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Studies on the Green Pigrnents fbrmed from Chlorogenic Acid and Amho Acid (ll). -Difference of the Properties of the Pigments formed from various Nitrogen-Containing
Hiroaki HORIKAWA
Department ofBiochemistry (Director: Pro￡ Yoshihiro MATSUMURA) Tokyo Women's Medical College
The green colour solutions, which were produced by oxidizing the alkaline solutions of chlorogenic acid (or ethylcaffbate) in the presence of several nitrogen-containing compounds, have been examined by the fo11owing methods: (1) measurement of absorption spectrum (2) gel filtration (3) paper chromatography (4) hydrolysis of green colour product isolated, and the fo11owing characteristics were observed.
(a) Though the absorption spectra of the green colour solutions were almost the same in shape, variation in the position of maxima was observed as a result of diflbrences in nitrogenous compound. (b) The break-through point of the green colour substances fractionated by gel fiItration was influenced by the molecular weight of nitrogenous compound.
' (c) On paper chromatography each green colour substances migrated at thir own speed. (d) Only carboxy terminal amino acid became free and was identified from the hydrolysate of the green colour substance which had been produced by oxidizing the mixture solution containing a dipeptide.
These results suggest that chlorogenic acid would react with amino acid without transfer or removal of their amino radical.
1・緒 言 クロロゲン酸は，この成分がアンモニアアルカ リ性の下で緑色を呈することから，Payenにより 名付けられた名称であり1），植物界に広く分布す るポリフェノール化合物の一つである．Payen以 後この緑変現象に関する研究が行なわれてきた が2）岬7），生成する緑色色素の化学的研究は瓜谷ら によって行なわれた8）∼10）．すなわち，黒斑病甘藷 の被害部隣接層を重曹水に浸漬したときにもこの 現象が現れることを見い出し，詳細な検討を行な った結果，弱アルカリ鞍下でアンモニア，アミノ 酸，タンパクなどの含窒素化合物共存のもとに， ポリフェノールオキシダーゼ，またはある種の酸 化剤の作用によって起こること，クロロゲン酸を 含めてカフェイン酸エステルに共通して認められ る反応であることなどを明らかにした．しかしな がら，緑色色素の生成機構およびその化学構造は 未だ明らかでない． 著者は前回，クロロゲン酸とフェニルアラニン の混合液について，酵素酸化，空気酸化の両反応 を行ない，それぞれの反応液から緑色色素を分離 した．またそれらの赤外，可視部吸収スペクトル 図および化学的性質が近似していることから，両 反応は同一反応機構であると推定した10）．今回 は，クロロゲン酸又はカフェイン酸エチルエステ ルと種々の含窒素化合物の混合液について空気酸 化を行ない，緑色色素に関して若干の知見を得た ので報告する． n・実験材料および方法 1，クロロゲン酸（東京化成製品） 2．カフェイン酸エチルエステル：カフェイン酸をエ タノールでエステル化した。すなわち，カフェイン酸 （東京化成製品）109，99．5％エタノール（和光純薬製 品） 500ml，濃硫酸（和光純薬製品）10mlを軽く沸騰 させながら5時間加熱後，炭酸ナトリウム（関東化学製 品）で微アルカリ性にし，エチルエーテル（関東化学製 品）で繰返えし抽出する．エーテル層を集めエーテルを 留回すると，カフェイン酸エチルエステルの粗結晶を得 る．これを30％エタノールから再結晶した．mp 146∼ 147℃でこの値は文献の値と一致した12）． 3．緑色溶液の調製 クロPゲソ酸（又はカフェイン酸エチルエステル）10−4 モルを含窒素化合物10−4モル（但しタンパクは50mg）を 25孤1のMenzel緩衝液（pH 9．1）に溶解後，50℃で3 時間空気を送引して酸化反応を行ない，緑色溶液を得 た，含窒素化合物としてはアンモニア水（関東化学製 品），酢酸アンモニウム（関東化学製品），メチルアミン （東京化成製品），アミノ酸：グリシン，アラニン，ロィ シソ，リシン，フェニルアラニン，ヒスチジン（以上 Nutritional Biochemicals製品），グルタミン酸（東京化 成製品），チロシン（関東化学製品），トリプトファン（日 本理化学薬品），グリシルフェニルアラニン（東京化成製 品），ウシ血清アルブミン（第一化学薬品）を使用した． 4．緑色色素（カフェイン酸エチルエステル十グリシ ルフェニルアラニン）の分離 緑色反応液を塩酸酸性にすると，緑色色素は赤褐色に 変色して析出する（未反応のジプペチドは析出しない）， 沈殿を濾別後冷水で十分に洗浄し，デシヶーター中で乾 燥した． 5．色素の加水分解 i）塩酸による加水分解 色素5㎎，6N塩酸（関東化学製品）2mlを試験管 にとり，冊封後110℃で10時間加熱した．冷却後遠心分 離（3，000rpm，5分）し，上清の1一ブタノール（純正 化学製品）抽出液についてアミノ酸の検出を行なった． ii）カルボキシペプチダーゼAによる加水分解 Samらの方法13）に準じて行なった．すなわち，リン 酸ニナトリウム（関東化学製品），リン酸一カリウム（関 東化学製品）で調製したG．05Mリソ酸緩衝液（pH 7．8） 4m1に色素5mgを溶解し，．これにカルボキシペプチダー ゼA（ベーリンガー・マンハイム製品，牛膵臓，35U／mg） 2，5㎎相当量（あらかじめ10％塩化リチウム溶液1血1に 溶解しておく）を加え，25℃で20時間インキュベートし た．次いで塩酸酸性にして生じる沈殿（加水分解されな かった色素を含む）を遠心分離（3，000rpm，5分）し， （i）同様に処理した． 6，緑色溶液のゲル濾過 Sephadex G．25（丘ne）， G−200を使用した．カラム 1．4×15cm，溶出剤Menze1緩衝液（pH 9．1），溶出速度2 ml／30分で2mlごとに分取し，脱塩水で2倍に希釈後 685nln（101日目分光光度計）の吸光度を測定し，色素 量とした．またタンパクはフォリンーフェノール法M｝で 呈色させ，700nmの吸光度をタンパク量とした．
OD α5 α b C … e 暑 b 290 370 45り 500 波長（nm） 6QQ 700 図1反応液吸収スペクトルの経時変化 （クロロゲン酸1『5モル十アラニン10−5モル） （8DO∼450nm：原液； a＝0分；b：10分；c＝30分；d：60分；e：90分 800 450∼220nm：25倍希釈液）を測定 7．薄層クロマトグラフィー シリカゲルプレート20×20cm（東京化成製品）を使用 し，1一ブタノールー酢酸一水（4：1＝2）を展開剤 として，上昇法により室温で3時間展開した。薄層上の ペプチドおよびアミノ酸の検出には0．2％ニンヒドリン ー1一ブタノール溶液を用いた． 8．ペーパークロマトグラフィー 東洋濾紙No・50（20×15cm），展開剤は1一ブタノールー 95％エタノールー1％アンモニア水（6：2：3），およ びピリジンー95％エタノールー1％アンモニア水（1； 2：1）の2種を用い，上昇法により室温で2時間展開 した． 9．紫外および可視部吸収スペクトルの測定 124型日立ダブルビーム分光光度計を使用し，スキャ ンニングスピード（60mm／分），スリット幅（0．5nm），チ ャートスピード（60mm／分）で測定した．
皿 実験結果
1．反応中における紫外および可視部吸収スペ クトルの経時変化 クロロゲン酸，カフェイン酸エチルニステルの それぞれにアラニンを反応させ，反応液の紫外お よび可視部吸収スペクトルを0，10，30，60，90 分後に測定し，両反応を比較検討した．その結 果，両反応の吸収スペクトルの変化は全く同じ で，いずれの場合にも反応開始時には365nmに 大きなピークがあり，これが漸時減少すると共に 680nm付近に大きな吸収が現れてくる（図1に はクロロゲン酸十アラニン反応液の吸収スペクト ル図を示した）． 2．緑色溶液の可視部吸収スペクトルの比較 クロロゲン酸（またはカフェイン酸エチルエス テル）と種々の含窒素化合物の混合液から得た OD α5 500 600 700 800 波：長（［m） 図2（i）緑色溶液の可視部吸収スペクトル（クロ ロゲン酸） alアンモニア，酢酸アンモニウム；b：リシン； c；アラニン：d＝アルブミン；elフェニルアラ ニン；f：トリプトファン OD O．5 b C d e f q 500 600 700 86b 波長（nm） 図2（ii）緑色溶液の可視部吸収スペクトル（ヵフ ェイン酸エチルエステル） a∼f：（i）：に同じ表1 緑色溶液の最大吸収波長（nm）
一∼
ヘへ
窒素化合物 ∼＿
グリシン アラニン ロイシン グルタミン酸 リシソ フェニルアラニン チロシン ヒスチジン トリプトファソ グリシルフェニルアラニン アルブミソ 酢酸アンモニウム アンモニア A 680 684 686 685 675 695 695 695 702 ＿＊ 683 B 678 683 686 685 675 して得たペーパークロマトグラムを示した．図か ら明らかなように，使用する含窒素化合物が異な れば，生成する緑色色素のRfは異なり，かつ， クロロゲン酸系色素はカフェイン酸エチルエステ ル系色素のRfより小さい．またアルブミンの場 合は，いずれもRfは0である， 695 695 O．10 695 700 682 685 椙 妻αQ5 e A：クロロゲン酸系色素溶液 B：カフェイン酸エチルエステル系色素溶液 ＊ 褐色溶液となった O Albumln 、ハ、 ノ へ ／6@＼、 Phe X xA｝α ！ T O．5全 蓬 亀 緑色溶液の可視部吸収スペクトルを測定した（図 2，表1）．図2にはその一部を示したが，両反応 液ともアンモニア，酢酸アンモニウム以外は近似 した吸収スペクトル図を与え，かつ，それらの λmaxは675nm（Lys）∼702nm（Trp）問に位置す る．また芳香環および異節環を含むアミノ酸を 使用して得た緑色溶液の2maxは，いずれも長波 長側にある．さらに含窒素化合物が同じならぼク ロロゲン酸から生じる緑色溶液もカフェイン酸エ チルエステルから生じる緑色溶液もそのλmaxの 値は殆ど同じである（表1）． 3．Sephadexカラムクロマトグラフィー クロロゲン酸とアラニン，フェニルアラニンお よびアルブミンの反応で得た各緑色溶液について ゲル濾過を行なった．図3一（DにはSephadex G−200での結果を，（ii）にはG・25（丘ne）での結 果を示した，含窒素化合物の分子量の大きさに応 じて生成した緑色色素の溶出位置は早くなってい る．またアルブミンの場合には，色素の溶出位置 とアルブミンの位置は一致している。 4．ペーパークロマトグラフィー 図4一（i），（ii）には，1一ブタノールー酢 酸一水（4：1：2）およびピリジンー95％エタ ノールー1％アンモニア水（1：2：1）で展開 0 5 10 15 フラクションNo。 図3（1）緑色溶液のSephadex G−200によるゲル濾過 O，10 1拝 至麟 § 0 A！bu面R ，区、 ！＼ 咲 、 、 Phe㍗
× o ！ 7 α5杢 窪3
0 5 フラクションNo， 10 150 図3（ii）緑色溶液のSephadex G−25によるゲル濾過 Rl α5qbcdefαbCdef
図4（董）緑色色素のペーパークロマトグラム 展開剤：ピリジンー95％エタノールー1％アンモ ニア水（1：2：1） a：メチルアミン；b：グリシン；c：アラニン； d：フェニルアラニン；e：ロイシン；f：アルブミンクロロゲン藪系色素 カフニLイン巌1：チルエステル系色素 Rf α5
o
○○O
o⊂）qbcdefこbcde
・⑧」 図4（鑓）緑色色素のペーパークロマトグラム 展開剤：1一ブタノールー95％エタノールー1％ 1．5，2．0の各混合液について酸化反応を行な った．すなわち，0．01Mクロロゲン酸1m1と， 0．01Mフェニルアラニン1mlの混合液を， Men− zel緩衝液（PH 9．1）で13m1として後反応させ， 吸光度の増加が殆ど認められなくなる3時間後 に，695nmでの吸光度を測定し，これを色素量 とした．その結果は図6の通りで，モル比1以上 では生成色素量は殆ど横這いとなった． アンモニア水（6：2 a∼f：（i）に同じ ：3） 5，色素（カフェイン酸エチルエステル＋グリ シルフェニルアラニン）の加水分解 塩酸およびカルボキシペプチダーゼAで色素を 加水分解し，薄層クロマトグラフィーでアミノ酸 の検出を行なった．その結果，いずれの加水分解 液からもフェニルアラニンを検出した（図5）． Rf O．5…○ ○ ○ ○
…P瓦・○ Gly（⊃ 0 α b c d 図5 緑色色素（ク畳目ゲン酸十Gly−Phe）加水分 解液の薄層クロマトグラム 展開剤：1一ブタノールー酢酸一水（4：1：2）； 発色剤：ニソヒドリン a＝標準物質；b：カルボキシペプチダーゼAによ るグリシルフェニルアラニンの加水分解液；c： カルボキシペプチダーゼAによる色素の加水分 解液；d：塩酸による色素の加水分解液 6．緑色色素生成量に及ぼすモル比（アミノ酸／ クロロゲン酸）一の影響 アミノ酸としてフェニルアラニンを使用し， クロロゲソ酸に対するモル比0．1，0．5，1．0， 爵 § O．5 0 0．1 図6 0．5 LO l．5 2．O モ」眠（フェゴレ万二ψDロゲン醐 色素生成量に及ぼすモル比の影響W・考 察
クロロゲン酸と含窒素化合物−（アンモニア；ア ミノ酸，ペプチド，タンパクなど）の混合液をア ルカリ性の下，ポリフェノールオキシダーゼ，あ るいは或る種の酸化剤で酸化することによって生 じる緑変現象は，．グロ』ロゲン酸を含めてカブ出イ、 ン酸エステルに共通するものであり，またこの反 応機構については，酸化されて生じたカフェイン 酸エステルのキノンがStrecker反応によって， アミノ酸，ペプチド，タンパクを酸化分解して， アミノ基を含む還元性物質に変わり，これが更に キノン成分と縮合，あるいは更にアンモニアも縮 合に加わる反応などにより，緑色色素を生成する と推定されている8）帽10）， 今回，著者が得た実験結果の中，図1，図2お よび表1に示した結果，すなわち，クロロゲン 酸，カフェイン酸エチルエステルの各々とアラニ ンの混合液を空気酸化し，その反応液の吸収スペ クトルを時間を追って測定した結果（図1），両成 分と種々の含窒素化合物から得た緑色溶液の可視 部吸収スペクトルの測定結果（図2）およびそれ らのえmaxの比較結果（表1）はこの緑変現象が カフェイン酸エステルに共通するものであることを，またアンモニア，酢酸アンモニウム以外の可 視部吸収スペクトル図が近似していることは，ア ミノ基の関与する反応であることを示している． アンモニア（酢酸アンモニウム）を使用して得た緑 色溶液もアミノ基をもつた化合物で得た緑色溶液 も，肉眼では同じような緑色を呈してはいるが， 吸収スペクトル図は異質のものあり，したがって その反応機構は異なっているとも考えられる． 一方，カフェイン鯵チチルェ苓テルとグリシル フェニルアラニンから得た色素を，カルボキシペ プチダ一睡Aおよび6N塩酸で加水分解し，分解 液からカルボキシ末端アミノ酸であるフェニルア ラニンだけを検出した（図5）．この結果はカフェ イン酸エチルエステルはグリシンのアミノ基と反 応して発色母体を形成し，かつ，フェニルアラニ ンはペプチド結合したまま色素分子中に存在して いることを示している．すなわち，アミノ酸，ペ プチド，タンパクのアミノ基は脱離されていない ことを意味している．クロロゲン酸とアラニン， フェニルアラニン，アルブミンの各混合液から得 た緑色溶液のゲル濾過の結果（図3）およびペー パークロマトグラフィーでアルブミンを使用して 得た色素のRfが0であった事実（図4）は，い ずれも上記の結果と矛盾しない．また，芳香環， 異節環をもつアミノ酸を使用して得た緑色溶液の えmaxは他の含窒素化合物に比較して，すべて長 波長側に偏っている（表1）．この原因は，これら の環が色素の発色母体と共役して深色効果を及ぼ していると考えることができる．このことは，カ フェイン酸エチルエステルとグリシン、グリシル フェニルアラニン，フェニルアラニンの各混合液 から得た緑色溶液のλmaxがそれぞれ678nm， 682nm，695nmと次第に長波長側へ移動してい ることからも明らかである． 以上の結果から，緑色色素が生成する際，アミ ノ酸のアミノ基は脱離せずにアミノ基の部分でカ フェイン酸エステルと反応するものと考えること ができる．またクロロゲン酸系色素，カフェイン 酸エチルエステル系色素のペーパークロマトグラ フィーでのRfの大きな差は（図4），おそらく前 者は親水性原子団であるキナ酸を，後者は疎水性 のエチル基を色素分子中にもつているためと考え られる．すなわち，反応過程でエステル結合は加 水分解されていない． 図6はこの緑色反応におけるクロロゲン酸とア ミノ酸の反応モル比を調べた結果を示したもので ある．図から明らかなように，モル比が1を越え ると吸光度は横這いになり，1：1モルの比で反 応している可能性を示唆している． なお，著者は前報11）でクロロダン酸と．フェニル アラニンから得た緑色溶液をアセトンー塩酸で処 理後，Sephadex G−25で分画し，緑色色素の他に青 紫色素（E−2，A−2）を得，それらのえmaxがE−2 （580nm），A−2（570nm）であることを報告し た．しかし今回，実験6で，同じ緑色溶液をアセ トンー塩酸処理せずに直接Sephadex G−25でゲル 濾過を行なったが，青紫色素は認められな：かった （図3一（ii））．この違いは塩酸処理を含む前処理 で緑色色素の一部が青紫色に変色したためと考え ている． V・要 約 1） クロロゲン酸，カフェイン酸エチルエステ ルと種々の含窒素化合物の混合液を空気酸化して 得た緑色溶液の吸収スペクトル図はアンモニア， 酢酸アンモニウム以外は極めて近似しており，こ の両成分が同一反応機構で表わされることを示し た． 2） 色素の加水分解結果および色素溶液のゲル 濾過結果は，アミノ基が脱離せずにカフェイン酸 エステル（クロロゲン酸を含む）と反応している ことを示した． 3）色素生成量に及ぼすモル比（アミノ酸／ク ロロゲン酸）の影響を検討した結果は，アミノ酸 とカフェイン酸エステルがモル比1で反応してい る可能性を示した． おわりに，終始ご指導していただきました松村義寛教 授に厚く感謝致します．また生化学教室の先生方のご援 助にも併わせて感謝致します．
文 献
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