 両 末 端か ら 塩 基 配 列 を 確 か め た 。Sl0は1162塩 基 対 か ら な り ， 最 も 長 いORFは5 末 端 よ り2番 目 のAUGコ ン ド に
始まり，297アミノ酸残基からなる32. 3Kのポリペプチドをコードしていた。このアミノ酸配列 はPhytoreovirus属 のWound Tumor Virus（WTV） のSllがコ ート するP9蛋白 質と 約20
％の相同性を有していた。異なる属のウイルス間でアミノ酸の相同性が認められた。RRSVS10 の5 末 端か ら最初のAUGコ ドンより55塩基目まで短いORFも認められた。更に5 ，3 両 末端で6塩基の逆向き繰り返し配列も見いだされた。
5．RRSVゲノムS9全塩基配列及びS9の変異 （1）S9の全塩基配列
Wandering spot法 で 得ら れたRRSVS9の3 末端の塩基 配列は李ら（1988)の結果と 異な るた め ，S9の3 末端領域を 改めてク口ーニングした。 このcDNAより塩基配列を分析 した ところ，Wandering spot法と一致した結果を 得た。よって，S9は全長1132塩基対であるこ とを明らかにした。S9はSl0より短いことから両セグメント電気泳動移動度はポリアクリルア ミドゲルで逆転していることが示唆された。S9は338アミノ酸残基からなる分子量38. 6Kのポ ルペプチドをコー ドしていた。このポリペプ チドの分子量はRRSV粒子のspikeの構成夕ンパ クの分子量とほぼ同様である。
（2）S9の変異
RRSVのゲ ノム核酸を電気 泳動したところ，S9の位置で2本のバンドが生ずるウイル ス株 を発見した。感染 したイネの株によってS9の位置で2本のバンドが現れるものと，どちらか1 本だけのバンドが現れるものがあった。これらのS9の泳動パターンは株分け法で継代しても安 定していた。虫媒 によってイネに接種試験を2回行った結果，2回とも2本のS9を持つ株を接 種したイネは1本のS9を持つ株を接種源としたものより明らかに感染率が低くなった。従って，
S9は媒介虫伝搬率 に関与していることが示唆 された。更に，PCR法でそれぞれのウイルス株 のS9のcDNAを合 成し ， 塩基 配列 調べ たと こ ろ，2塩 基の 違い が2本のS9バ ンド の 間で 認 められた。この2塩基はさらにコードするポりペプチドはウイルス粒子の表面に存在していると 考えられるので，このポりペプチドはウイルス一媒介虫一寄主植物の相互作用において重要な役 割を果たしていると推察した。
6．キャップ構造
ウイルスの転写 機構を解析する目的で，転写RNAの5 末端構造をプライマー伸長反応で調 べたところ，5 末端で2本の停止バンドが認められた。2本の上のバントはキャップを除く化 学的処理を加えたRNAを鋳型としてプライマー 伸長反応させた結果，上のバンドが消失した ので，転写RNAが キャップをもっと結論づけた 。この構造の同定は植物レオウイルスの中で
WTVに 続 い て2番 目 で あ る 。キ ャ ッ プ 構 造 の解 明 は ， ウ イル ス ゲ ノ ム の末 端 構 造 に 関す る 研 究 の一環 として ，非 常に大 きな意 義をも つ。
以 上の 研究成 果は， イネラ ギット スタ ントウ イルス のゲノ ムの 構造と 機能に関して世界的に先 駆 的なも のであ り， その知 見は高 く評価 され るもの である 。
学位論文審査の要旨 主査
副査 副査 副査
教授 教授 教授 助教授
木 村 生 越 喜 久 田 上 田
邦 夫 明 嘉 郎 一 郎
本 論 文 は 英文 ，6章 ， 引用 文 献 を 含 め267頁 より なり， 他に参 考論文2編 が添え られ ている 。 Rice Ragged Stunt Virus (RRSV） は 東 南 ア ジア の 稲 作 地 帯で 流 行 し ， 甚大 な 被 害 を 与 え てい る ウ イ ル スで あ る 。RRSVは 植 物 レオ ウ イ ル ス に属 す る が ， その 中 で分類 学的位 置が 不明 であ り，ウ ンカ によっ てイネ ，厶ギ 類及 びトウ モロコ シなど に伝搬 され ，10本に 分節し た2本鎖 (ds) RNAゲ ノ ム を 含 む 直 径65nmの 球 形 粒 子 で あ る 。 本 研 究 はRRSVゲ ノ ム の 遺 伝 子 解 析 を 中 心 に ， こ れ に 類 似 のEchinochlia Ragged Stunt Virus (ERSV） を 遺 伝 子 レベ ル で 解 析 し，二 っのウ イルス の分 類学的 位置を 明らか にした 。さ らに遺 伝子構 造とそ の機能の解明を目的 と し て ，RRSVゲ ノ ム の セ グ メ ン ト10（S10)，S9及 び の そ 変 異 株 の 塩 基 配 列を 解 析 し た 。 1) RRSV純 化法 の検討
従 来 用 い られ て い た 純 化法 を 検 討 し ，グ リ シ ン及びMgCl2を含む トリス 緩衝液 に改 良し， 作 法手法 を単純 化して ，高 純度， 高ウイ ルス収 量の純 化法 を確立 した。 この方 法により，高純度の ウ イ ル ス 標 品 が 初 め て 得 ら れ ，RRSVゲ ノ ム 遺 伝 子 解 析 の 研 究 が 可 能 と な っ た 。 2) RRSV粒 子の 構造解 析
純 化RRSV粒 子 を キ モ ト リ プ シン ま た は 高 濃度MgClよ 含 有 ト ラ ン スク リ プ ト 反 応液 で 処 理 し，粒 子構造 の変化 を蛋 白質の 電気泳 動法及 び粒子 形態 の変化 を電顕 観察に より解析した。その 結 果 ，RRSVのspikeは45Kと35Kの2ポ リ ペ プ チ ド で 構 成 さ れ ， 植 物 レ オ ウ イ ル ス の 他 の2 属と異 なった 構造で ある ことを 明らか にした 。
3）RRSVを植物レオウイルスの他の属との関係 ＠寄主範囲
近 年報 告さ れ たERSVは ゲノ ム の電 気泳動パターンがRRSVに類似しているので，両 者の 関係 を解 明す る ため ，寄 主範 囲 を試 験した。その結果 ，RRSVはERSVの主たる寄主ヒ エに 感染せず，またERSVはイ ネに感染し難いことから両ウイルスの寄主範囲が異なることを示し た。
◎異属間のRNA/RNAハイブリダイゼーション
RRSVとERSVの ゲ ノ 厶RNAを そ れぞ れプ ロ― ブと し ，他 の植 物レ オウ イ ルス と遺 伝子 レベルでの共通性をハイブリダイゼーション法で解析した。反応は45℃，50℃及び55℃の3温度 で行った。その結果，RRSVは植物レオウイルスの他の2属とは共通性のないことを証明した。
また ，RRSVとERSVの 間で は弱 い 反応 しか認められず， 両ウイルスはゲノムレペルで 相同 性の少ないことを明らかにした。
◎RRSVとERSVゲノムの両末端構造解析
RRSVとERSVの 全 ゲ ノ ム 両 末 端 塩 基 配 列 を ゲ ノ ムdsRNAよ り2次 元 ゲ ル 電 気 泳 動 法 (Wandering Spot法） で 直接 解析 した 。RRSVでは 全セ グメ ン トに 共通 な配 列5 GAUAAA の6塩基，GUGC3 の4塩 基が見出された。ERSVでは全 セグメン卜で共通な酉己列5 GAUAAAU の7塩基，GGUGC3 の5塩 基が存在した。両ウイルス で保存されている両末端共通配列は5 末端6塩基，3 末端4塩 基が同じであった。この両末端共通配列は植物レオウイルスの他の2 属の それ とは 全 く異 なっ てお り ，従 ってRRSVとERSVは 新しい属に分類すべきことを 遺伝 子レベルで証明し，この末端保存配列が植物レオウイルス分類の重要な一基準となることを提唱 した。
4）RRSVゲノムのSl0の遺伝子構造解析
RRSVの 転 写 産 物 を 鋳 型 と し て ，GublerとHoffman（1983)法でcDNAを 合成 し， 大腸 菌プ ラス ミドpBR322を用い てク口一ニングした。得られ たcDNAク口ーンの中からSloのク 口一ンを選抜して塩基配列を決定したところ840塩基対で，ゲノム両末端領域を含んでいなかっ たの で，5 末端 はゲ ノ ムま たは 転写 産物RNAの直接解 析，3 末端はcDNAを合成し てSl0 の全塩基配列を決定し，推定されるアミノ酸を他の属のウイルスのコードする蛋白質のアミノ酸 配列 と比 較し た 。こ のSl0は1162塩基 対よ り なり ，最 長のORFは5 末端より2番目 のAUG コドンに始まり，297アミノ酸残基からなる32. 3Kのポりペプチドをコードしていた。このアミ ノ 酸 配 列 はPhytoreovirus属 のWound Tumor Virus（WTV） のSllがコ ー ドす るP9蛋白
質と20％の相同性を有し ていた。またSl0の5 末端から最初のAUGコドンより55塩基目まで 短 いORFも 認 め ら れ ， さ ら に 両 末 端 で6塩 基 の 逆 向 き 繰 り 返 し 配 列 も 認 め ら れ た 。 5) RRSVゲノムのS9の全塩基配列及びS9の変異
＠S9の全塩基配列
S9のcDNAよ り 塩基 配列 を分 析 し全 長1132塩 基対 で あることを明らかに した。S9はSl0 より短いことから両セグメントの電気泳動移動度はポリアクリルアミドゲル中で逆転していた。
S9は338アミノ酸残基か らなる分子量38. 6Kの蛋白質 をコードし，これはRRSV粒子のspike 構成蛋白質の分子量とほぼ同じである。
◎S9の変異株
RRSVゲ ノ 厶RNAを 電 気泳 動し た結 果 ，S9の位 置に2本 のバ ンド を 示す 株と どち らか1 バンドしか示さない株が見い出された。これらの株は株分けで継代しても安定していた。この両 株をウンカによるウイル スの伝搬試験を行った結果 ，2バンドのS9株は1バンドのS9株より 伝搬 率で1／2低 かっ た。 従っ て，S9は虫媒伝 搬に関与することが示唆され た。さらに，
PCR法 で 両 株 のS9のcDNAを 合 成 し ， 塩 基 配 列を 解 析し た結 果，2塩 基の 違い が2本のS 9バンドの間で認められ ，これらがコードする蛋白質の2ケ所のアミノ酸の置換が生じた。S9 のコードする蛋白質は粒 子のspikeを構成していると考えられ，RRSVの表面に存在するので 虫媒伝搬に重要な役割を果たしていると推察された。
6)キヤップ構造
RRSVの転写機構で解析 する目的で，転写RNAの5 末端構造をプライマ一伸長反応で調べ た結果，5 末端で2本の停止バンドが認められた。2本の上のバンドはキャップ構造であるこ とが考えられたので，それを除去する化学的処理を加えて，さらにプライマ一伸長反応させても このバンドは現れなかっ たのでRRSVの5 末端にはキャップ構造を持っていると結論した。
この証明は植物レオウイルスの中でWTVにっいで2番目である。
以上の研究成果はRRSVのゲノム構造と機能に関して世界に先駆けて行われ，植物レオウイ ルスの虫媒伝染に関与する遺伝子の解明上重要な貢献をなすもので，学術上高く評価されるもの である。
よって審査員一同は最 終試験の結果と合わせて，本論文の提出者顔瑾は博士（農学）の学 位を受けるにの充分な資格があるものと認定した。
