ニ ズ ム に つ い て 解 析 し た 。 第 1 章 痤 瘡 患 者 由 来 P. acnes の 薬 剤 感 受 性 調 査 2008 年 か ら 2011 年 に 、皮 膚 科 ク リ ニ ッ ク お よ び 大 学 病 院 の 専 門 外 来 を 受 診 し た 痤 瘡 患 者 か ら 分 離 し た 191 株 の P. acnes に つ い て 薬 剤 感 受 性 を 調 査 し た 。 そ の 結 果 、 ク リ ニ ッ ク に お け る マ ク ロ ラ イ ド 耐 性 率 は 、2008 年 に 27.6%と 高 い 割 合 を 示 し た が 、2009 年 以 降 は 5%前 後 を 推 移 し て い た (Fig. 1)。 2008 年 の 高 い 分 離 率 は 、 大 学 病 院 を 受 診 し て い た 患 者 が 、ク リ ニ ッ ク を 受 診 し た こ と が 原 因 と 示 唆 さ れ た 。 そ こ で 、大 学 病 院 の 外 来 患 者 で 薬 剤 感 受 性 を 調 査 し た と こ ろ 、23.2%と 高 い マ ク ロ ラ イ ド 耐 性 率 を 示 し た 。大 学 病 院 は 、治 療 に 難 渋 し て い る 患 者 が 多 く 受 診 す る た め 、 ク リ ニ ッ ク よ り 高 い 耐 性 率 を 示 し た と 考 え ら れ る 。そ こ で 、抗 菌 薬 使 用 歴 に つ い て 解 析 す る と 、マ ク ロ ラ イ ド 耐 性 株 分 離 患 者 (81.3%) は 、感 受 性 株 分 離 患 者 (31.9%) に 比 べ 、有 意 に マ ク ロ ラ イ ド 使 用 歴 を 有 す る 者 が 多 か っ た (P <0.001)。他 に も 、テ ト ラ サ イ ク リ ン 系 薬 と キ ノ ロ ン 系 薬 に 耐 性 を 示 す P. acnes を 日 本 で 初 め て 分 離 し た 。ま た 、耐 性 因 子 に つ い て 解 析 す る と 、clindamycin の 高 度 耐 性 に 寄 与 す る23S rRNA メ チ ル 化 酵 素 を コ ー ド す る erm(X)保 有 株 、 16S rRNA 遺 伝 子 の G1036C 変 異 を 有 す る テ ト ラ サ イ ク リ ン 耐 性 株 を 日 本 で 初 め て 分 離 し た 。以 上 の 結 果 は 、本 邦 の 痤 瘡 患 者 が 様 々 な 薬 剤 耐 性 P. acnes を 保 菌 し て い る こ と を 明 ら か に し 、 痤 瘡 患 者 に お け る 抗 菌 薬 使 用 と 耐 性 株 保 有 が 相 関 し て い る こ と を 示 し た 。 第 2 章 P. acnes に お け る テ ト ラ サ イ ク リ ン 段 階 的 耐 性 機 構 の 解 析 痤 瘡 治 療 に お い て 、 内 服 テ ト ラ サ イ ク リ ン 系 薬 の minocycline、 doxycycline は 、 組 織 移 行 性 の 良 さ か ら 多 く の 国 や 地 域 で 使 用 さ れ て い る 。第 1 章 で は 、痤 瘡 患 者 よ り 、テ ト ラ サ イ ク リ ン 系 薬 に 低 感 受 性 お よ び 耐 性 を 示 す P. acnes 株 を 分 離 し た 。痤 瘡 治 療 の 標 準 内 服 量 と さ れ る doxycycline を 100 mg/day で 内 服 す る と 、血 中 濃 度 は 約 1.5 μg/ml で あ る と 報 告 さ れ 、 毛 包 内 で は さ ら に 低 い こ と が 推 測 さ れ る 。 そ の た め 、doxycycline の MIC が 1 ~ 2 μg/ml の 低 感 受 性 を 示 す P. acnes 株 に 対 し て は 十 分 な 抗 菌 作 用 を 示 さ な い 可 能 性 が あ る 。 そ こ で 、 本 章 で は 、P. acnes に お け る テ ト ラ サ イ ク リ ン 低 感 受 性 お よ び 耐 性 化 機 構 に つ い て 研 究 し た 。 痤 瘡 患 者 か ら 分 離 さ れ た doxycycline 耐 性 株 (MIC = 16 μg/ml) お よ び 低 感 受 0 5 10 15 20 25 30 2008 2009 2010 2011 Clinic Hospital NT NT NT Year ％ of r es is ta nc e
性 株 (MIC = 1 ~ 2 μg/ml) に 対 し て 、 16S rRNA 遺 伝 子 と ribosomal S3 protein 遺 伝 子 rpsC、S10 protein 遺 伝 子 rpsJ の 塩 基 配 列 を 解 析 し た (Table 1)。そ の 結 果 、耐 性 株 か ら 既 知 の 耐 性 因 子 で あ る 16S rRNA に お け る G1036C 変 異 が 認 め ら れ た 。 rpsJ を 解 析 す る と 、耐 性 と 低 感 受 性 株 で 5 種 の 変 異 が 認 め ら れ 、こ れ ら の 変 異 は コ ー ド さ れ る S10 protein の 57、 58 番 に お け る 4 種 の ア ミ ノ 酸 置 換 を 生 じ さ せ た 。 一 方 、 S3 protein を コ ー ド す る rpsC に 、 全 て の 株 で 変 異 は 認 め ら れ な か っ た 。 そ こ で 、 16S rRNA 遺 伝 子 変 異 および S10 protein の ア ミ ノ 酸 置 換 の テ ト ラ サ イ ク リ ン 耐 性 へ の 関 与 を 確 認 す る た め に 、in vitro で 耐 性 変 異 株 の 作 製 を 行 っ た (Table 1)。 そ の 結 果 、doxycycline に 対 し て MIC が 4 μg/ml を 示 す 低 度 耐 性 変 異 株 が 得 ら れ 、 そ れ ら は 臨 床 株 と 同 様 の 4 種 の S10 protein ア ミ ノ 酸 置 換 を 起 こ す rpsJ の 遺 伝 子 変 異 を 有 し て い た 。 し か し 、16S rRNA お よ び rpsC に 変 異 は 認 め ら れ な か っ た 。 以 上 よ り 、 S10 protein の 57 と 58 番 に お け る ア ミ ノ 酸 置 換 が P. acnes の テ ト ラ サ イ ク リ ン 低 感 受 性 化 に 関 与 す る こ と を 明 ら か に し た 。 さ ら に 、P. acnes は 、 S10 protein ア ミ ノ 酸 置 換 に よ り 低 感 受 性 化 し 、加 え て 16S rRNA 変 異 を 持 つ こ と で 段 階 的 に 耐 性 化 す る こ と が 示 唆 さ れ た 。 第 3 章 P. acnes に お け る キ ノ ロ ン 耐 性 機 構 の 解 析 世 界 と 比 較 し て 、 本 邦 で は 痤 瘡 治 療 に お け る キ ノ ロ ン 系 薬 の 処 方 頻 度 が 著 し く 高 い 。第 1 章 に お け る 研 究 で 、キ ノ ロ ン 耐 性 P. acnes を 本 邦 で 初 め て 分 離 し た 。キ ノ ロ ン 系 薬 の 多 用 は 、さ ら な る 耐 性 菌 の 増 加 を 招 く 恐 れ が あ る 。そ こ で 、本 章 で は 痤 瘡 患 者 か ら 分 離 さ れ た P. acnes の キ ノ ロ ン 感 受 性 を 解 析 し た 。加 え て 、耐 性 機 構 を 解 明 す る た め に 、in vitro で 耐 性 変 異 株 を 作 製 し 、 解 析 を 行 っ た 。 痤 瘡 患 者 由 来 280 株 の P. acnes に つ い て 薬 剤 感 受 性 を 調 査 し た 結 果 、levofloxacin の MIC が 8 ~ 16 μg/ml を 示 す キ ノ ロ ン 低 感 受 性 株 が 8 株 (2.9%) 認 め ら れ た 。 耐 性 因 子 を 特 定 す る た め に 、キ ノ ロ ン 系 薬 の 標 的 部 位 で あ る DNA gyrase 遺 伝 子 (gyrA
Table 1. Tetracycline resistance profiles of clinical isolates and resistant mutants of P. acnes
Strain MIC (μg/ml) Mutations of tetracycline resistance factors Doxycycline Minocycline Tigecycline 16S rRNA S10 protein Clinical isolate
9 16 8 2 G1036C, A1180C Tyr58Asp
11 16 8 2 G1036C, A1180C Tyr58Asp
15b 1 0.25 0.5 Wild Lys57Glu, Tyr58Asp
34b 16 8 2 G1036C, A1180C Tyr58Asp 45 1 1 0.25 Wild Lys57Asn 75b 1 0.25 0.25 Wild Lys57Asn 77b 2 1 0.5 Wild Lys57Met 83b 2 1 0.5 Wild Lys57Met 85b 1 0.5 0.5 Wild Lys57Met Laboratory strain 1-1 4 2 0.5 Wild Lys57Glu 1-2 4 2 0.25 Wild Tyr58Asp 2-2 4 2 0.5 Wild Lys57Met
ATCC11828 0.13 ≤0.06 ≤0.06 Wild Wild
and gyrB) お よ び DNA topoisomerase IV 遺 伝 子 (parC and parE) の 塩 基 配 列 を 解 析
し た 。 そ の 結 果 、DNA gyrase を 構 成 す る サ ブ ユ ニ ッ ト GyrA に ア ミ ノ 酸 置 換
(Ser101Leu ま た は Asp105Gly) を 起 こ す 変 異 が 認 め ら れ た 。そ こ で 、標 的 部 位 変 異 の キ ノ ロ ン 耐 性 へ の 関 与 を 確 認 す る た め に 、耐 性 変 異 株 の 作 製 を 行 っ た (Table 2)。 そ の 結 果 、内 服 で 使 用 さ れ る ciprofloxacin と levofloxacin か ら は 痤 瘡 患 者 由 来 株 と 同 じ ア ミ ノ 酸 置 換 を 有 す る 耐 性 変 異 株 が 得 ら れ た 。一 方 、外 用 薬 で あ る nadifloxacin か ら は 、痤 瘡 患 者 か ら 見 出 さ れ て い な い GyrA の Ser101Trp を 有 す る 耐 性 変 異 株 が 得 ら れ た 。ま た 、更 な る 耐 性 変 異 株 の 分 離 を 行 う と 、GyrA に 2 つ の ア ミ ノ 酸 置 換 、 ま た は GyrA と GyrB に 1 つ ず つ の ア ミ ノ 酸 置 換 を 有 す る 耐 性 変 異 株 が 得 ら れ た 。 一 方 、DNA topoisomerase IV 遺 伝 子 に は 変 異 は 認 め ら れ な か っ た 。以 上 の 結 果 か ら 、 P. acnes は 他 の グ ラ ム 陽 性 菌 と 異 な り 、 キ ノ ロ ン 系 薬 の DNA gyrase へ の 選 択 性 が 高 く 、 薬 剤 に よ っ て 異 な る ア ミ ノ 酸 置 換 を 生 じ る 遺 伝 子 変 異 を 起 こ す こ と が 示 さ れ た 。各 キ ノ ロ ン 系 薬 に お け る 耐 性 変 異 株 出 現 頻 度 を 測 定 す る と 、ciprofloxacin お よ び levofloxacin は nadifloxacin よ り も 高 い 耐 性 変 異 株 出 現 頻 度 を 示 し た 。 耐 性 変 異 株 の 増 殖 能 を 比 較 し た と こ ろ 、nadifloxacin の 選 択 で 得 ら れ た 耐 性 変 異 株 の 増 殖 能 が 、 最 も 低 か っ た 。 以 上 の 結 果 は 、P. acnes の キ ノ ロ ン 耐 性 化 に は 、 内 服 薬 の levofloxacin の 服 用 が 大 き く 関 与 し 、 外 用 薬 の nadifloxacin に よ る 耐 性 変 異 株 は 出 現 し に く い こ と を 強 く 示 唆 し た 。 総 括 本 研 究 で は 、日 本 に お け る 痤 瘡 患 者 由 来 P. acnes の 薬 剤 感 受 性 状 況 を 調 査 し 、薬 剤 耐 性 P. acnes が 増 加 し て い る こ と を 明 ら か に し た 。さ ら に 、分 離 さ れ た 耐 性 菌 の 各 種 抗 菌 薬 耐 性 機 構 お よ び 耐 性 菌 出 現 機 構 を 明 ら か に し 、P. acnes に お け る テ ト ラ サ イ ク リ ン 系 お よ び キ ノ ロ ン 系 薬 の 耐 性 化 に は 、 内 服 薬 が 関 与 し て い る こ と が 示 さ れ た 。薬 剤 耐 性 P. acnes の 増 加 は 、抗 菌 薬 に よ る 除 菌 効 果 を 低 下 さ せ 、痤 瘡 治 療
Table 2. Quinolone susceptibilities and mutations of quinolone-resistant strains
Resistant MIC (μg/ml) DNA gyrase substitutions mutant* Ciprofloxacin Levofloxacin Nadifloxacin Ozenoxacin GyrA GyrB 1st selection CPFX4-1 16 16 8 0.5 Ser101Leu -CPFX4-8 16 4 1 0.13 Asp105Gly -LVFX4-1 16 16 8 0.5 Ser101Leu -NDFX8-1 16 32 8 0.5 Ser101Trp -2nd selection FQ-R1 16 64 32 4 Ser101Leu, Asp105Gly -FQ-R2 16 64 16 1 Ser101Leu Asp476Glu FQ-R3 16 64 32 4 Ser101Leu Ser495Pro FQ-R4 16 64 32 4 Ser101Leu, Asp105Gly -ATCC11828 0.5 0.25 0.25 ≤0.06 -
を 長 期 化 さ せ る 原 因 と な り う る 。本 研 究 結 果 か ら 、耐 性 菌 を 出 現・流 行 さ せ な い た め に は 、痤 瘡 患 部 に 高 濃 度 で 曝 露 で き な い 内 服 抗 菌 薬 の 単 剤 治 療 は 避 け 、外 用 抗 菌 薬 や 殺 菌 作 用 の あ る benzoyl peroxide を 併 用 す る べ き で あ る と 考 察 さ れ る 。 ま た 、 使 用 方 法 が 遵 守 で き な け れ ば 、 外 用 抗 菌 薬 で あ っ て も 耐 性 化 に 関 与 す る 恐 れ が あ る こ と か ら 、 内 服 薬 ・ 外 用 薬 問 わ ず 、 患 者 へ の 指 導 を 十 分 に 行 う こ と が 、P. acnes の 耐 性 化 防 止 お よ び 有 効 な 治 療 を 行 う た め に 最 も 重 要 で あ る と 考 え る 。本 研 究 は 、 耐 性 菌 を 増 加 さ せ な い 痤 瘡 治 療 に お け る 抗 菌 薬 の 適 切 な 選 択 を 行 う 一 助 と な る 情 報 を 示 し て お り 、医 師 、薬 剤 師 だ け で な く 、患 者 も 含 め た 抗 菌 薬 の 適 正 使 用 に 大 き く 貢 献 す る と 考 え る 。 【 研 究 結 果 の 掲 載 】
論文審査の結果の要旨 Propionibacterium acnes（アクネ菌）は、痤瘡（通称：ニキビ）の増悪因子である。そのため、 痤瘡治療においては、P. acnesの除菌を目的として抗菌薬が使用されている。しかし、近年、世 界中で薬剤耐性P. acnesが出現し、痤瘡治療を困難にしている。抗菌薬療法においては、薬剤感 受性を把握して、適正な薬剤を選択することが重要である。ところが、本邦における痤瘡患者由 来P. acnesの薬剤感受性等の情報は非常に少ない。中瀬氏の論文は、痤瘡治療における抗菌薬の 適正使用に貢献することを目的として、痤瘡患者から分離された P. acnes の薬剤感受性を調査 し、さらに、薬剤耐性菌の耐性及び耐性菌出現機構についてまとめたものである。 第 1 章では、2008 年から 2012 年において皮膚科クリニックおよび大学病院の専門外来を受診 した痤瘡患者から分離したP. acnes 233 株の薬剤感受性を調査した。その結果、本邦にも、マ クロライド系・クリンダマイシンに加え、ドキシサイクリンやレボフロキサシンなどの様々な薬 剤耐性P. acnesが流行していることを見いだした。特に、大学病院の痤瘡外来患者はクリニッ クに比べ、マクロライド系及びクリンダマイシン耐性菌の分離率が高かった。さらに、軽症患者 よりも重症患者分離株や薬剤服用歴が長い患者からの分離株では、著しく高い耐性率を示すこと を明らかとした。このことは、抗菌薬使用と薬剤耐性P. acnes の出現が密接に関連しているこ とを示している。また、クリンダマイシンの高度耐性に寄与する 23S rRNA methyltransferase をコードするerm(X)陽性P. acnesを日本で初めて分離した。以上の結果から、薬剤耐性P. acnesの蔓延を防ぐために、P. acnesの薬剤感受性を考慮した抗菌薬の適正使用が重要であるこ とを明らかとした。 第 2 章では、内服痤瘡治療に繁用されるテトラサイクリン系抗菌薬について、第 1 章で分離し たドキシサイクリン耐性及び耐性菌出現の機構を解析した。低感受性と耐性株について、テトラ
サイクリン系薬の作用点である 16S rRNA 遺伝子、ribosomal S3 protein 遺伝子rpsC、S10
protein 遺伝子rpsJの塩基配列を解析した結果、耐性株から 16S rRNA G1036C 変異と S10 protein にアミノ酸置換を生じるrpsJの変異を見いだした。これらの変異とテトラサイクリン 耐性の関連性を明らかにするため、in vitroで耐性変異株の作成を行った。分離した耐性株に おいて、16S rRNA の変異は認められなかったが、臨床株と同様の S10 protein にアミノ酸置換 を起こすrpsJ変異を見いだした。これらの結果は、S10 protein のアミノ酸置換がテトラサイ クリン低感受性化に関与し、次に 16S rRNA 変異を持つことで段階的に耐性化することを強く示 唆していた。 第 3 章では、本邦において汎用されてるキノロン系について、P. acnesのキノロン感受性を 再調査した。さらに、キノロン耐性機構を解明するために、in vitroで耐性変異株を作成し た。その結果、複数のキノロン低感受性株を分離した。これらの株は、キノロン系抗菌薬の標的
部位である DNA gyrase 遺伝子 (gyrA and gyrB) の GyrA にアミノ酸置換を起こす変異を持つこ
とを明かとした。加えて、耐性変異株の作成により、内服で使用されるレボフロキサシンから、
痤瘡患者由来株と同じ GyrA の変異株を分離し、P. acnesにおけるキノロン耐性化には内服薬の
