バキュロウイルスの感染特性とそれを活用した害虫管理への利用

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et al., 2007）。本邦ではチャおよびリンゴのハマキガ類を対象とした GV 製剤が 2003 年に，ダイズ，エダマメ，イチゴ，レタスのハスモンヨトウを対象とした NPV 製剤が 06 年にそれぞれ上市されている。ハスモンヨトウ NPV 製剤は適用作物が拡大され，2008 年 11 月現在，キャベツ，シソにも散布できる。これらウイルス殺虫剤として利用されているバキュロウイルスは，宿主昆虫に感染してから 5 ∼ 7 日程度で致死させる，バキュロウイルスとしては速効的な病原性をもつものが多い。しかし，バキュロウイルスには感染宿主を長生きさせる遅効的な病原性をもつ種類も存在し，上述のハマキガ類の GV 製剤はこちらに該当する。そこで，本稿では宿主の致死までに要する時間を指標としてバキュロウイルスの病原性について解説し，その感染特性に応じた害虫管理における活用法について検討する。 I バキュロウイルスの感染様式 バキュロウイルスは，ウイルス包埋体に汚染された植物を宿主幼虫が摂食することによって経口感染する（図― 2）。バキュロウイルスのウイルス粒子は，感染の過程で，包埋体由来ウイルス（Occlusion ― derived virus : ODV）と出芽型ウイルス（Budded virus : BV）の 2 種類が産生される。ODV と BV はウイルス DNA の遺伝子情報は同一だが，ヌクレオカプシドを包むエンベロープの組成が異なる。包埋体に包まれた ODV は，宿主中腸の消化液で包埋体が溶かされることによって中腸内腔に放出され，中腸細胞と ODV エンベロープの膜融合により ODV 内のヌクレオカプシドが細胞に侵入する。中腸細胞あるいは中腸組織内に存在する気管皮膜細胞で増殖したヌクレオカプシドは，宿主の細胞膜をまとって血体腔に放出され，BV となる。BV は宿主体内での細胞間感染に特化しており，宿主細胞のエンドサイトーシス（食作用）を利用して細胞に侵入し，増殖を繰り返す。感染後期になると細胞の核内で ODV とそれを包む包埋体が形成される。多くの NPV および一部の GV は，宿主体内のあらゆる組織に感染して増殖することができる。25℃条件下では，感染幼虫は 5 ∼ 6 日程度で体内にウイルス包埋体が充満して発育を停止し，その後 1 ∼ 2 日で死亡する。例 はじめに バキュロウイルスは，昆虫に特異的に感染する環状 2 本鎖 DNA ウイルスである。その形態的特徴から，バキュロウイルス科は包埋体に複数のウイルス粒子が含まれる核多角体病ウイルス（nucleopolyhedrovirus : NPV）と単一のウイルス粒子が含まれる顆粒病ウイルス（granulovirus : GV）の 2 属に分類されていた（図― 1）。近年，バキュロウイルス科の分類が再検討され，チョウ目に感染する NPV と GV をそれぞれアルファバキュロウイルス属とベータバキュロウイルス属に改称し，ハチ目に感染する NPV をガンマバキュロウイルス属，ハエ目に感染する NPV をデルタバキュロウイルス属として独立させることが提言され（JEHLEet al., 2006），2008 年に国際ウイルス命名委員会によって承認された。しかし，新称の認知度はいまだ低く，本稿ではチョウ目に感染するバキュロウイルスのみについて述べるので，ここでは従来の NPV および GV の呼称を用いることとする。バキュロウイルスの中でも NPV は，包埋体の直径が数μm あることから，ウイルスとしては珍しく光学顕微鏡での観察が可能である。そのため，古くから昆虫病原体として知られており，カイコなどの有用昆虫の保護やチョウ目害虫に対する防除資材としての利用に関する研究成果が蓄積されてきた（ARIF, 2005）。微生物殺虫剤として実用化され成果を上げているバキュロウイルスは，ブラジルにおけるダイズのヤガ科害虫に対する Anticarsia gemmatalis NPV 製剤や，米国，オーストラリア，中国等でヤガ科タバコガ類用に使用されている Helicoverpa zea NPV 製剤などが知られている（MOSCARDI, 1999）。また，欧州においては果樹のコドリ ンガ防除に Cydia pomonella GV 製剤が広く利用されて いる。しかし，この製剤にはウイルス殺虫剤としては初めて野外における抵抗性系統の出現が報告され，ウイルス殺虫剤においても化学合成農薬と同様に厳密な散布間隔の管理が必要であると指摘されている（ASSER― KAISER

Pathology of Baculoviruses and Their Use in Insect Pest Management. By Shigeyuki MUKAWAand Chie GOTO

（キーワード：核多角体病ウイルス，顆粒病ウイルス，微生物殺虫剤）

バキュロウイルスの感染特性とそれを活用した

害虫管理への利用

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え中央農業総合研究センター

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ガ GV（XecnGV）を接種した結果，幼虫の死亡が観察されるのは接種後 10 日以降であり，最長 27 日間の生存が認められた（図― 3 C）。この例では，ウイルスを接種しない対照区の幼虫は 9 ∼ 11 日後に蛹化するのに対して，XecnGV 感染虫は終齢（6 齢）幼虫期が延長して顕著に肥大成長し，蛹化することなく死亡する（MUKAWA and GOTO, 2008）。えば，ヨトウガ 5 齢幼虫に 95％致死濃度のヨトウガ NPV（MabrNPV）を経口接種した場合，幼虫は接種後 7 日前後で死亡する（図― 3 A）。この傾向は同ウイルスをアワヨトウ 5 齢幼虫に接種した場合も変わらない（図― 3 B）。一方，主にヤガ類に感染する多くの GV では，感染部位に組織特異性があり，脂肪体のみで包埋体が産生され，宿主の致死までに長時間を要する。例えば，アワヨトウ 5 齢幼虫に 95％致死濃度のシロモンヤ核多角体病ウイルス Nucleopolyhedrovirus（NPV）顆粒病ウイルス Granulovirus（GV）ウイルス粒子包埋体ヌクレオカプシド 0.4 ∼15μm 0.12 ∼ 0.3 μ m ヌクレオカプシド 0.3 ∼0.5μm 図 −1 バキュロウイルスの形態ウイルス粒子はゲノム DNA を含むヌクレオカプシドがエンベロープ（外皮）によって包まれた桿状（棒状）の形状をとっており，これがさらにタンパク質の塊に内包されて包埋体を形成する．NPV の包埋体は多角体と呼ばれ，複数のウイルス粒子を含む．GV の包埋体は顆粒体と呼ばれ，単一のウイルス粒子を含む．出芽型ウイルス（BV）包埋体由来ウイルス（ODV）包埋体 ① ④ 全身の組織血体腔 ③ 中腸細胞 ⑤ ② 中腸 図 −2 バキュロウイルスの感染過程 ①幼虫が包埋体を摂食することにより経口感染する．②包埋体がアルカリ性の消化液で溶解し，内部の ODV を放出，ODV が中腸細胞に膜融合してヌクレオカプシドが細胞内に侵入する．③細胞の核内でウイルスが増殖し，宿主細胞膜をまとって BV として血体腔に出芽する．④ BV が様々な組織の細胞に感染し，増殖を繰り返す．⑤感染後期に ODV とそれを包む包埋体が形成される．

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60 ∼ 66 時間後に最大濃度に達した（MUKAWAand GOTO, 2008）。これらウイルスの増殖を Gompertz モデルにあてはめて解析したところ，予想に反してヨトウガ体内における MabrNPV の増殖速度とアワヨトウ体内における XecnGV の増殖速度は同等であることが明らかになった（MUKAWAand GOTO, 2008）。MabrNPV は体内で BV が最大濃度に達してから約 4 日で宿主を殺すのに対して， XecnGV は 7 日以上宿主を生存させる（図― 4）。すなわち，バキュロウイルスが体内で増殖する速度にはウイルス種間で差はなく，致死時間は宿主血体腔内で BV が充満した後にウイルスの戦略に依存して決まると考えられた。一般に NPV に感染した宿主は行動を制御され，感染末期に植物体の上部に移動する。死体はウイルスが作る酵素によってすみやかに溶解し，風雨により飛散して植物体を広く汚染し，次の感染源となる。この性質のために宿主個体群密度が高いとき，NPV はしばしば流行病を引き起こす。すなわち，速効的なバキュロウイルスは宿主が高密度のうちにすみやかに感染を連鎖させることによって，宿主個体群中でのウイルス増殖を最大化する戦略をとっていると考えられる。そのために，宿主体内で増殖後なるべく早期に宿主を殺して，包埋体を環境中に拡散させる必要があるのだろう。一方，多くの GV では主に脂肪体のみで包埋体が産生される。そのため，宿主の脂肪体が最大量に達するまで発育を許容しないと包埋体の産生量が十分に得られないと予想される。そこで，遅効的な GV は 1 頭の宿主をウイルス増殖の資源として最大化させるために，幼虫の状態で延命させる制御をしていると考えられる。 II 宿主体内におけるウイルス増殖特性 宿主を早く致死させる速効的な MabrNPV と長期間生存させる遅効的な XecnGV では，体内でのウイルス増殖速度が異なるのだろうか？ウイルスに感染した宿主幼虫から経時的に体液を採取し，遠心分離によって血球を除去することによって，体液中に遊離した BV のみを得ることができる。筆者らはこの体液上清から DNA を抽出して，定量的 PCR で目的ウイルスの DNA 量を測定することにより，宿主体内での BV の増殖特性を調査した。MabrNPV を接種したヨトウガ幼虫体内におけるウイルス増殖を調べた結果， MabrNPV の BV は接種後 20 時間以内に体液中に出現し，その後 40 ∼ 60 時間で最大濃度に達することがわかった（MUKAWAand GOTO, 2006）。同様の方法で，アワヨトウ体内における XecnGV の BV 増殖についても調査したところ，接種後 18 時間以内に BV が体液中に遊離し，（A）（B）（C） 100 80 60 40 20 0 100 80 60 40 20 0 100 80 60 40 20 0 0 4 8 12 16 20 24 28 生存率︵％︶ 0 4 8 12 16 20 24 28 0 4 8 12 接種後日数 16 20 24 28 図 −3 バキュロウイルスを接種された幼虫の生存率の推移小滴飲下法によりヤガ類 5 齢幼虫にウイルス包埋体懸濁液を接種．（A）MUKAWAand GOTO（2006）の方法に従い，ヨトウガに MabrNPV を 106_{包埋体/larva 濃} 度で接種．（B）アワヨトウに MabrNPV を 106_包埋体/larva 濃度で接種．（C）アワヨトウに XecnGV を 107.5_{包埋体/larva 濃度で接種．} 体液中の B V 濃度接種後日数 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 MabrNPV XecnGV MabrNPV の場合 XecnGV の場合病徴致死病徴致死 図 −4 宿主体液中のウイルス濃度の推移と病徴発現との関係 MabrNPV では接種 4 ∼ 5 日後に体色の乳白色化や活動性の低下などの病徴が現れ，約 7 日後に死亡する． XecnGV では接種 6 ∼ 8 日後に体色の黄白色化や脂肪体の過剰生産による肥大成長などの病徴が現れ， 10 ∼ 20 日後に死亡する．

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ってウイルス間での宿主資源をめぐる競争が生じることはタバコガ類のウイルスでも報告されており（HACKETT et al., 2000），宿主体内で速やかに増殖する GV が NPV 感染に干渉するのではないかと考えられる。そこで，筆者らは XecnGV の包埋体タンパク質をアルカリ条件で溶解し，遠心分離によってウイルス粒子を除去した上清を調整することで，GV による NPV 感染増進作用のみを引き出すことを試みた。この GV 上清（GVPs）には，少なくとも二つのエンハンシンが含まれることが推定され，アワヨトウ 5 齢幼虫に対する MabrNPV 感染増進効果が示された（MU K A W A and GO T O, 2007）。さらに， GVPs の MabrNPV への添加により，MabrNPV 単独接種時の 10％以下の濃度でヨトウガ，オオタバコガの 2 齢幼虫を効果的に防除できることが示された（MUKAWA and GOTO, 2007 ; MUKAWAet al., 2008）。この NPV 感染増進効果はヨトウガ 4 齢および 5 齢幼虫でも認められ， GVPs 濃度に関しても効果を維持したまま低減できることが確認されている（務川・後藤，未発表）。今後，この技術を発展させて，NPV と GV の 2 種を製造するコストに見合うだけの低濃度で安定的に高い効果を得られるウイルス殺虫剤の開発が見込まれる。（ 2 ）接種的な散布の有効性速効的なバキュロウイルスは短いサイクルで感染を拡大するため，連続的に宿主が存在するような条件下では，圃場内で流行病を引き起こす可能性が高く，優れた防除効果を発揮する。このようなウイルスは食害量の少ない若いステージで害虫を殺すことができる反面，宿主の肥大成長を許さない分，1 頭の感染宿主が生産する次世代ウイルス量は少なくなる。そのため，害虫の発生世代が重ならず，感染可能な宿主が断続的にしか出現しない場合には，圃場内でのウイルス密度は急激に低下すると予想される。事実，これまでのバキュロウイルスの害虫管理への利用は，持続的効果を期待しない大量散布が主流であった。しかし，永年性作物などで，周期的に害虫が発生を繰り返す条件では，宿主当たりのウイルス増殖量を最大化する遅効的なバキュロウイルスのほうが持続的な防除効果を期待できる。実際に，ハマキガ類用の GV 製剤として日本で販売されている遅効性の GV では，ウイルスを散布してから 2，3 世代後の害虫に対しても高い感染率を維持することが知られている（和田， 2003；佐藤，2004）。すなわち，遅効的なバキュロウイルスは接種的散布により長期的に害虫を防除できるため，牧草地，果樹や森林などで利用できる可能性が考えられる。 III 害虫管理への利用 速効的なバキュロウイルスは世界中で製剤化され害虫管理に利用されているが，遅効的なバキュロウイルスの利用例は少ない。確かに，宿主の最大化を図るようなウイルスは，そのまま散布すると害虫による一時的な食害量の増加をもたらす危険がある。しかし，遅効的なバキュロウイルスにも有用な機能があり，その潜在的な利用の可能性は決して小さくない。ここでは，その利用法を紹介する。（ 1 ）感染増進物質としての利用ウイルス殺虫剤の欠点として，ウイルスが生きた細胞中でしか増殖できないために生産コストが高くなる点が挙げられる。安価な製剤を製造するためには，製剤当たりのウイルス濃度を低減するのが近道である。しかし，害虫がバキュロウイルスに対して高い感受性を示す発育段階は，多くの場合，若齢幼虫期に限られており，発育が進むにつれ幼虫のウイルス感受性は低下する（BRIESE, 1986）。圃場において幅広いステージで存在する害虫に対して安定した効果を発揮させるためには，低濃度でも中齢以降の幼虫に感染させられる技術の開発が必要である。そこで，バキュロウイルスの感染性を増強するような物質が古くから探索され，スティルベン系蛍光漂白剤などに NPV の感染増進作用が発見されている（後藤， 1999）。一部の遅効的な GV や昆虫ポックスウイルスなどの昆虫病原ウイルスが産生するタンパク質にも，NPV 感染増進効果が見出されている。GV 由来のウイルス感染増進物質はタンパク質分解酵素の一種で，エンハンシンと呼ばれている。エンハンシンには，病原体侵入に対する防御壁である昆虫中腸の囲食膜の構成成分を分解して囲食膜を崩壊させる作用，並びにウイルス粒子のエンベロープと宿主の細胞膜との膜融合を促進する働きが報告されている（CORSAROet al., 1993）。このようなウイルス由来のタンパク質ならば，蛍光漂白剤のような難分解性の化学合成物質と違って環境への影響が少ないと判断されるので，GV を速効的な NPV 殺虫剤の助剤として利用する試みがなされている。既知のバキュロウイルスの中で最大のゲノムサイズをもつ XecnGV には，四つのエンハンシン遺伝子が存在する（HAYAKAWAet al., 1999）。XecnGV を NPV とともにシロモンヤガ幼虫に接種すると，5 齢では NPV 感染増進効果が認められる（GOTO, 1990）。しかし，4 齢では GV 感染の増加によって NPV 感染増進効果が阻害される（GOTO, 1990）。GV と NPV が重複感染することによ

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生物が関与しており（FUXA, 2004），保全された標的外生物の存在によってバキュロウイルスの効果は増大するものと期待できる。すなわち，IPM 技術と組み合わせて安定的な害虫密度の抑制を図るうえで，バキュロウイルスをはじめとする天敵微生物の活用場面は今後大きく増えることが予想される。 引用文献

1）ARIF, B. M.（2005）: J. Invertebr. Pathol. 89 : 39 ∼ 45. 2）ASSER― KAISER, S. et al.（2007）: Science 317 : 1916 ∼ 1918. 3）BRIESE, D. T.（1986）: The biology of baculovirus, vol. 2, CRC

Press, Boca Raton, Florida, p. 237 ∼ 263.

4）CORSARO, B. G. et al.（1993）: Parasites and Pathogens of Insects, vol. 2 Pathogens, Academic Press, New York, p. 127 ∼ 145. 5）FUXA, J. R.（2004）: Agric. Ecosyst. Environ. 103 : 27 ∼ 43. 6）後藤千枝（1999）: 植物防疫 53 : 303 ∼ 307．

7）GOTO, C.（1990）: Appl. Entomol. Zool. 25 : 135 ∼ 137. 8）HACKETT, K. J. et al.（2000）: J. Invertebr. Pathol. 75 : 99 ∼ 106. 9）HAYAKAWA, T. et al.（1999）: Virology 262 : 277 ∼ 297. 10）JEHLE, J. A. et al.（2006）: Arch. Virol. 151 : 1257 ∼ 1266. 11）MOSCARDI, F.（1999）: Annu. Rev. Entomol. 44 : 257 ∼ 289. 12）MUKAWA, S. et al.（2008）: Appl. Entomol. Zool. 43 : 323 ∼ 329. 13）―――― and C. GOTO（2006）: J. Gen. Virol. 87 : 1491 ∼ 1500. 14）――――・――――（2007）: J. Econ. Entomol. 100 : 1075 ∼ 1083. 15）――――・――――（2008）: J. Gen. Virol. 89 : 915 ∼ 921. 16）佐藤威（2004）: 植物防疫 58 : 463 ∼ 467． 17）和田哲夫（2003）: 同上 57 : 560 ∼ 562． おわりに 近年，安全・安心な農作物に対する消費者の需要増加や，環境保護に対する意識の高まりから，環境保全型農業の推進が望まれている。そのために，総合的有害生物管理（IPM）の技術体系として，化学的防除に加えて物理的防除，耕種的防除，および生物的防除を組み合わせた作物保護が進められている。生物的防除では，標的外生物に影響の少ない微生物農薬の使用による圃場内および周辺の生物多様性の保全や，これに伴う土着天敵の保護利用などの技術が普及しつつある。バキュロウイルスは速効的なものでも害虫の致死までに 1 週間近くを要するが，感染幼虫は死亡の 2 ∼ 3 日前には活動性の低下などの病徴を現す。このような幼虫は天敵による攻撃を回避する能力に劣ることが推測され，害虫密度低下に効果が現れるのは感染による致死時期よりも早いかもしれない。捕食性天敵が感染虫と健全虫の区別なく捕食行動を示す例や，捕食者の排泄物中から活性のあるウイルス包埋体が検出された例も知られている。圃場におけるバキュロウイルスの分散には，捕食者や捕食寄生者などの天敵や感染死体を食べるハエなどの