豆類のαーアミラーゼインヒビターに関する研究

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17-23(1995) 武庫川女子大紀要(自然科学)

豆類の

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ーアミラーゼインヒビターに関する研究

津田小百合，山口

美 子 ， 金 森 正 雄

(武庫川女子大学生活環境学部食物栄養学科)

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Sayuri Sawada

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Y oshiko Yamaguchi and Masao Kanamori Dξp

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Nishinomiya663，

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An αamylase inhibitor of Daifuku bean was purified by water extraction， salting out， DEAE-Sepharose ion-exchange chromatography and affinity chromatography by using α-amylase binding Sepharose 4B column.

Purified inhibitor shown single peak by the method of Disc-P AGE and isoelectric point of inhibitor was pH4.6 by the method of isoelectric focusing.

But the inhibitor was composed of two subunits by the method of SDS-P AGE and the molecular weight of these subunits were 15

，

000 and 18

，

000respectiv~ly.

The sedimentation pattern of inhibitor was complete single peak and the sedimentation constant of it was 3. 5.

The inhibitor has high level of aspartic acid， serine， glutamic acid， valine and threonine

，

and the content of methionine is very low level and especially it does not contain sulfur containg amino acid such as cystein and cystin.

緒

匡司 に関する研究は，報告は多くあるが 3)~25)一次構造， 阻害活性部位，阻害作用機作などに関して構造的視野 多くの食用植物種子中には，プロテアーゼやαーア での研究までに進展していなし¥ ミラーゼなど種々の加水分解酵素作用を阻害する蛋白 ともあれ酵素回害蛋白質が生体防御に役立つことが 性の阻害物質が存在することが知られている1)2) 明らかになり，また，コメのトリプシンインヒピター 現在その生理的意義は明らかでないが，これまでに， が，食餌性アレルギーのアレルゲンとして働き，小麦 ①病原徴生物や害虫から種子を守る防御物質， ②種子 ・大麦のαーアミラーゼインヒビターが， Baker's哨 内在性酵素の調節保護物質，③種子中の貯蔵蛋白質， 息のアレルゲンとなることなども判明してきている. ④別の機能をもっ蛋白質などといった仮説が提示され さきの報告26)では，国内外産の豆類約 30種につい ている. てαーアミラーゼインヒビター活性を調べ，阻害活性 1980年代に入りこれらの阻害物質のうち，殊にト の高かったトラ!豆について，精製と若干の性質を報告 リプシンインヒピターに関しては，諸性質や一次構造 した.本論文では，北海道産のダイフク豆のαーアミ は勿論，阻害作用の活性部位，阻害作用機作などに関 ラーゼインヒビターの分離精製と若干の性質を検討し して，構造的視野で詳細な数多くの研究がなされてき たので報告する. ている.これに対して， αーア ミラーゼインヒビター 司 t 1 i

(津田・山口・金森)

実験材料と実験方法

1.供試料 市販の北海道産ダイフク豆全粒をミノレで粉砕して， 60meshの舗を通したものを試料とした. 2. 酵素及び回害活性測定法 良した著者らの方法33)により行った.即ち， 120ml容 積のカラムを用いpH3.5~pH10 の carrier ampholine (LKB社製)を使用し，試料20mgを40 C で 72時間 1Wの定電力で電気泳動し，終了後カラム内容液を1. 5mlづっ分画し， 280nmでの吸光度， pH及ひ、αーア ミラーゼインヒピター活性を測定した. αーアミラーゼインヒビター活性の測定には，酵素 5. 糖の分析 としてブタ醇臓α一アミラ一ゼ(Sigma社製Ty印pe1ト一A) マルト一スを標準としてDuboisら34刊4的)の方法によつ を，基質としてアミラ一ゼ定量用可溶性澱粉を用いて てフエノ一ル硫酸法で ヨウ素法でで、行つた.即ち， 50mM NaC，l 5mM CaCh，

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.

05 % T rit 0 n X -1 00を 含 む 25mM PIPES (Piperazine-N， N'-bis 2-ethanesulfonic Acid)buffer(pH6.9) 1.4mlに酵素溶液0.2mlを加え， 更に， 0.4mlの2.5%可溶性澱粉溶液を添加して反応 を開始した .3TC， 10分の反応の後， 1.0mlの10% 酢酸を加え反応を停止し，更に反応混合液0.2mlに， 4mlのヨウ素溶液(10%KI溶液に1%ヨウ素を含む溶 液 を ， 要 時200倍に希釈したもの)を混合して， 700nmでの吸光度を測定した. 酵素活性は，酵素を 作用させる前に反応を停止したもの(盲検)と，酵素を 作用させたものの吸光度の差で表示した. 1酵素単位 は，上記反応系において700nmでの吸光度差が， 1 分間の反応時間当たり 0.01になる酵素量と定義した. 結晶αーアミラーゼは， PIPES bufferで400倍に希 釈したものを保存液として，その280nmでの吸光度 から酵素量を算出し，使用時には最終的に14000倍に 希釈して使用した. αーアミラーゼインヒピター活 性は，インヒビタ一存在下での残余酵素活性から評価 し， 1阻害単位は， 1酵素単位を間害するインヒビター 量と定義した. 3.蛋白質の定量 牛血清アルブミンを標準蛋白としてLowry法27)で 行った. 4. 電気泳動 デ ィ ス ク 電 気 泳 動 は Davis28_{)の方 法 に 従 っ て} 7.5%ポリアクリルアミドゲルを用い， SDS電気泳動 は， 15%~17% ポリアクリルアミドゲ‘ルを用いて行っ た.分子量マーカーとしては，ファルマシア社のカリ プレーションキットを用いた. 焦点電気泳動は， Wrigley30)によるポリアクリルア ミドを支持体とするゲ、ル等電点分離法と， Vesterberg ら31)32)のカラムを用いる密度勾配等電点分離法を改 6，分子量の測定 Sephacryl S-200HR によるゲルろ過法35)で分子量 を測定した.標準蛋白質としては，牛血清アルブミン (分子量67，000)，オボアルブミン(分子量43，000)， キモトリプシノーゲンA(分子量25，000)， リボヌク レアーゼA(分子量13，000)を用いた. 7. アミノ酸分析 試料を6N HClで1100 C，24時間及び48時間加水 分解したのち，目立835型 Amino Acid Analayzer を用いて分析した. 8.超遠心分析 目立SCP70H2超遠心機に， ASD形目立シュリー レン光学測定装置をつけた機器を用いて分析した. bufferには， 10mMイミダゾーノレ一塩酸buffer(pH 7.0)を用い， 200

C

，角度600 ，52，000回転で行った.

実験結果及び考察

1. αーアミラーゼインヒピターの単離精製 ダ'イフク豆粉末に10倍量の水を加え，室温で3時 間撹持抽出した後，遠心分離(10，000X g， 30分)し， 上清を抽出液とした.この抽出液に50%飽和となる ように固体硫安を加え，一夜放置の後，遠心分離して 得た沈殿を，少量の蒸留水に溶解して透析チューブを 用いて蒸留水に対して透析した.透析終了後，透析内 液を遠心分離し上清を凍結乾燥した.この凍結乾燥 標品を粗インヒビター画分として，これを20mMイ ミダゾール塩酸buffer(pH7.0)に溶解し，遠心分離後， 同組成bufferで平衡化したDEAE-Sepharoseカラム (2.5 X 50cm)に添加吸着させ， NaCl O~O. 5Mの linear gradientで溶出した結果をFig.1Vこ示す.阻害 活性が認められた画分を集め，再クロマトグラフィー により更に純化した. -

18-豆類のαーアミラーゼインヒピターに関する研究 リーレンパターンは，きれいなsingle peakが得られ， 超遠心分析的には極めて純粋な試料であることが分 かった.また;Fig.5に示したように DAIは，超遠 心分析において濃度依存性による解離，会合もなく， DAIの沈降恒数は 3.5であった. 次 ) ﹀ 恒 一 ﹀ 一 H O ︽ 100 50 2.0 E C O

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ω .D 《 次に，この活性画分をSephacryl S-200HR による ゲ、ルろ過を行った結果をFig.2に示す.回害活性画分 を集め透析後，凍結乾燥して，この標品をDAIとし た.また，フェノール硫酸法による糖の測定結果から， 糖は回害活性画分に高含量を示しており， DAIは糖 蛋白であることが示唆された.

次に， DAIを 0.5MNaClと lmMCaC1zを含む 10mMPIPES buffer(pH6.9)に溶解したのち，遠心 分離し，上清を上述のPIPES buffer(pH6.9)で平衡 化したαーアミラーゼ結合 Sepharose 4Bカラム (1.0 x 15cm)に添加し， affinity chromatographyを 行った.その結果をFig.3に示す. DAI試料を添加 後，しばらく bufferを流し，続いて図の矢印から 50mMNaClと lmMCaChを含む O. 1M酢酸ナトリ ウム一塩酸buffer(pH3.0)に切り替えてαーアミラー ゼインヒピターを溶出した.Fig.3に示したように， 47~50 画分に Single のきれいな peak が得られ，この 画分をDAI-Aとした. 100 0 Number Gelfi1tration by Sephacryl S-200HR absorbance at 280 nm α-amylase inhibitory activity

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50 F r a c t 0 n Fig. 2. 2. 超遠心分析と沈降恒数 次に， DAIについて超遠心分析を行った結果を Fig.4に示す.これは，試料濃度 4mg/mlで最高速度 に到達した後， 45分後に撮影した結果で、あり，シュ 1.8 0.50 E 1.0 c O α3 N O 0_0.5 G100

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DEAE-Sepharose Ion Exchange ChrC>matogram absorbance at 280 nm α-amylase inhibitory activity Nac1 gradient phenol sulfuric acid method at 490 nm

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ー ---ムーーームーーー Fig. 1.

(津田・山口・金森) 3.等電点並びにDisc-PAGE及びSDS-PAGE DAIの等電点を調べるために，焦点電気泳動分析 を行った結果をFig.6 ~こ示す. pH4"'-'6のampholine (LKB社)を用いて， 40 C，電力 lWで， 72時間焦点 電気泳動を行った結果，等電点はpH4.6であった. ここで、得られた純化試料について阻害活性を調べたと ころ，比活性は約40倍に純化されていた.

また， DAIについてDisc-PAGE及びSDS-PAGE を行った結果を，Fig.7及びFig.8に示す. Disc-PAGEでは， ブロードではあるが単一なバン ドを示

した.SDS-PAGEでは， DAI， DAI-A何れも分子

量 15，000と18，000付近にある2つのsubunitから 成る事が分かった.還元剤の有無による電気泳動パ ターンの相違はなく，また，後述のアミノ酸組成分析 結果に於いてシステイ ンの存在が認められないことか ら，これらsubunit聞には-S-S-結合の関与はなく， 水素結合によるものであることが推定される.尚， Powerら12)は，イ ンゲン豆について4つのsubunitの 存在を認め，糖との結合の相違によるとの報告をして いる.また，最近の山口利の白イ ンゲン豆のαーアミ ラーゼインヒビターのsubunit構造に関する詳細な研 究もあり，本研究でのsubunitの数及び構造について は，大変興味のあるしかも生理学的にも重要な問題と 考えられるので目下詳細に検討中である. 10 _{ププー竺1} Cコ . ... hコ w ~ (J1 0> 、寸 αコ co C 圃 岨 コ 20 30 Tube No Fig. 4. Sedimentation Pattern of DAI The protein concentration is 4 mg/ml.The direction of sedimentation is from left to right at 52，000 r.p.m. photograph was taken at 45 min after reaching maximum speed. ... co ∞ 、吋 0> 。1 ~ 。 コ 1¥) Cコ 40 4750 Fig. 3. Affinity Chromatogram of the DAI Affinity chromatography of the inhibitor separated by DEAE-Sepharose chromatography on an α-amylase bound Sepharose 4B column (1.0x 15 cm). The arrow indicates replacement of the eluting solution.

20-Disc-PAGE Pattern of DAI 豆類のαーアミラーゼイ ンヒビターに関 す る 研 究 0 5 A 斗 q u ω 円 以 O ω 2 3 4 5 6 C 0 n c e n t r a t i 0 n 0 f D A I (m g/m 1) Fig.7. Fig. 5. Concentration Dependance of The Sedimentation Coefficient of DAI.

DAI-A

DAI

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94 kDa ~. 67 20

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14.4 43 帽 圃 ， ..30

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的 D 《 Fig. 8. SDS-PAGE Pattern of DAI Fig. 6. Determination of Isoelectric Point of DAI by the method of Isoelectric Focusing. っ absorbance at 280 nm αamylase inhibitory activity pH gradient

-0-0-(津田・山口・金森)

Table1. Amino Acid Composition of α-Amylase Inhibitor

Amino Acid DAI-A(明)

ASP 16.4 THR 8.3 SER 12.7 GLU 8.9 PRO 2.6 GLY 5.0 ALA 5.8 CYS O VAL 8.9 MET 2.0 ILE 5.2 LEU 5.8 TYR 3.8 PHE 5.7 LYS 4.3 HIS 1.5 ARG 3.6 4.アミノ酸組成 DAI-A標品についてアミノ酸分析を行った結果を Table 1に示す.この結果から，アスパラギン酸含量 が特に高く，次いでセリン，パリン，ク。ルタミン酸， スレオニンなども含量が高かった.しかしシステイ ンは検出されなかった.糖含量が非常に高く，あらゆ る点から糖の結合部位は，アスパラギン酸であろうと 推定しているが，糖鎖の種類と結合部位については目 下検討中である. 5. 分子量 Sephacryl S-200HRでのゲルろ過により測定した DAIの分子量は， Fig.9に示されるように49，000で あった.小麦，大麦のαーアミラーゼインヒピターの 分子量は，それぞれ約12，000，20，000と低いが，種 々のインゲン豆9)11)13)18)の分子量と比較するとほぼ類 似していた.

要 約

ダイフグ豆の全粒微粉末試料から，水抽出，硫安塩 析， DEAE-Sepharoseイ オ ン 交 換 ク ロ マ ト グ ラ フィー， Sephacryl S-200HRゲ‘ルろ過， αーアミラー 0.6，

--

て

onuclease A(13.700) • C h Y m 0 t r y p s i n 0 9 e n A (25，伽 0.4Iー 〉 C司 ￥ 一 OvaI b um i n (43，000) DAI Bovine Serum ¥ . 0.21- A I b um i n (67，000) 2 3 4 5 6 7 X104 Molecular Weight Fig. 9. Molecular Weight Estimation of DAI by Gelfi1tration on Sephacryl S-200HR ゼ 結 合Sepharose 4Bアフィニティクロマトグラ フィーにより，蛋白質性のαーアミラーゼインヒピ ターを精製した. 最終精製品は比活性で約40倍であったが，超遠心 分析では，きれいな単一ピークを示し，その沈降恒数 は3.5であった. 本インヒビターは，焦点電気泳動分析から等電点は pH4.6であり， Sephacryl S-200HRを用いたゲルろ 過による分子量測定から分子量は，49，000であった. また， Disc電気泳動では，糖を含むためブロード ではあるが単一バンドを示した.しかし， SDS電気 泳動から分子量約15，000と18，000付近の2つのサブ ユニットに分かれることがわかった.アミノ酸分析結 果からアスパラギン酸が特に高く，次いで、セリン，ノミ リン，グルタミン酸，スレオニン含量も高くシステイ ンの存在は全く認められなかった.

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