PNA (ペプチド核酸) の一塩基変異認識メカニズムとその応用に関する研究

Title PNA (ペプチド核酸) の一塩基変異認識メカニズムとその応_{用に関する研究( 内容の要旨 )} Author(s) 瀧屋, 俊幸 Report No.(Doctoral Degree) 博士(農学) 甲第329号 Issue Date 2004-03-15 Type 博士論文 Version URL http://hdl.handle.net/20.500.12099/2670 ※この資料の著作権は、各資料の著者・学協会・出版社等に帰属します。

氏 名(本個)籍) 学 位 の 種 類 学 位 記 番 号 学位授与年月 日 学位授与の要件 研究科及び専攻 研究指導を受けた大学 学 位 論 文 題 目 審 査 委 員 会 瀧 屋 俊 幸 (青森県) 博士(農学) 農博甲第329号 平成16年3月15日 学位規則第4条第1項該当 連合農学研究科 生物資源科学専攻 岐阜大学 PNA(ペプチド核酸)の一塩基変異認識メカニズムと その応用に関する研究 主査 岐阜大学 教 授 副査 岐阜大学 助教授 副査 静岡大学 教 授 副査 信州大学 助教授 一徹 孝 之 啓 康 博 合 木 原 本 河 鈴 田 橋 論 文 の 内 容 の _{要 旨} S肝s(一塩基多型)はゲノム上の一塩基の違いを意味しており､様々な疾患の原因や薬物 代謝の感受性などヒトを含めあらゆる生物の生命活動に著しい影響を及ぼすため､S肝sの 検出は極めて重要なものとなっている｡従来より､S肝sの検出にDⅣA/DⅣAのこ重鎖形成に よ卑ミスマッチ認識か行われてきたが､このこ重鎖形成法は特異性が低いため､十分な識 別が.できていない｡一方､PyAは新しい構造を持つDⅣA類似化合物で､ペプチド核酸と呼ば 叫ており､DNAにおけるリン酸結合が2-aminoethyl-glycineunitからなるペプチド結合に 置き換えられた構造を有する｡P仙は相補的なD仙やR仙とハイプリダイゼーションでき､ 塩基認識能や相補鎖結合能はD鮎よりも優れており､D仙中の一塩基置換を認識できる特徴 を有している｡この特鱒を利用したSNPsの検出法として､PCRclamping法が開発された｡ 本研究では､S肝sの検出に向けて実用性の高いPCRcla叩ping法の確立を目的に､産業上 また､環境衛生上重要な一塩基変異を有する遺伝子を対象に､その有用性を実証するとと もに､P舶による一塩基変異認識メカニズムを明らかにし､それらの実験結果を基にS肝s 検出用のデザイン設計のための実験指針を提案した. はじめに､食品衛生上極めて重要な食中寺菌である病原大腸菌015†:H7を取り上げた｡ 大腸菌0157:耶は扇劇遺伝子に珊3Gの一塩基変異を有することが知られている｡そこで､ 大腸菌0157:H7(11株)と0157:H7以外の大腸菌(9株)を用い､U通遺伝子をターゲットとし てP伐￠1amping法による大腸菌0157:H7の検出について検討した｡7種類のP仙/プライマー セットを用い､PCRにおける各アニーリング温度について最適条件を求めた｡そして､設 定_した最適条件下でPαclampingを行うことにより､扇dd遺伝子の一塩基変異を容易にか

つ正確に識別できることを実証した｡次に､J4ultiplexPCRclamping法を用いることによ り､大腸菌0157:耶とベロ毒素産生能が識別可能であることを示した｡また､電気泳動前 にPⅣAをハイプリダイズさせるPregel-h9bridizatibn法を導入することにより､ニ塩基ミ スマッチを迅速かつ正確に認識できることを示した･FRET法を用いる融解温度解析と表面 プラズモン共鳴解析により､Pα反応中の各核酸分子の反応割合や分子親和力を謝定し､ これらの解析がPCRclamping法やPregeトhybridizatio臓におけるデザインを設計するう えで貴重な情報を与えることを明らかにした｡ 次に､環填分析分野へのPCRclamping法の導入を試みた｡変異原性物質の変異機措を分 子レベルで解析するのに用いられている鋸脚力e地毛頭血∬血TA9紬臨場伝予め経 基欠失変異が頻発する箇所(ホットスポット)をターゲットに､PCRcla爪ping法の適用を試 みた｡P舶としてこのホットスポット変異に相補的な1餌erを設計し､DⅣA合成を阻音する ようにPCRclampingを行った｡この方法では非ホットスポット変異のみが増幅され､この 増暗産物は直射鮎シークェンス反応の鋳型として用いることができる｡-そのため､⊥っ のチューブでホットスポット変異の識別と非ホットスポット変異の塩基配列の決定ができ るので､効率よくかつ簡便に変異スペクトル解析を行うことができる. 通常､PCRclamping法における最適条件の設定は試行錯誤によるため､多くの時間と労 力を必要としている｡そこで､ヒトのアルコール代謝に関連しているアルデヒド脱水素酵 素Ⅰ頂伝子(此昭)の一塩基変異を用いて､托Rcl叫ping法の最適条件を効率的に設定す るための指針を提案するとともに､その実証実験を行った○ヒトの遺伝子のS肝sは対立遺 伝子があるために3つの遺伝子型になる｡この点を考慮した川Aやプライマーの設計が重安 で､鋳型間でPⅣAの伽値に差が出ない条件の設定が必要であることを提案し､それらを夷 証した｡さらに､定量PCRにより､PNAclampingにおけるPCR産物量を調べたところ､その 呈が大幅に減少していることを認め､PⅣは托R産物が検出できるサイクルを遅らせている ことを明らかにした｡ 次に､PCRclamping法で使用するPⅣAのミスマッチ認識に及ぼす要因について融解温度 解析法にて検討し､PCRclampingの必須条件として80X以上のPNAがターゲット遣伝子にハ イプリダイゼイションしていることが極めて重要であることを明らかにした｡さらに､そ の条件はP舶の伽低から求めることができることをパラメーター解析により検証するとと もに､PⅣAのTm値算出方法を検討し実湘値とよく一致する新しい計算式を提案し､本算出 式で求めたでmを持つP鮎を用いることにより､S肝臓出に際し正確な判定を行うことがで きることを示した｡ 審 査 結 果 の _{要 旨} 平成1昨1月23日1時より､審査委員全員の出席のもとに公開論文発表会が開かれ､約30 分間の発表と釣30分間の質疑応答が行われた｡審査委員等からの質問に対し､的確な応答 がなされ､発表態度も優れているとの高い評価を受けた｡ 近年､ゲノムプロジェクトの成果から､一塩基多型(S肝s)が疾病や薬剤代謝等に関連する ことが明らかになり､臨床応用へと研究が進んでいる○従来よりこのS肝sの検出にシークェ

ー82-ンス解析が用いられてきたがその処理に多大な時間とコストがかかることから､簡便で高精 度の検出法の開発が行われてきた｡その一つにべプチド核酸(Peptidenucleicacid,PNA)を 用いるPCRclamping法がある｡PNAとはDNA類似化合物で､DⅣA相補鎖に対し弓削､結合力や高 い塩基認識力を有することから､ハイプリダイゼーションブロープとして広く用いられつつ ある｡さらに､ミスマッチ塩基に対する認識力も高いことから､托訳clamping法に用いられ ているものであるが､その条件設定に多くの労力と時間がかかるため広く用いられるには至 っていない｡ 本論文は､川Aを用いる托Rclampi喝法に基づいた実用性の高いS肝s検出法の開発を目的 に､産業利用上重要な遺伝子を対象に托Rc血pingの条件設定を行うとともに､これらの情 報を基にS肝s検出用のデザイン設計のための実験指針を提案したものである｡ 以下に示す結果を得ている｡ (1)大腸菌0157:耶のU通達伝子における一塩基変異の検出:食品衛生上極めて重要な大腸菌 0157:耶のロ通達伝子の93育めのヌクレオ塩基GがTに変異しているので､この一塩基変異部 位を迅速に検出するためのmcla叩i喝条件を検討している.川A/プライマーの配列デザイ ン及び托Rcl叩ingの温度条件について詳細に換討し､最適条件を確立した｡この最適条件 下でロ通遺伝子の一櫨基変異を容易かつ正確に検出することに成功した｡さらに､ベロ毒素 産生株のベロ毒素遺伝子を同時に検出するための伽1tiplex托Rclampi喝法の開発にも成功 し､潤cl叩ping法の汎用性を高めた｡しかしながら､最適条件の確立には多くの時間を必 要とするが､この時間の短縮には､敵解温度解析が有効であることを実証した｡ (2)鋸抑】e摘t∫頭血r血TA98の揖嘩伝子におけるホットスポットの検出:環境汚染物 質の遺伝毒性を分子レベルで解析するのに用いられている且t頭血r血TA98の地上漣伝子 中のGCリピート部位は変異原物質により∝弼)脱落が頻繁に起こることが知られている｡そ こで､この∝リピート部位をターゲットに川Aの配列はホットスポット変異部位に､またプ

ライマーは変異部位の下流にた-ルするように設計し､和clampingを行った｡この方故

により､ホットスポット変異株を容易に検出できるとともに､非ホットスポット変異株にお いては変異スペクトル解析用の鋳型として用いることができるため､変異原物質の変異スペ クトル解析を簡便にかつ効率良く行うことができることを実証した｡この成果軋環境衛生 や食品衛生の向上を図るうえで貴重な情報を提供している｡ (3)ヒトラルデヒドデヒドロゲナーゼⅠⅠ遺伝子(此αめにおけるS肝sの検出:ヒト遺伝子には 対立遺伝子が存在しているため､釧Psは3つの遺伝子型になる｡この点を考慮に入れて川A を用いるmclamping法に必要とされる条件を明らかにし､条件を設定するための実験指針 を提示した｡すなわち､ヒト遺伝子のS肝sを検出する場合には鋳型間で川AのTm値に大きな 差が出ないように条件を設定する必要があること並びに必要ならば川Aの塩基長や配列を変 えることによりTm値の均等を図ることがS肝sの検出に極めて有効であることを提案した｡ (4)PNAによる 一塩基変異識別メカニズムとP打Aの新規丁場算出法‥上記したPCRclamping条 件を検討した結果を評価するためにパラメーターを軸定し､実験結果との相関関係を調べ､ 80%以上のPⅣAがターゲット遺伝子にハイプリダイズしていることがPCRclanping法に必須

した｡従来より使用されてきたTm値の算出法は実軸値との誤差が大きかったため実験を行う 際に問題点となっていた｡そこで､実軸値を基にP仙のTm値の新しい算出法を提案した｡と

の算出法を提案できたことは､椚帖を用いる托Rclamping法によるSⅣsの検出の正嘘な判定

を行ううえで貴重な倍率を提供するものである｡ 以上､本論文はm拍を用いるPCRclamping法によるSNPsの検出においで､PNAの一塩基変 異識別のメカニズムを明らかにし､これらの知見を基にP仙を用いたS肝s換出法の実験指針 を提示したもので､学術的に高い内容となっており､またPNAを用いるPCRclamping法の実 用化に向けて貴重な情報を提供したものとして高い評価を受けた｡ 審査委鼻会において､本論文の構成や内容について慎重に審議した結果､藩査委員全長一 敦で本論文が岐阜大学大学院連合農学研究料の学位論文として十分価値のあるものと判定し た｡ [基礎となる学術韓文] 1.T.Takiya,Y.Horie,S.Futo,Y.肋tsumoto,E.Kavai,aJldT.Suzuki:Rapidselectionof

nonhotspotmutantS amOngHisD+revertantSOf _{Sa)moT)e))a typbimuritmTA98in} Amestestbypeptidenucleicabid(PⅣA)-nediatedPCRclamping.

J･Biosci･Bi呵g･,Vol･96,Wo･6,pp･588-590(2003).

2.T.Takiya,S.Futo,軋Tsuna,T.Namimatsu,T.Sakano,E.Kawai,andT.Suzuki:Identific-ation ofsinglebase-Pairmut2.T.Takiya,S.Futo,軋Tsuna,T.Namimatsu,T.Sakano,E.Kawai,andT.Suzuki:Identific-ationon uidigeneof Eschむicbiaco)iO157:H7 by匹ptidenucleicacids(PNA)mediatedPCRclamping.

Biosci.Biotechnol.Biochem.(2004).(inpress)