博 士 （ 薬 学 ） 室 本 竜 太
学 位 論 文 題 名
インターフェロン誘導性夕ンパク質Daxx の 転写調節機能および細胞死制御機能の研究
学位論文内容の要旨
序論
Fas death domain‑associated protein(Daxx)
は近年，リンパ球やB 細胞というセルコンテクストにおい て，細 胞増 殖／生存を抑制する機能をもつことが示唆されている．特に，B 細胞発生の初期段階にお ける，
I型 インタ ーフ ェロン
(IFN)に よる
B細胞 生存 抑制機 序においてDaxx が必須の役割をもっとい う報告 があ り，この過程におけるDaxx 機能の制御機構を明らかにすることによって，B 細胞腫瘍や自 己 免 疫 疾 患 の 発 症 機 序 解 明 や 治 療 薬 開 発 に っ な が る 知 見 が 得 ら れ る と 考 え ら れ た ．
多く の報告 はDaxx が 核に局 在する ことを示しており，IFN によるB 前駆細胞のアポトーシスに際し てもDaxx の核局 在が 観察さ れてい る．Daxx は細胞内でpromyelocytic leukemia protein (PML) と相 互 作用 し ， 核 内 の構 造 体
PML‑nuclear body (PML‑NB)に て 共 局在 し て い る．PML およ びPML‑NB はさま ざま なアポ トーシ ス誘導 に関 与する ． PML 欠 損細胞 ではPML‑NB が形成 されず，Daxx は主に
nucleoplasmやヘ テロクロマチン領域に局在が観察され，Daxx のアポトーシス誘導機能が失われる．
このこ とは
PMLが
Daxxの細 胞内， また， 核内で の局 在を制 御しており，この両分子の相互作用がア ポトーシス進行に重要な役割をもつことを示している，
これまでに，Daxx の機能はタンパク‐タンパク相互作用を介した細胞内局在制御によって影響され ることや，リン酸化による制御を受けることが明らかにされてきた，しかしDaXx の機能に対する，DaXx の
SUMO化 修飾 の 意 義 は 不 明で あ っ た ．
SUMOは およ そ
100ア ミノ酸 からな るユ ピキチ ン様小 分子 で あり ，
SUMO化 は ，
SUMOが 標的 タンパ ク質の りジン 残基 に共有 結合す る反応 であ る，SUMO 化 を 受けた 標的 タンパ ク質は 機能変 換を 起こし，この修飾機構は，細胞周期進行や，タンパク質の核移 行 ，相 互 作 用 の 調整 な ど の 細胞 内現象 に関与 するこ とが 知られ ている ．Daxx は
SUMO結合
E2酵素
Ubc9と 相 互作 用 す る ． ま たDaxx はUbc9 お よびSUMO ‐1 と の共 発現に よって
SUMO化を 受け，
630，
631番 目 のり ジ ン 残 基 がSUMO 化部 位 で あ る と 同定 さ れ て い たが ， こ れ ま でに
Daxxの
SUMO化の 生理的意義は明らかとなっていなかった．
以上 の背景 から， 本研究 では ，SUMO 化 部位の 変異体 ，DaxxX ．630/631A （DaXxKA ）分子を用い，
IFN
に よる
B細胞 生存 抑制と の関連 に着目 して機 能解 析を行 った． その結 果， 新たな知見を得た．
鑓果 と考察
まず ，ヒト 胎生 腎癌細 胞株293T 細胞， および マウス プロ
B細胞 株BaF3 細 胞を用 いて細胞内での
Daxxの
SUMO化 を 確 認 し た ，
Ubc9と
SUMO‑1を 野 生 型
Daxxま た は
KA変 異 体 と と もに 過 剰 発 現
さ せ ，Daxx の
SUMO化を ウエス タン ブロッ ト法で 解析し た，こ の結 果，野 生型Daxx ではSUMO 化が
観 察 され た が ，
KA変 異 体 で は 観察 さ れ な か った ， ま た
293T細 胞 で ，Daxx のSUMO 化 がIFN 刺激
に よ っ て 増 強 さ れ ，
IFNシ グ ナ ル 系 と
SUMO化 反 応 の 関 連 が 示 唆 さ れ た ，
次 に ，
Daxxの
SUMO化 と ，
Daxxの 機 能と の 関 連 を 調べた ．まず
BaF3細胞 を用 い，野 生型Daxx
―779 ―
ま た は Daxx KAを 安 定 に 高 発 現 す る 細 胞 株(BaF3 Daxx WT，BaF3 Daxx凡 い を 樹 立 し た ．BaF3 Daxx WT細 胞 で はIFNに よ る 生 存 抑 制 効 果 が 促 進 さ れ た が ， 一 方 でBaF3 Daxx KA細 胞 は ，IFN の 細 胞 生 存 抑 制 シ グ ナ ル を 伝 え な か っ た ． ま た ，Daxxの も つ 転 写 抑 制 機 能 に っ い て 一 過 性 発 現 系 で の レ ポ ー タ ー ア ッ セ イ を 行っ た結 果 ，KA変 異体 で はglucocorticoid receptor (GR)の 転写 機 能に 対 す る 抑 制 機 能 が 失 わ れ て い た ．
KA変 異 体 は さ ら に ， 野 生 型Daxxと 大 き な 違 い が あ る こ と を ， 螢 光 抗 体 法 に よ る 細 胞 内 局 在 解 析 に よ り ， 見 い だ し た ， そ れ は 野 生 型Daxxが 主 に 核 に 局 在 す る こ と に 対 し て ，KA変 異 体 は 大 部 分 細 胞 質 に 局 在 す る こ と で あ る ， 特 筆 す べ き こ と に ，Daxxを 核 か ら 細 胞 質 ヘ 輸 送 す る 分 子CRM1に 対 す る 特 異 的 阻 害 剤 ，leptomycinBを 用 い て 細 胞 を 処 理 す る と ，KA変 異 体 は 核 に 蓄 積 す る こ と が 観察 さ れ た ． ま た ， こ の 処 理 に よ っ てBaF3DaxxKA細 胞 で はIFN刺 激 に よ る 生 存 抑 制 シ グ ナ ル が 伝 達 さ れ る よ う に な っ た ． こ れ ら の 結 果 は ，K630，K．631に 対 す るSUMO化 はDaXxが核 に 貯留 する た めに 必 要 と さ れ る こ と ， ま た ，Daxxが 核へ 蓄 積す る こと がIFNによ るB細胞 の 生存 抑 制に 必 要と され る こと を 示 す も の で あ る ．
こ れ に 加 え て ， 免 疫 沈 降 実 験 に よ る 検 討 か ら ， 野 生 型DaXxと 比 較 し ，KA変 異 体 はPMLと の 相 互 作 用 が 弱 い こ と を 示 し た ， ま た ， 螢 光 抗 体 法 に よ る 細 胞 内 局 在 観 察 か ら ，PMLの 過 剰 発 現 に よっ て KA変 異 体 は 核 に 局 在 を 移 し ， 特 にPML・NBに 局 在 す る こ と が 観 察 さ れ た ． こ の こ と か ら ，Daxxの SUMO化 は ，PMLと の 結 合 を 増 強 す る こ と ， そ し て こ の こ と がDaxxの 核 局 在 性 を 規 定 す る の に 寄 与 す る 可 能 性 が 考 え ら れ た ．
さ ら に ，DaxxISUMO融 合 分 子 を 構 築 し ， 解 析 に 用 い た ． こ の 分 子 をBaF3細 胞 に 一 過 性 に 過 剰 発 現 さ せ た と こ ろ ，BaF3細 胞 の 生 存 率 を 減 少 さ せ る こ と が 観 察 さ れ た こと か ら，DaxxとSUM0の 結合 体 はB細 胞 の 生 存 を 抑 制 す る 機 能 を も つ こ と が 示 唆 さ れ た ． ま た ，SUMO結 合 酵 素Ubc9の ド ミ ナ ン ト ネ ガ テ ィ ブ 変 異 体 の 過 剰 発 現 は 野 生 型DaXXを 核 か ら 細 胞 質 局 在 変 化 さ せ る こ と ，BaF3細 胞 に お け る Ubc9過 剰 発 現 に よ っ て IFNの 生 存 抑 制 作 用 が 増 強 さ れ る こ と が 観 察 さ れ た ． こ れ ら の こ と か ら ，Daxxに 対 す るSUMO化 は ，PMLと の 結 合 を 介 し たDaxx核 局 在 性 の 維 持 に 関 与 す る こ と ， ま た こ れ に 障 害 が 生 じ る と ，IFN刺 激 に よ るB細 胞 の 生 存 抑 制 やGR転 写 活 性 に 対 す る 抑 制 機 能 に 異 常 を き た す こ と が 示 さ れ た ．DaxxとPMLの 相 互 作 用 は ア ポ ト ー シ ス 促 進 に 重 要 であ る と さ れ て い る ． そ れ ゆ え にDaxXKA変 異 体 のPMLと の 結 合 性 低 下 が ， 生 存 抑 制 機 能 に 影 響 を 与 え た と 考 え ら れ る ，
結 語
本 研 究 に お い てDaxxのSUMO化 部 位 で あ るK630，K631の 変 異 体 を 用 い た 解 析 に よ っ て ， こ の 部 位 がB前 駆 細 胞 の 生 存 制 御 に 役 割 を も つ こ と をは じ めて 明 らか に した ．こ の 知見 か ら，Daxxの この 部 位 に 対 す るSUMO化 を 人 為 的 に 制 御 す る こ と が ，B細 胞 腫 瘍 や 自 己 免 疫 に 対 す る 新 た な 治 療 戦 略 と な る 可 能 性 を 示 唆 し た ． ま たDaxxはB細 胞 の み な ら ず ， 骨 髄 巨 核 球 前 駆 細 胞 に 対 す るIFNに よ る 生 存 抑 制 に お い て も 主 要 な 役 割 を 担 う と 報 告 さ れ て い る こ と か ら ，DaxxのSUMO化 の 制 御 は ， IFNを 用 い た 臨 床 治 療 に お け る 問 題 点 の ひ と っ で あ る ， リ ン パ 球 ／ 骨 髄 抑 制 の 副 作 用 を 減 少さ せる こ と に 応 用 で き る 可 能 性 も あ る と 考 え ら れ る ，
― 780−
