Title
Identification, Differentiation and Detection of Rhizoctonia
Species Using Molecular Techniques( 内容・審査結果の要旨
(Summary) )
Author(s)
戸田, 武
Report No.(Doctoral
Degree)
博士(農学) 甲第338号
Issue Date
2004-03-15
Type
博士論文
Version
URL
http://hdl.handle.net/20.500.12099/2679
※この資料の著作権は、各資料の著者・学協会・出版社等に帰属します。氏 名(本個)籍) 学 位 の 種 類 学 位 ■記 番 号 学位授与年月 日 学位授与の要件 研究科及び専攻 研究指導を受けた大学 学 位 論 文 題 目 審 査 委 員 会 戸 田 武 (愛知県) 博士(農学) 農博甲第338号 平成16年3月15日 学位規則第4条第1項該当 連合農学研究科 生物環境科学専攻 岐阜大学 Identification,Di飴rentiationandDetectionof RbjbctonjbSpeciesU$ingMolecularTechniques (分子生物学的手法を用いた肋ね乃血属菌の 同定､分類､および検出) 主査 岐阜大学 教 授 副査 静岡大学 教 授 副査 信州大学 教.授 副査 岐阜大学 教 授 .朗 二 武 彦 満 慎 正 喜 町 無 政 田 百 露 大 古 論 文 の 内 容 の 要 旨 R鋸zocJo〝ね属菌には凡∫0ね〃fや且c加f朋ねなど多くの種が存在する｡凡∫0ね乃fは種内に おいて多数の菌糸融合群(AG)が存在し､いくつかのAGは複数のサブグループに分かれ る｡今日AGは13に､サブグループは20に上っている｡凡c血油化血は培養形態における 違いから3の変種に分かれる｡二核R旭ocJo乃ねも21のAGからなっており､サブグルー プに分かれるAGも存在する｡これらAG､サブグループおよび変種の中には､広い範囲 の植物に深刻な被害を与える重要な病原菌が含まれている｡従来､本菌は菌糸融合反応や 培養形態､病原性の観察などによって識別されてきたが､これらの方法は非常に手間や時 間を要すとともに､識別結果が不明瞭な場合が生じるなどの問題がある｡一方､近年､菌 類の種問および種内の識別に分子生物学的手法が多く取り入れられ､従来の方法よりも手 間がかからず､結果が明瞭であるなどの利点が明らかになってきた｡ 本研究では､分子生物学的な手法を用いて､創賊紳輔川南属菌のAG､サブグループおよ び変種の識別､新病害の同定､および早期検出法の開発を行った｡それらの結果の概要は 以下のChapterl∼6の通りである｡ Chapterl:RhizoctoniasolanEAOおよびサブグループ間における遺伝的関係をRAPD,ERIC およびREP-PCRで調べた結果､AGl∼10のみではなく､AGl･2内のサブグループを容 易に識別できることが明らかになった｡ Chapter2:フィリピンで見つかったコーヒーに菓腐病を起こす病原菌R.solaniÅGトIDと
他のAGlのサブグループ(AGl-IA､IBおよびIC)を用いて､rDNA-1TS頗域の塩基配列 を比較した｡塩基配列の類縁度は各サブグループ内では.99∼100%だったのに対し､サブ グループ間では9l-95%に下がった｡汀S額域の塩基配列を基に系統樹を作成したところ､ AGl-IDはAGl-IAやAGトICよりもAGl-IBに近縁であることが明らかになった｡ Chapter3:岡山県で栽培されているセイヨウナシにFhiioctoniaI=よるくもの巣症状が見っ かった｡リボゾームDNA-ITS額域のRFLP解析およびRAPD-PCRによる系統解析を行っ たところ､病原菌はR.solaniAGlゐサブグループAGl-IBであることが明らかになった｡ Chapter4:芝草の病害を発生させる二核RhizoctoniaAG-DのサブグループをrDNA-ITS領域 のRFLP解析およびRAPD-PCRによる系統解析を用いて識別し､｢ウィンターパッチ｣菌 と r春はげ症J菌をAG-DのサブグループI(AG-DI)､r象の足跡｣菌をサブグループⅠⅠ (AG-DII)とすることを提唱した｡ Chapter5:ベントグラスに新病害を発生させた病原菌は､培養性質､rDNA-ITS領域のRFLP 解析､およびRAPD-PCRによる系統解析によってR.cininataの変種var.circinataである ことが明らかになった｡本病害を凡c山蕗柑ねVar.Cわ℃血ねによる｢キルキナ一夕パッチ病｣ とすることを提唱した｡ Chapter6:PCR法を応用して､芝草の病害でも重要とされているラージパッチ病の病原菌 (R.solaniAG2･2LP:以下LP)をニホンシバから早期に検出することを試みた｡LPに特 異的なプライマーを作成することによって､LPの早期検出が可能であることを明らかにな った｡また､PCR法を用いることで従来の培養による検出方法よりも正確にまた短時間で
効率よく病原菌を検出できる七とを明らかにになった｡
以上のように､分子生物学的手酷は戯克クeわ月血属菌のAG間､AG内のサブグループ 問および変種間の正確な識別に用いられるとともに､病原菌め早期検出に応用できること を明らかになった｡ 審 査 結 果 の 要 旨 Rhizoctonia属菌には多くの種が存在し､種内でも多数の菌糸融合群(Anastomosis group,以下AG)や変種に分かれる｡また､いくつかのAGは複数のサブグループに分 かれるなど､本菌の分類は複雑ヤある｡これらAO､サブグループおよび変種の中には 植物に深刻な被害を与える重要な病原菌が含まれている｡本菌の識別方法として菌糸融 合反応や培養形態の観察の比較が主に用いられているが､これらの方法は非常に手間を 要すとともに､識別結果が不明瞭な場合が生じるなどの問題がある｡一方､近年､菌類 の識別に分子生物学的手法が多く取り入れられ､従来の形態の違いを主に用いた方法よ りも手間がかからず､結果が明瞭であるなどの利点が明らかになってきた｡ 本論文は､分子生物学的な手法を用いて､朗おcJo〃ぬ属菌のAG､サブグループおよ び変種の識別､新病害の同定､および早期検出法の開発を行ったものである｡ Chapterlにおいて､RAPD,ERICおよびREP-PCRによって､RhizoctoniasoLbniの AG間(AGl∼10)およびAGl･2内のサブグループを容易に識別できることを明らか にした｡-116-Chapter2において､フィリピンで見つかったコーヒ∵に葉腐病を起こすR.sohmiAG l-IDのrDNA-1TS領域の塩基配列が､他のAGlのサブグループ(AGl-1A､IBおよび IC)の塩基配列と類縁度において明確に識別できることを明らかにした｡またITS領域 の塩基配列を基に作成した系統樹において､AGl-IDはAGl-IAやAGl-1CよりもAGトIB に近縁であることを明らかにした｡ Chapter3および5ではRhizoctonia属菌によって発生した新病害を調べた｡rDNA-ITS 領域のRFLP解析およびRAPD-PCRを用いて､岡山県のセイヨウナシくもの巣症状は R.sohmiAGlのサブグループAGl-IBによって､またベントグラスに5∼11月の長期 にかけて発生した新病害は月.dね血協ねVaLぐおぉねによってそれぞれ発生することを明 らかにした｡ Chapter4では芝草の病害を発生させる二核J肋izoctonid AG-Dのサブグループを rDNA-ITS領域のRFLP解析およびRAPD-PCRによって識別し､rウインターパッチJ 菌と｢春はげ症｣菌をAG-DのサブグループⅠ(AG-DI)､｢象の足跡｣菌をサブグルー プⅠⅠ(AG-DII)とすることを提唱した｡ Chapter6ではPCR法を応用して､芝草の病害でも重要とされているラージパッチ病の 病原菌(R.sohmiAG2-2LP:以下LP)をニホンシバから早期に検出することを試み､
LPに特異的なプライマーを作成することによって､LPの早期検出が可能であることを
明らかにした｡また､PCR法を用いることで従来の培養による検出方法よりも正確に また短時間で効率よく病原菌を検出できることを明らかにした｡ 以上､各Ch叩terの結果より､分子生物学的手法による朗おc上川ね属菌のAG間､サブ グループ問および変種間の識別が正確に行われ､病原菌の早期検出に応用できることを 明らかにした｡ 以上について､審査委員全員一致で本論文が岐阜大学大学院連合農学研究科の学位論 文として十分価値のあるものと認めた｡ (基礎となる学術論文) ● TbkeshirTbda,MitsuroHyakumachi,aJldDiIipK.Arora(1999)Geneticre)atednessamOng andwithindi蝕rentRhizoctoniasoLbnEanastomosisgroupsasassessedbyRAPD,ERIC andREP-PCR.MicrobioIogicalResearch154,247-258. ●1払keshiTbda,MitsuroHyakumachi,HaruhisaSuga,K可iKageyama,Akemi恥nakaand Tbshik妃u職ni(1999)Di飴rentiationofRhizoctonidAG-Disolates舟omtur毎rassinto SubgroupsIandIIbased onrDNAandRAPD･aPalyses･EuropeanJournalofP]ant Patholo訂105:835-糾6. ●恥keshiTtxla･JosephM･Mgha]u,AchmadiPriyat?mqjoandMitsuroHyakumachi(2004)
ComparisonofsequcnceonintemaItranscribedspacerreg10nSOfRhizoctoniasohmiAG● トIDandothersubgroupsofAGl･Journa)ofGeneralPlantPathology70(inpress)ThkeshiTbda,TbmoyukiMushika and Mitsuro Hyakumachi(2004)Development of SpeCi丘cPCRprlmerSforthedetectionofRhizoctonidsoLaniAG2-2LP舟omtheleaf
Sheathsexhibitinglarge-patChsymptomonzoysiagrass.FEMSMicrobio]ogyletters(in press)
