〔
原
著 〕
ALT活
性 阻 害 を 示 すIgGの
免 疫 化 学 的 特 性
安 藤 敏 子1・ 渡 邉 眞 一 郎1・ 大 川 記 代1・
小 川
登1・ 荏 原
茂1・
長 澤 佳 美2・ 石 原
潤3・ 亀 子 文 子4・ 藤 田 清 貴4
SUMMARY
We observed a 74-year old woman with chronic hepatitis C, whose alanine
aminotrans-ferase (L-Alanine: 2-oxoglutarate aminotransaminotrans-ferase:
EC.2.6. 1.2; ALT) activity in serum
was below 2 IU/L (reference value: 9-25 IU/L). ALT activity in normal human serum was
inhibited when the patient's serum was added to normal serum. By immunoprecipitation
assay, it was found that the patient's IgG-κ acted as an inhibitor of ALT. The ALT inhibitionof the patient's
IgG was not blocked by adding alanine as a substrate,
and also by adding
pyridoxal phosphate
as a coenzyme. The purified patient's
IgG was found to be composed of
two γ chains of about 50kDa and two κ chains of 28kDa by SDS-PAGE. The inhibitory
abil-ity of IgG was exclusively
located
in the Fab region
of the molecule.
Key words:
alanine aminotransferase,
inhibitor, IgG, hepatitis
C.
は じめ に
近 年, 低 活 性 異 常 を 示 す サ ブ ユ ニ ッ ト欠 損 な ど の 遺 伝 的 変 異 と は 別 に, 酵 素 以 外 の 血 中 成 分 に よ っ て 酵 素 活 性 が 低 下 す る 失 活 因 子 の 存 在 が 知 られ て い る1). こ れ ら 失 活 因 子 の 大 部 分 は 免 疫 グ ロ ブ リ ン の 結 合 に よ る活 性 阻 害 で あ る こ と が 判 明 し て い る が, そ の 阻 害 酵 素 はLD2∼6)が 最 も 多 く, alanine aminotransferase (L-Alanine: 2-oxoglutarate ami-notransferase: EC.2.6.1.2; ALT) 活 性 阻 害 例 は 極 め て 少 な い. ま た, 免 疫 グ ロ ブ リ ン に よ る 活 性 阻 害 の 機 序 に つ い て も 未 だ 明 ら か に さ れ て い な い. 今 回 我 々 は, ALT値 が 異 常 低 活 性 を 示 す 例 を 経 験 し た. 検 索 の 結 果, IgG-κ型 免 疫 グ ロ ブ リ ン が 活 性 阻 害 因 子 と し て 働 い て い る こ と が 判 明 し た の で, そ の 免 疫 化 学 的 特 性 に つ い て 報 告 す る.材料および実験方法
1. 材 料 C型 肝 炎, 肝 硬 変 に 伴 う食 道 静 脈 瘤 の 治 療 目的 に て 来 院 し, イ ン フ ォ ー ム ド コ ン セ ン ト を 得 た74歳, 女 性 の 血 清 を 用 い た. 初 診 時 の 主 な 肝 機 能 検 査 成 績 は, AST117U/L (基 準 範 囲: 14-32), ALT2U/L (9-25), ALP617U/L (109-312), LD234U/L (116-199), γ-GT49U/L (10-28) で あ っ た. 他 の 肝 機 能 検 査 項 目 と比 較 しALT活 性 の み 異 常 低 値 を 示 した. 2. 方 法 1) ALT活 性 測 定 JSCC標 準 化 対 応 法 試 薬 イ ア ト ロLQGPTレ ー ト (J) (三 菱 化 学 ヤ ト ロ ン) を 用 い 日立7250型 自動 分 析 装 置 (37℃) に て 測 定 し た. ま た, 用 手 法 に は, ALT活 性 測 定 用 キ ッ ト (カ イ ノ ス) を 用 い た.Inhibition of alanine aminotransferase activity by IgG.
1 Toshiko Ando, Shinichiro Watanabe, Kiyo Okawa, Noboru Ogawa, Shigeru Ehara; 公 立 大 学 法 人 横 浜 市 立 大 学 附 属 病 院 臨 床 検 査 部 2 Yoshimi Nagasawa; 健 康 保 険 組 合 連 合 会 大 阪 中 央 病 院 中 央 検 査 部
3 Jyun Ishihara; 静 岡 県 立 こ ど も 病 院 臨 床 病 理 科
4 Fumiko Kameko, Kiyotaka Fujita; 信 州 大 学 医 学 部 保 健 学 科 検 査 技 術 科 学 専 攻
Correspondence address: Toshiko Ando; Department of Clinical Laboratories, Yokohama City University Hospital, 3-9 Fukuura, Kanazawa-ku, Yokohama, Kanagawa 236-0004, Japan.
略 号 一 覧: ALT, alanine aminotransferase; PBS, phosphate-buffered saline; SDS-PAGE, sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis; 2-ME, 2-mercaptoethanol.
2) ALT活 性 阻 害 因 子 の 存 在 の 確 認 法
高ALT活 性 (451U/L) を 示 す 肝 疾 患 患 者 血 清 (高ALT 血 清) と5倍 希 釈 し た 本 患 者 血 清 (対 照 は 生 理 食 塩 水) を 等 量 混 合 し, 室 温 お よ び4℃に 置 き, 経 時 的 にALT活 性 を 測 定 し た.
3) 免 疫 混 合 法
抗IgG (γ), IgA (α), IgM (μ), κ, λ鎖 抗 血 清 (い ず れ もDAKO) を 各 々200μl (た だ し, 抗 κ鎖 抗 血 清 の み300μl) に 対 し 患 者 血 清 を25μlず つ 添 加 し, 混 和 後, 冷 蔵 庫 で 一 晩 反 応 さ せ た. 反 応 後, 5,000rpm, 5分 間 冷 却 遠 心 し, そ の 沈 殿 物 をpH7.2, リ ン 酸 緩 衝 食 塩 水 (PBS) 200μlで3回 洗 浄 し た. そ の 後, そ れ ぞ れ の 沈 殿 物 に 高ALT血 清 を 加 え, ど の 特 異 抗 血 清 の 沈 殿 物 でALT活 性 阻 害 が み ら れ る か 確 認 し た. 4) IgGの 精 製 法
Protein G-Sepharose 4 Fast Flow (Amersham Pharmacia Biotechnology) カ ラ ム を 用 い, 以 下 の 如 く患 者 お よ び 正 常 IgGを 精 製 し た. 開 始 緩 衝 液 (pH 7.2, 0.1M phosphate buffer) に て 平 衡 化 し た Protein Gカ ラ ム に 血 清 を 添 加 し, 未 吸 着 画 分 を 溶 出 後, pH3.0, 0.2M Glycine-HCl緩 衝 液 に て 吸 着 画 分 (IgG画 分) を 溶 出 さ せ た. そ の 後, PBSで 透 析 し, ミニ コ ンB15 に て 濃 縮 を 行 っ た. 5) 免 疫 固 定 電 気 泳 動 法 1%ア ガ ロ ー ス ゲ ル フ ィ ル ム を 用 い, 90V40 分 間 電 気 泳 動 を 行 っ た 後, 各 種 特 異 抗 血 清 を し み 込 ま せ た セ ル ロ ー ス ・ ア セ テ ー ト膜 を ゲ ル 面 に 重 ね 室 温 で60分 間 反 応 さ せ た. 脱 蛋 白 ・脱 塩 操 作 後, ニ グ ロ シ ン 染 色 液 に よ る 蛋 白 染 色 を 行 っ た. 6) SDS-ポ リ ア ク リ ル ア ミ ドゲ ル 電 気 泳 動 (SDS-PAGE) 法 SDS-PAGEはPAGミ ニ 「第 一 」4-20%の グ ラ ジ ェ ン ト ゲ ル (第 一 化 学 薬 品) を 用 い, Laemmli 法7)に 従 い 行 っ た. 分 子 量 マ ー カ ー はSDS-PAGE Standards (Low Range; Bio-Rad) を 用 い た. 7) 2-メ ル カ プ トエ タ ノ ー ル (2-ME) 処 理 に よ るALT活 性 阻 害 実 験 患 者 お よ び 正 常IgG 30μlに0.1M2-MEを5μl加 え, 37℃ で1時 間 還 元 処 理 を 行 っ た. そ の 後, 高ALT血 清 を 添 加 し, 患 者IgGのALT活 性 阻 害 の 有 無 を 確 認 し た. 8) ノ イ ラ ミ ニ ダ ー ゼ 処 理 に よ るALT活 性 阻 害 実 験 患 者 お よ び 正 常IgG 10μlに ノ イ ラ ミニ ダ ー ゼ (Arthrobacter ureafaciens 由 来) を10μl (5単 位) 加 え, 37℃ 30分 間 処 理 を 行 っ た. そ の 後, 高ALT血 清 を 添 加 し 患 者IgGのALT 活 性 阻 害 の 有 無 を 確 認 し た. 9) ア ラ ニ ン お よ び ピ リ ドキ サ ル リ ン 酸 添 加 に よ るALT 活 性 阻 害 実 験 高ALT血 清 に 終 濃 度0.5mMお よ び5mMに な る よ う
D,L-α-ア ラ ニ ンを 加 え, 患 者IgGのALT活
性 阻害 の 有 無
を確 認 した. 同 様 に ピ リ ドキ サ ル リン酸 を終 濃 度50μM,
250μM, 500μMに
な る よ う高ALT血
清 に 加 え た 後, 患 者
IgGのALT活
性 阻 害 の 有 無 を 確 認 した.
10) 患 者IgGのALT結
合 部 位 の 検 索
精 製 患 者IgGに
抗 λ鎖 抗 血 清 を 混 和 し, IgG-λ型 蛋 白 を
除 去 した. そ の 上 清 (IgG-κ型 蛋 白) に抗 γFab, 抗 γFc抗
血 清 (い ず れ もMBL)
を混 和 し4℃に 一 晩 放 置 後, そ れ ぞ
れ の沈 殿物 を得 た. そ の 沈 殿物 をPBSで3回
洗浄 後, 高ALT
血 清 を添 加 し活 性 阻害 率 を 測 定 した.
結
果
1. ALT活
性 阻 害 因 子 の 存 在
Table 1に 示 す 如 く, 高ALT血
清 に患 者 血 清 を 添 加 した
場 合, 添 加 直 後 で活 性 阻害 率 は84%と
瞬 時 で活 性 低 下 を認
め, ALT活
性 阻害 因子 の 存 在 が 確 認 され た. また, こ の活
性 阻 害 は室 温 お よび4℃で
有 意 差 を認 め な か った.
2. 活 性 阻 害 を示 すALT結
合 性 免疫 グ ロブ リン (ALT-Ig)
の 同 定
活 性 阻 害 を示 すALT-Igの
同 定 は, 免 疫 混 合 法 の 沈 殿 物
を 用 い たALT活
性 阻害 実 験 に よ り行 った. そ の結 果, H鎖
の ク ラ ス で は抗IgG (γ鎖) の 沈 殿 物 で の み 活 性 阻 害 が 認 め
られ た こ とか ら, 活 性 阻 害 を示 す 患 者ALT-IgはIgGと
確
認 され た. しか し, L鎖 の タ イ プ を 明確 に 同 定 す る こ とが
で き な か った た め, Protein Gカ
ラ ムに よ りIgGを 精 製 し,
再 度, 抗 κ, 抗 λ鎖 抗 血 清 を 用 い 免 疫 沈 降物 を 形 成 させ 阻
害 実 験 を行 っ た. そ の結 果, 抗 κ鎖 抗 血 清 の沈 殿 物 で 明 ら
か な活 性 阻害 が観 察 さ れ た こ とか ら,
活 性 阻 害 を 示
すALT-IgはIgG-κ 型 で あ る こ とが 確 認 され た (Table 2).
3. 患 者IgGの
性 状
1) 免 疫 固 定 電 気 泳 動 に お け る所 見
ALT活
性 阻害 を 示 す 患 者IgGを
含 む Protein G吸 着 画 分
を用 い て免 疫 固定 電 気泳 動 を 行 い, モ ノ ク ロナー ル バ ン ド
Table 1. Inhibition response of ALT activity by patient's serum
a NS, normal saline; b Serum, high ALT serum; c PS, patient's serum; d In parentheses is the corresponding inhibition as a percentage.
が 認 め ら れ る か 否 か 実 験 を 行 っ た. そ の 結 果, Fig. 1に 示 し た 如 く, 抗IgG (γ鎖), 抗 κ鎖 抗 血 清 で は モ ノ ク ロ ナ ー ル バ ン ドは 観 察 さ れ な か っ た が, L鎖 は 明 ら か に κ鎖 優 位 で あ る こ と が 判 明 し た. 2) 患 者IgGのSDS-PAGEに お け る 所 見 精 製 し た 患 者 お よ び 正 常IgGの 分 子 量 を 確 認 す る た め, SDS-PAGEを 行 っ た. そ の 結 果, Fig. 2に 示 し た 如 く, 患 者IgG分 子 を 構 成 す る γ鎖 は 分 子 量 約55,000, L鎖 は 約 26,000と 正 常IgGと ほ ぼ 同 様 で あ り, ド メ イ ン 欠 損 な ど の 分 子 異 常 は 確 認 さ れ な か っ た. 3) 還 元 処 理 お よ び ノ イ ラ ミ ニ ダ ー ゼ 処 理 に よ る 患 者IgG のALT活 性 阻 害 実 験 患 者IgGを2-MEお よ び ノ イ ラ ミ ニ ダ ー ゼ 処 理 し, ALT 活 性 阻 害 実 験 を 行 っ た と こ ろ, こ れ ら の 処 理 に よ り患 者IgG の 活 性 阻 害 が 阻 止 さ れ る こ と は な か っ た (Table 3). 4. 基 質 お よ び 補 酵 素 の 添 加 実 験 高ALT血 清 に 基 質 (ア ラ ニ ン) お よ び 補 酵 素 (ピ リ ドキ サ ル リ ン 酸) を 一 定 濃 度 に 添 加 し, 患 者IgGの 活 性 阻 害 が 阻 止 さ れ る か 否 か 実 験 を 行 った. そ の 結 果, ア ラ ニ ン5mM, お よ び ピ リ ド キ サ ル リン 酸500μMの 濃 度 で もALT活 性 阻 害 率 は い ず れ も90%以 上 で あ り, 基 質 お よ び 補 酵 素 の 添 加 に よ り患 者IgGの 活 性 阻 害 は 阻 止 さ れ る こ と が な か っ た. 5. 患 者IgGのALT結 合 部 位 ALTの 結 合 部 位 が 患 者IgG分 子 の ど の 領 域 に あ る の か, 抗 γFc, 抗 γFab抗 血 清 と 反 応 さ せ た 沈 降 物 を 用 い て, ど の 沈 降 物 でALTの 活 性 阻 害 が 阻 止 さ れ る か 実 験 を 行 っ た. そ の 結 果, IgG分 子 のFc領 域 を ブ ロ ッ ク し た 場 合 のALT活 性 阻 害 率 は82%と ほ と ん ど変 化 な か っ た が, 抗 γFab抗 血 清 でFab領 域 を ブ ロ ッ ク した 場 合 の 活 性 阻 害 率 は0%と, 明 ら か にALTと の 結 合 が 阻 止 さ れ る こ と が 確 認 さ れ た. 考 察 酵 素 低 活 性 異 常 か ら 活 性 阻 害 を 示 す 免 疫 グ ロ ブ リ ン (失 活 因 子) の 存 在 を 最 初 に 報 告 し た の はPeel8)のLD例 で あ る が, そ の 後, 国 内 で もLD, ALP例 が 報 告 さ れ て い る2,4,5,9). IgGに よ るALT活 性 阻 害 例 は, Maekawaら10)が 最 初 に 見 出 し報 告 し て い る が, そ の 機 序 に つ い て は 未 だ 明 ら か に さ れ て い な い.
Table 2. Identification of ALT inhibitor by immunoprecipitation assay using patient's serum and purified IgG
A-IgG, anti-γ chain antiserum; A-IgA, anti-α chain antiserum; A-IgM, anti-μ chain antiserum; A-κ, anti-κ chain antiserum; A-λ, anti-λ chain antiserum.
Fig. 1. Electrophoretic
pattern
(a) of patient's
IgG
and
immunofixation pattern (b) with antisera to human IgG
(4), IgA (5), IgM (6), kappa light chain (7) and lambda
light chain (8).
1, normal serum; 2, patient's serum; 3, patient's IgG. Anode
is to the right.
Fig. 2. SDS-PAGE pattern of purified IgG with 2-ME.
1, marker; 2, normal serum; 3, patient's serum; 4, purified patient's IgG; 5, purified normal IgG.
今 回我 々は, ALT低
活 性 異 常 を 示 す 症 例 を見 出 し検 討 を
加 え た. そ の結 果, ALT活
性 阻害 因子 はIgG-κ型 蛋 白で あ
る こ とが判 明 した が, 通 常 の 患 者 血 清 を用 いた 免 疫 混 合 法
で は そ のL鎖
の 同定 は 困 難 で あ った. そ こで, 患 者IgGを
精 製 して再 度 検 索 を 行 った と ころ, κ鎖 に お い てALT活
性
阻害 を示 す こ とが確 認 さ れ た. 患 者IgGを
精 製 し免 疫 固定
電 気 泳 動 を 行 った と こ ろ, L鎖 は 明 ら か に κ鎖 優 位 で あ っ
た が, モ ノ ク ロナ ー ル バ ン ドは観 察 され なか った. しか し,
酵 素 結 合 性 を示 す 免 疫 グ ロ ブ リンは 全 体 の免 疫 グ ロ ブ リン
の ご く一 部 で あ る こ とか ら, モ ノ ク ロナ ー ル蛋 白 の存 在 を
否 定 す る こ とは で きな い.
通 常, 活 性 阻 害 を 示 す 免 疫 グ ロブ リンが存 在 した 例 で は,
活 性 の低 下 は迅 速 な もの で な く, 保 存 に よ り数 時 間 ∼数 日
の経 過 で進 行 す る ゆ る や か な性 状 の も のが 多 い. この こ と
か ら, 免 疫 グ ロブ リンが そ の 結 合 に よ り直 ち に酵 素 の活 性
に影 響 を与 え て い る の で は な く, 結 合 後 に何 らか の構 造 変
化 が 生 ず る の で は な い か とい わ れ て い る. しか し, 本 例 で
は活 性 阻 害 は瞬 時 で起 こっ て お り, これ ら既 報 の症 例 とは
異 な る機 序 の可 能 性 が考 え られ る.
一般 に, 酵 素 蛋 白 に対 して作 製 した 抗 体 は, 酵 素 活 性 を
失 活 させ る の が普 通 で あ る. しか し, 見 出 され る大 半 の酵
素 結 合 性 免 疫 グ ロブ リンは, 複 合 体 形 成 に よ り, 耐 熱 性 や
保 存 性 な ど酵 素 の 安 定 性 が 増 加 した りす る. 基 本 的 に は,
免 疫 グ ロブ リン との結 合 に よ り生 ず る酵 素 活 性 の性 状 の変
化 は さ ま ざ ま で あ り, 一 概 に論 ず る こ とは で き ない と思 わ
れ る. 免 疫 グ ロ ブ リンが 酵 素 の ど の部 分 に結 合 す る の か,
そ の部 位 と基 質 や 補 酵 素 との空 間 的 関 係, あ るい は結 合 に
よ って もた ら され る立 体 構 造 の変 化 な ど, 酵 素 の安 定 化 や
失 活 も, い ず れ も免 疫 グ ロブ リン と, この よ うな結 合 の相
違 に よ っ て決 ま る可 能 性 が あ る. 事 実, LD結
合 性IgMの
物 理 的 立 体 障 害 が 酵 素 活 性 に影 響 を 及 ぼ した 例2)や 結 合 性
免 疫 グ ロ ブ リン の糖 鎖 が失 活 に関 与 して い る例11)な
ど も
報 告 され て い る. そ こで, ALT活
性 阻害 を示 す患 者IgGを
用 い て, 2-ME処
理, ノ イ ラ ミニ ダー ゼ処 理 な どを 行 っ て
活 性 阻 害 の有 無 を確 認 した. そ の結 果, 患 者IgGの
活 性 阻
害 に変 化 は ほ とん ど見 られ ず, IgG分 子 の重 合 や シ ア ル酸
の修 飾 に起 因 した 阻害 作 用 で は な い こ とが 示 唆 され た.
多 くの酵 素 に は基 質 と補 酵 素 の結 合 部位 が存 在 してい る.
最 近, LDと
結 合 す る Bence Jones 蛋 白 (BJP) 例12)に お
い て, BJPが
構 造 異 常 を 起 こ し 補 酵 素 で あ るNAD+の
conformation と類 似 す る こ とで, LD分 子 のNAD+結
合 領 域
に 誤 認 され, そ の領 域 に入 り込 む こ とが 報 告 さ れ て い る.
そ こで, 本 例 にお い て も基 質 (ア ラ ニ ン) お よ び補 酵 素 (ピ
リ ドキサ ル リン酸) の結 合 部 位 が 活 性 阻 害 に関 与 し てい る
か 検 討 を行 った. そ の 結 果, 添 加 濃 度 を 高 くして も患 者IgG
のALT活
性 阻 害 に変 化 を認 め な か った こ とか ら, 酵 素 活 性
部 位 に患 者IgGが
直 接 結 合 し てい な い か, あ るい は 基 質 や
補 酵 素 よ り患 者IgGの
方 が結 合 部 位 に 対 し親 和 性 が 高 い 可
能 性 が 考 え られ る.
さ ら に, 患 者IgGのALT結
合 部 位 は, 抗 γFab抗 血 清 で
明 ら か に 活 性 阻害 が 阻 止 さ れ た こ とか ら, IgG分 子 のFab
領 域 の関 与 が 強 く示 唆 され, 自己抗 体 の 可 能 性 が 考 え られ
る. しか し, LDと
結 合 す るIgG型M-蛋
白例13)で は 結 合
部 位 が γFabで あ る に もか か わ らず, 抗 idiotype 抗 体 に よ り
患 者IgGのLD結
合 能 が ブ ロ ック され な い とい う報 告 もあ
り, 最 終 的 に は抗 idiotype
抗 体 に よ る活 性 阻害 を確 認 す る
必 要 が あ る.
また, 本 患 者 はC型
肝 炎 と診 断 され, ク リオ グ ロ ブ リン
と の関 連 性14)も 注 目 され た が, 血 中 か ら ク リオ グ ロ ブ リ
ンは 検 出 され なか った こ とか ら, ALT活
性 阻害 を 示 すIgG
が ク リオ グ ロブ リン の性 状 を有 して い る可 能 性 は 低 い と考
え られ る.
謝
辞
今 回 の 研 究 にあ た り, ご助 言, ご指 導 い た だ き ま した 浜
松 医 科 大 学 臨 床 検 査 医 学 講 座 の前 川 真 人 教 授 に 深 く感 謝 致
し ます.
Table 3. ALT inhibition assay by purified IgG after 2-mercaptoethanol and neuraminidase treatment
With 2-ME, treated with 0.1M 2-mercaptoethanol;
With NA,
treated with neuraminidase (5 units).
文 献
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