Title
Isolation and characterization of Kit-independent melanocyte
precursors induced in the skin of Stell factor transgenic mice( 内
容の要旨(Summary) )
Author(s)
川口, 敦司
Report No.(Doctoral
Degree)
博士（医学）甲 第716号
Issue Date
2007-03-25
Type
博士論文
Version
URL
http://hdl.handle.net/20.500.12099/23090
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氏名(本籍) 学位の種類 学位授与番号 学位授与日付 学位授与要件 学位論文題目 審 査 委 員 川 口 敦 司(岐阜県) 博 士(医学) 甲第 716 号 平成19 年 3 月 25 日 学位規則第4条第1項該当 IsolationandcharacterizationofKit-independentmelanocyteprecursors inducedin the skin of Stee[factor transgenic mice
(主査)教授 清 水 克 時 (副査)教授 園 貞 隆 弘 教授 北 島 康 雄 論文内容の要旨 Steel因子(SLF)はチロシンキナーゼ受容体であるKITのリガンドであり,メラノサイト(色素細 胞)の発生において不可欠なものと考えられている｡SLFとKITの機能を失ったマウス(がやn) は,皮膚のメラノサイトを欠損するため白斑や全身白色の表現型を呈する｡メラノサイト前駆細胞の 発生にはKITシグナルが必要とされているが,毛包で生涯維持されるメラノサイト幹細胞自身の自己 再生はEITシグナルに依存しないことが示されている｡ 今回の研究で,皮膚の基底層に異所性にSLFを発現するマウス(SLF transgenicmice)の表皮全体 にKIT非依存性のメラノサイト前駆細胞が誘導され,それはKITのシグナル伝達を阻害する抗体であ るACE2を投与したときに色素斑を形成する細胞であることが明らかとなった｡それらの前駆細胞をフ ローサイトメトリーで同定分離し,Fノfroでの分化特性を評価した結果,毛包の色素細胞幹細胞に類似 した未熟な細胞であることが確認された｡
【研究対象と研究方法】
KIT非依存性メラノサイト前駆細胞を視覚化するため,C57BL/6マウスを背景とするヘテロ接合体 SLF TgマウスにPBSで溶解したACK2抗体(0.1mg)を出生後0日目,1日目そして3日目に皮下投与 した｡同腹子の野性系マウスをコントロールとした｡フローサイトメトリー解析用のSLFTgマウスは 同様にACK2抗体を出生後0日目,1日目に投与した｡ACK2処理,未処理の生後2日目SLF Tgマウス の表皮をトリプシンで剥離し,3%血清含有PBSで洗浄後,SM培地に再懸濁した｡ 分離された細胞をラット抗マウスFcガンマレセプター(2.4-G2,BD Bioscience)を用い氷上で阻 害した後,FITC一複合化ラット抗マウスCD45(30-Fll;BDBioscience)で氷上染色し,アロフィコシア ニンー複合化ラット抗マウスc-Kit(2B8,BD Bioscience)を加えインキュベー卜した｡全ての細胞選別と解析は,FACS Vantage dual-1aser flow-CytOmeter(Becton-Dickinson)で行った｡
選別されたメラノサイト前駆細胞を,ST2問質細胞を敷きつめた6穴プレート上にCloneCyt Plus v 3.1System(Beckton-Dickinson)を用い播種し,10%FCS含有α-MEM(Invitrogen)に,10.7Mデキサ メサゾン(Dex;Sigma),20pM繊維芽細胞成長因子-2(bFGF;R&D Systems),10pMコレラトキシン (CT;Sigma),そして100ng/mlヒト組換え型endothelin-3(EDN3;PeptideInstitute,inc.)を添加し た培地で培養した｡
-77-【結果および考察】
ACK2を投与されたSLF transgenic miceの背側皮膚は一様に,そして完全に色素沈着していた｡ま
た腹側領域には多数の色素斑が観察された｡個々のマウスで色素斑の濃度が異なっているのは,メラ ノブラストの発育段階の微妙な違いによるものと考えられた｡腹側よりも背側の皮膚でより濃い沈着 を認めたが,これはKIT非依存性の前駆細胞が背側により多く誘導されていることを示すと考えられ た｡B6を用いたコントロールにおいては,同条件でACE2を投与後色素斑は認めな.かった｡胎生13･5 日にACK2を投与されたSLFtransgenicmiceは背側の皮膚に少数の色素斑を認めたが,腹側には認め なかった｡ 出生3日目のSLF transgenic miceの表皮をフローサイトメトリーで分析した結果,ACK2未投与群 では細胞全体の11.2パーセントがKit+cD45 であったが,出生直後にACK2を投与したtransgenicmice の表皮では,全体の1.73パーセントのKit+cD45 細胞が存在することが確認された｡ ACK2を投与した野性型マウス表皮ではKit+cD45 細胞は全く検出されなかった｡FACSを用いこれらの Kit+cD45一前駆細胞をソーティングしST2上で培養を行った結果,ACK2非投与群では色素沈着したメラ ノサイトを含むコロニーが培養8日目頃にかすかに認められ,その後11日まで増加し続けた後,定常 状態となった｡一方,ACK2投与群では11日目から増加が始まり,13日目以降には増加が停止した｡ このように,ACK2投与によりメラノサイトに分化可能なKit+cD45.メラノサイト前駆細胞の総数は減 少したが,色素細胞への分化が2日以上余計に必要な,より未熟な前駆細胞あるいは幹細胞と考えら れる細胞が検出された｡これらの細胞は,培養16日目にはコントロール群と変わりない色素沈着密度 が得られていることから,成熟したメラノサイトへの分化能力は正常であると考えられる｡ 論文審査の結果の要旨 申請者 川口敦司は,SLFtransgenicmiceで特異的に誘導されるメラノサイト前駆細胞を実際にフ ローサイトメトリーを用いて単離し,その細胞が通常の前駆細胞に比べてより未熟であることを培養 により明らかにした｡この細胞は,ごく少数しか存在せず,性質が明らかでない毛包の色素細胞幹細 胞の動態を解析するモデルとして有用である｡ 本論文は有用な研究ツールを提供した研究として,今後の幹細胞生物学の発展に少なからず寄与す るものと認める｡ 【主論文公表誌】 IsolationandcharacterizationofKit-independentmelanocyteprecursorsinducedintheskinof Steelfactortransgenicmice Pigmentcellresearch(inpress).
