Mini Review
Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)
Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol. 9 (2), 78-80
Okochi M
Functional analysis of prefoldin from hyperthermophilic archaea and its application
Department of Biotechnology, School of Engneering, Nagoya University, Furo-cho, Chikusa, Nagoya 464-8603, Japan Received: October 18, 2010 / Accepted: November 22, 2010
Keywords: prefoldin, chaperone, organic solvent tolerance
超好熱性古細菌由来プレフォルディンの機能解析とその利用
極限環境で生育する古細菌のタンパク質は熱安定 性が高いばかりでなく有機溶媒に対する耐性が高い ことが示唆されている。プレフォルディンは、酵母 の細胞質において細胞骨格の形成に必要な遺伝子 GIM (Genes Involved in Microtuble Biogenesis) として 同定され、変性中間状態にある細胞骨格タンパク質 に結合し、それを細胞質シャペロニンへ受け渡す機 能を有することからプレフォルディンと命名されて いる 1, 2, 4, 13, 15)。我々は、プレフォルディンとシャペ ロニンの協調作用を解析するため、古細菌の中でも 特に単純な分子シャペロンシステムを有する超好熱 性古細菌に着目し、 Pyrococcus horikoshii OT3 由来プ
レフォルディンの機能解析を行った。さらに、プレ フォルディンを大腸菌内で発現させて、その有機溶 媒耐性について検討し、微生物を利用した有機溶媒 混合系における有用物質生産への産業利用を目指し た。 超好熱性古細菌 P. horikoshii OT3 のゲノム配列か らプレフォルディンの α、β サブユニットをコード する遺伝子を用いた発現系を構築し、大腸菌で生産 した。プレフォルディン (PhPfd)は、豚心臓由来クエ ン酸合成酵素の熱凝集を阻害する他、変性 GFP のリ フォールディングを阻害し、変性中間状態のタンパ ク質と結合することが示された 11)。さらに、 PhPfd とシャペロニンが直接結合することを免疫沈降及び 表面プラズモン共鳴により解析した。そこで、 Phpfdα および Phpfdβ の各末端欠損体を作成し、これらを再 構成し、基質およびシャペロニンとの結合能や分子 シャペロン活性を測定した。その結果、 PhPfdβ の C 末 6-8 残基が変性タンパク質認識に重要な部位であ り、PhPfdα C 末 8 残基欠損および β C 末 5 残基に、 名古屋大学 大学院工学研究科 大河内 美奈 シャペロニンとの結合に重要な部位が存在すること が示唆された 9,10)。以上のことから、古細菌のプレ フォルディンにおいても、そのコイルドコイルの先 端部分で変性タンパク質と結合し、協調的にシャペ ロン活性を示すことが明らかとなった。 好熱菌由来の蛋白質は熱や有機溶媒等に対する安 定性が高いことから、新しいデバイス材料 3)など、 様々な産業利用が可能であると考えられている。特 に、化学プロセスの一部をバイオプロセスで代替す ることで、省エネルギー、低コストなグリーンバイ オテクノロジーという視点が注目されている。実際 の化学プロセスを考えた場合には、様々な物質を溶 解できるという利点から極性が高くて疎水性が低い 溶媒、すなわち微生物に対して毒性の高いトルエン、 p-キシレン、シクロヘキサンといった有機溶媒存在 下でも活性を示す酵素の探索や微生物の育種が進め られている。高濃度のトルエン中で生育可能な微生 物の存在が報告されて以来、微生物の有機溶媒耐性 機構に関する研究が進められてきた。これまでに、 微生物の有機溶媒耐性機構の一部概要が明らかとな り、有機溶媒排出ポンプの存在、急速な細胞膜修復 機構、細胞膜透過性の低下、細胞膜の硬化、細胞表 面の疎水度の低下などの関与が明らかとなっている 5,12,14)。我々は、微生物の有機溶媒に対する耐性機構 を解析するため、 DNA マイクロアレイにより大腸菌 の有機溶媒添加後の時系列データの情報解析に基づ いた溶媒耐性遺伝子の探索を行ってきた 7,8）。有機溶 媒耐性を獲得した大腸菌の変異株による DNA マイ クロアレイデータは、有機溶媒耐性を誘発する細胞 のプログラムの変化をとらえており、耐性を獲得す る上で必要な遺伝子や代謝経路について知見が得ら 78
Octane:hexane=1:1 Overexpression of prefoldin from
Pyrococcus horikoshii OT3 in E. coli BL21
Control (pET23b) PhPFD (wtα wtβ) PhPFD (tc8α tc8β) PhPFD (tn17α tn10β) 107 106 105 104 103 102 [cells/spot]
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れるものと考えられる。有機溶媒添加により、高発 現した遺伝子群に多くのストレス応答タンパク質が みられたことから、分子シャペロンを利用した耐性 化を検討した。Phpfd 導入株は、オクタン、ヘキサ ン混合溶媒(1:1,v/v)で増殖でき（図）、細胞内の溶媒 取込量は、コントロール株に比べ低く抑えられた。 PhPfd は、変性中間状態にあるタンパク質と結合し 有機溶媒との接触による変性を抑えることで、細胞 内の溶媒取込量を低く保ち、大腸菌の有機溶媒耐性 を向上することが示唆された 6)。これより、超好熱 性古細菌由来プレフォルディンは、幅広いタンパク 質に結合して変性中間状態を保持することができ、 溶媒存在下での微生物を利用した有用物質生産への 展開も期待される。極限環境で生育する微生物群の タンパク質は、産業利用の分子基盤であることから、 今後ますます活用されることが期待される。 引用文献
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n
Prefoldinn
PrefoldinPrefoldiPrefoldi :: ::CoCofactoCofactorCoffactorr of groactor of groupof group IIof group IIup II II chapchcchhaperaperoninapererononiinoninn
図 超好熱性古細菌由来プレフォルディ ンによる有機溶媒耐性の向上
Prefoldin mutants with low chaperone activity
Control (pET23b)
PhPFD (wtα wtβ)
Observation of E. coli cells overexpressing PhPFD in two-phase culture with overlaid octane and hexane (1:1 mixture).
Octane:hexane=1:1
Prefoldin mutants with low chaperone activity
Overexpression of prefoldin from
Pyrococcus horikoshii OT3 in E. coli BL21
Control (pET23b) PhPFD (wtα wtβ) PhPFD (tc8α tc8β) PhPFD (tn17α tn10β) 107 106 105 104 103 102 [cells/spot] Control (pET23b) PhPFD (wtα wtβ)
Observation of E. coli cells overexpressing PhPFD in two-phase culture with overlaid octane and hexane (1:1 mixture).
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